龍眼多糖樹(shù)脂脫色除蛋白工藝優(yōu)化

藍(lán)海波 溫亞洲 楊光美 李武

摘 要 評(píng)價(jià)了7種樹(shù)脂對(duì)龍眼多糖脫色除蛋白的效果和多糖保留率的影響，篩選弱堿性離子大孔樹(shù)脂D301-R為最優(yōu)樹(shù)脂用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用單因素和Box-Behnken Design響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)D301-R脫色除蛋白工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。確定其最佳工藝條件為：樹(shù)脂用量0.61 g/mL，溫度48 ℃，pH5.0，時(shí)間2.0 h。在此工藝條件下，其脫色率為75.32%，蛋白去除率為91.83%，多糖保留率為93.37%。

關(guān)鍵詞 龍眼；多糖；大孔樹(shù)脂；脫色除蛋白；工藝優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào) R284 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The effects of seven resins on the deproteination and decolorization in purifying longan polysaccharide were studied. The results showed that D301-R was better than the other six resins in protein and color removal. Deproteination and decolorization experiments were carried out by single experiments and the Box-Behnken response surface methodology（RSM）experiment. The optimum technological conditions are as follows： liquid/solid ratio 0.61 g/mL， temperature 48 ℃， pH5.0 and time 2.0 h. Under the conditions the polysaccharide retention， the decolorization rate and the deproteinization rate was 93.37%， 75.32% and 91.83%， respectively.

Key words Longan； Polysaccharides； Macroporous resin； Decoloration and deproteinization； Optimization

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.08.019

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）是我國(guó)南方特色水果，其營(yíng)養(yǎng)豐富，具有良好的保健功效[1]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，龍眼多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)肝臟等多種活性作用[2]。

龍眼果肉含糖量高，不同品種和產(chǎn)地的龍眼干肉多糖含量在16%～25%之間[3-4]。龍眼經(jīng)提取獲得的粗多糖除含有糖類(lèi)物質(zhì)外，還含有少量的蛋白質(zhì)和色素等雜質(zhì)。目前通常采用Sevag法或TCA法對(duì)多糖中的蛋白質(zhì)進(jìn)行去除[5]，再通過(guò)活性炭吸附、H2O2脫色和透析等方法除去其中的色素等雜質(zhì)[6]。這些脫色除蛋白的方法操作較為繁瑣、多糖損失量大，且不適宜食品級(jí)多糖的生產(chǎn)。

大孔樹(shù)脂是一類(lèi)具有多孔骨架結(jié)構(gòu)的交聯(lián)聚合物，可以通過(guò)吸附或離子交換作用對(duì)有機(jī)物進(jìn)行分離、除雜和濃縮[7]。大孔樹(shù)脂已被應(yīng)用于木糖等單糖的生產(chǎn)純化過(guò)程[8-9]。馮思欣等[10]采用D152樹(shù)脂對(duì)板藍(lán)根多糖進(jìn)行脫色，獲得了較高的多糖保留率（95%）。王雪艷[11]比較了5種大孔樹(shù)脂和雙氧水、活性炭對(duì)龍眼多糖的脫色效果，發(fā)現(xiàn)大孔樹(shù)脂XDA-1對(duì)龍眼多糖脫色效果較好，但其多糖保留率較低（81.55%），且未對(duì)其蛋白去除效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。易陽(yáng)等[12]采用大孔樹(shù)脂對(duì)龍眼多糖進(jìn)行脫色除蛋白，取得了較好的效果，其多糖保留率達(dá)到85%。本研究通過(guò)大孔樹(shù)脂的篩選，確定龍眼多糖脫色除蛋白的理想樹(shù)脂，并采用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化確定其最佳脫色除蛋白工藝條件，旨在為龍眼多糖的研究及工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 龍眼干，經(jīng)鮮龍眼（品種“儲(chǔ)良”）去皮、去核65 ℃鼓風(fēng)干燥制得，其含水量為11.4%。

大孔弱堿性離子交換樹(shù)脂（D301-R、D296）、大孔強(qiáng)酸性離子交換樹(shù)脂（D001×7）、大孔強(qiáng)堿性離子交換樹(shù)脂（D280）、大孔吸附樹(shù)脂（D3520、NKA-9、HPD-100）購(gòu)自南開(kāi)大學(xué)樹(shù)脂有限公司。其他常規(guī)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備 RHBASIC-II型磁力攪拌器，德國(guó)IKA公司；FSH-2A型打漿機(jī)，金壇市水北康輝實(shí)驗(yàn)儀器廠；SHZ-A水浴震蕩器，金壇市城西春蘭實(shí)驗(yàn)儀器廠；2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；R502B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 多糖的提取 采用熱水浸提法：龍眼干60 ℃熱水浸泡20 min后打漿，料液比1 ∶ 30，80 ℃水浴浸提2.0 h，200目紗布過(guò)濾，20倍濃縮，離心（5 000 ×g；15 min）去沉淀，得龍眼粗多糖溶液。

1.2.2 分析方法 多糖保留率的測(cè)定：總糖測(cè)定采用苯酚硫酸法[13]。還原糖測(cè)定采用3，5二硝基水楊酸法[14]。多糖含量=總糖含量-還原糖含量。多糖保留率=（MHZ-MHH）/（MQZ-MQH）×100%，式中MQZ和MHZ分別為吸附前后的總糖總量，MQH和MHH分別為吸附前后提取液中還原糖總量。

蛋白去除率的測(cè)定：蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮蘭法測(cè)定[15]。蛋白去除率=（M′Q-M′H）/M′Q×100%，式中M′Q和M′H分別為吸附前后的蛋白質(zhì)含量。

脫色率測(cè)定：多糖溶液調(diào)節(jié)至pH（6.5±0.1），8 000 ×g離心15 min后過(guò)濾，420 nm處測(cè)定OD值。脫色率=（OD前-OD后）/OD前×100%，式中OD前和OD后分別為脫色前后溶液的光密度值。

1.2.3 大孔樹(shù)脂脫色除蛋白效果評(píng)價(jià) 分別對(duì)大孔樹(shù)脂吸附前后的脫色率、多糖保留率、蛋白去除率3項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行加權(quán)求和，其權(quán)重系數(shù)分別為0.3、0.4和0.3。依據(jù)公式：u=0.3x+0.4y+0.3z計(jì)算評(píng)分。

式中x表示脫色率（%），y為多糖保留率（%），z為蛋白質(zhì)去除率（%）。

1.2.4 大孔樹(shù)脂的篩選 分別精密稱(chēng)取20.0 g樹(shù)脂于100 mL三角瓶中，加入粗多糖溶液40 mL，于40 ℃，120 r/min 搖床中吸附2.0 h，200目紗布過(guò)濾并用蒸餾水洗滌樹(shù)脂，合并濾液，定容至50 mL，分別測(cè)定吸附后的多糖保留率、脫色率和蛋白質(zhì)去除率，參照1.2.3對(duì)大孔樹(shù)脂脫色除蛋白效果進(jìn)行評(píng)分。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 考察了樹(shù)脂用量（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/mL）、吸附溫度（30、40、50、60、70 ℃）、吸附時(shí)間（1.0、2.0、3.0、4.0 h）及pH值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0）對(duì)樹(shù)脂脫色除蛋白效果的影響。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化 依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用Design-Expert 8.0軟件，設(shè)計(jì)Box-Behnken Design響應(yīng)面試驗(yàn)，利用響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，確定樹(shù)脂最佳吸附條件。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)定見(jiàn)表1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

樹(shù)脂篩選及單因素試驗(yàn)顯著性分析均采用SPSS11.5軟件進(jìn)行。響應(yīng)面試驗(yàn)中方差分析采用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹(shù)脂的篩選

龍眼多糖提取液中的色素與蛋白質(zhì)是其多糖分離純化過(guò)程中的主要雜質(zhì)，色素與蛋白質(zhì)的含量過(guò)高，會(huì)降低多糖在下一步凝膠色譜分離純化的效果。由表2可知，樹(shù)脂D301-R、D001×7和D280的脫色效果明顯優(yōu)于其他4種樹(shù)脂（p<0.05）。在蛋白質(zhì)去除方面，D280（38.61%）和HPD-100A（36.73%）的去除率較低，D001×7、D3520、D296、NKA-9樹(shù)脂的蛋白去除率在60%左右，D301-R的蛋白質(zhì)去除率最高，為75.56%（p<0.05），且其多糖保留率也相對(duì)較高（86.74%）。

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選確定D301-R為龍眼粗多糖提取液脫色除蛋白的最優(yōu)樹(shù)脂，進(jìn)行后續(xù)單因素與響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 吸附時(shí)間對(duì)脫色除蛋白效果的影響 從圖1可見(jiàn)，吸附時(shí)間在1.0～4.0 h時(shí)，隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)，脫色率和多糖保留率逐漸升高，但是多糖保留率逐步下降。當(dāng)時(shí)間大于2.0 h后，樹(shù)脂對(duì)色素和蛋白質(zhì)的去除效果不再顯著增加，但對(duì)多糖的吸附明顯增多。綜合上述因素，確定D301-R脫色除蛋白的吸附時(shí)間為2.0 h。

2.2.2 pH值對(duì)脫色除蛋白效果的影響 從圖2可見(jiàn)，多糖溶液的pH值能影響樹(shù)脂對(duì)蛋白質(zhì)和色素的吸附，在pH3.0～7.0范圍內(nèi)，隨著pH值的降低蛋白去除率和脫色率逐漸升高，但是較低pH值會(huì)導(dǎo)致多糖降解，導(dǎo)致多糖保留率降低。綜合上述因素，確定D301-R脫色除蛋白的pH值為5.0。

2.2.3 樹(shù)脂用量對(duì)脫色除蛋白效果的影響 從圖3可見(jiàn)，在一定范圍內(nèi)，蛋白去除率和脫色率隨樹(shù)脂用量的增加而提高。當(dāng)樹(shù)脂用量超過(guò)0.6 g/mL時(shí)，蛋白質(zhì)和色素的去除率不再顯著提高，反而會(huì)增加多糖的吸附。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定樹(shù)脂的用量為0.6 g/mL。

2.2.4 溫度對(duì)脫色除蛋白效果的影響 從圖4可見(jiàn)，吸附溫度在30～70 ℃時(shí)，隨著吸附溫度的升高，多糖保留率和蛋白去除率升高，當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)其蛋白去除率不再顯著增加。脫色率隨溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)溫度大于50 ℃時(shí)，樹(shù)脂對(duì)色素的吸附效果下降，綜合以上因素，確定D301-R脫色除蛋白溫度為50 ℃。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1 Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)結(jié)果與分析

通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)溫度、pH值和樹(shù)脂用量3個(gè)因素分析得到以下實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果（見(jiàn)表3）。

2.3.2 回歸模型的建立與分析 利用Design-Expert 8.0 軟件對(duì)2.3.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到x（脫色率）、y（多糖保留率）、z（蛋白去除率）為響應(yīng)值的回歸方程：

x=75.56+1.19A-0.16B+0.31C-0.020AB+0.038AC-0.095BC-6.42A2-2.99B2-1.85C2

y=93.51-2.13A-0.13B-0.49C-0.36AB-0.003AC+0.11BC-1.92A2-2.52B2-1.11C2

z=91.55+0.78A-0.25B+0.41C-0.68AB-0.49AC-1.24BC-2.01A2-2.02B2-2.06C2

上述回歸方程的方差分析如表4所示，由表中ANOVA分析結(jié)果可知，3個(gè)模型的p<0.001（極顯著），失擬項(xiàng)p>0.05（不顯著），表明方程擬合性好，實(shí)驗(yàn)誤差小。模型x，y，z的相關(guān)系數(shù)R2分別為0.998 3、0.993 3和0.995 4，表明模型的線(xiàn)性較好。x模型的AdjR2=0.996 1，表明該模型擬合度較好，0.35%的變異系數(shù)（CV）表明該模型重現(xiàn)性好。y和z模型中，變異系數(shù)分別為0.5%和1.1%，表明這2個(gè)模型擬合度和重現(xiàn)性好。

綜合以上分析，表明3個(gè)模型擬合度和重現(xiàn)性較好，可以較好的反映D301-R樹(shù)脂吸附因素與多糖保留率和脫色除蛋白效果的關(guān)系。

從各因素的顯著性水平可知，對(duì)脫色率的影響次序分別為：溫度>pH值>樹(shù)脂用量；對(duì)多糖保留率的影響次序?yàn)椋簻囟?樹(shù)脂用量>pH值，3個(gè)因素均顯著（p<0.05）影響蛋白保留率。3個(gè)因素的二次項(xiàng)A2、B2和C2對(duì)脫色率、多糖保留率和蛋白去除率均有顯著影響（p<0.001）。溫度和pH值的交互項(xiàng)AB顯著影響多糖保留率（p<0.05）和蛋白去除率（p<0.001），對(duì)脫色率無(wú)顯著影響（p>0.05）。樹(shù)脂用量與溫度和pH值的交互項(xiàng)AC、BC對(duì)蛋白去除率的影響顯著（p<0.01），對(duì)脫色率和蛋白去除率無(wú)顯著影響（p>0.05）。

2.3.3 交互作用響應(yīng)面分析

（1）脫色率交互作用響應(yīng)面分析。由溫度和pH值對(duì)脫色率影響的分析（圖5）可以看出響應(yīng)面比較陡峭，等高線(xiàn)接近圓形，表明溫度和pH值對(duì)脫色率的影響顯著，它們的交互作用不顯著。圖6溫度和樹(shù)脂用量對(duì)脫色率的影響顯著，二者的交互作用顯著。當(dāng)溫度在48～52 ℃之間時(shí)，脫色率隨著樹(shù)脂用量的變化顯著提高，能達(dá)到最大值。圖7可以看出pH值和樹(shù)脂用量對(duì)脫色率影響不顯著，二者交互作用不顯著。

（2）多糖保留率交互作用響應(yīng)面分析。由圖8可以看出，溫度和pH值對(duì)多糖保留率有顯著影響，溫度在45 ℃左右時(shí)，多糖保留率能夠達(dá)到最大值。由等高線(xiàn)可以看出，二者的交互作用不顯著，pH值在4.5～5.5，溫度在45 ℃左右時(shí)多糖保留率較高，能達(dá)到最大值。由圖9可以看出溫度和樹(shù)脂用量對(duì)多糖保留率影響不顯著，較低溫度可以減少樹(shù)脂對(duì)多糖的吸附，達(dá)到較高的多糖保留率，二者交互作用不顯著。由圖10可以看出，溫度和樹(shù)脂用量對(duì)多糖保留率影響顯著，但二者的交互作用不顯著。

（3）蛋白去除率交互作用響應(yīng)面分析。由圖11可以看出，溫度和pH值對(duì)蛋白去除率影響顯著，二者交互作用顯著，吸附溫度高于55 ℃或低于45 ℃都不利于蛋白質(zhì)的去除，pH值接近5.0時(shí)蛋白去除效果較好。由圖12可以看出，溫度和樹(shù)脂用量對(duì)蛋白去除率影響顯著，二者交互作用明顯。圖13表明，pH值和樹(shù)脂用量對(duì)蛋白去除率影響顯著，二者交互作用顯著，綜合分析，3個(gè)因素對(duì)蛋白去除率影響明顯，每?jī)蓚€(gè)因素交互作用顯著，由等高線(xiàn)可以看出，pH值和樹(shù)脂用量之間的交互作用更顯著。

2.4 D301-R脫色除蛋白最佳工藝條件

通過(guò)Design-Expert 8.0軟件分析，確定D301-R對(duì)龍眼多糖脫色除蛋白的最佳工藝條件為：溫度47.81 ℃、pH4.96、樹(shù)脂用量0.61 g/mL，此條件下脫色率為75.55%，多糖保留率為93.53%，蛋白去除率為91.55%。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)選取溫度48 ℃，pH5.0，樹(shù)脂用量0.61 g/mL進(jìn)行。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)脫色率為（75.32±0.64）%，多糖保留率為（93.37±0.86）%，蛋白去除率為（91.83±0.79）%，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果合理可靠。

3 討論與結(jié)論

脫色除蛋白是植物多糖純化的步驟之一，相對(duì)于傳統(tǒng)的Sevag法除蛋白、H2O2脫色等方法，大孔樹(shù)脂具有操作便捷、成本低、效率高等優(yōu)點(diǎn)[16-19]。目前，主要采用離子交換和吸附樹(shù)脂對(duì)植物多糖進(jìn)行脫色除蛋白。離子交換樹(shù)脂主要通過(guò)離子鍵與帶電荷的色素、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)物質(zhì)進(jìn)行結(jié)合，達(dá)到除雜目的。吸附樹(shù)脂主要通過(guò)分子內(nèi)的疏水基相互作用進(jìn)行吸附除去雜質(zhì)。針對(duì)不同來(lái)源的的多糖，不同類(lèi)型樹(shù)脂的除雜效果不同。

本研究結(jié)果顯示，7種樹(shù)脂對(duì)龍眼粗多糖溶液具有不同的除雜效果，D301-R樹(shù)脂具有相對(duì)較好的除蛋白脫色素效果。而同為陰離子交換樹(shù)脂的D296除雜效果則較差，這一結(jié)果可能是由于兩者的功能基團(tuán)差異造成的。D301-R的功能基團(tuán)為-N（CH3）2屬于弱堿性，而D296的功能基團(tuán)為-N+（CH3）3屬于強(qiáng)堿性，在弱酸性條件下龍眼多糖主要為弱極性酸性多糖和中性多糖，所以D301-R具有更佳的脫色除蛋白效果和較低的多糖吸附量。研究顯示，樹(shù)脂孔徑大小是影響其除雜效果的重要因素之一，當(dāng)樹(shù)脂孔徑大小與溶液中色素大小適應(yīng)時(shí)，更易于色素等被吸附達(dá)到除雜目的[20]。筆者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，孔徑為85～90 μm的D3520和HPD-100A的除雜效果顯著優(yōu)于NKA-9樹(shù)脂（孔徑為155～165 μm），這可能是由于龍眼多糖溶液中的色素主要為小分子色素造成的。

本研究結(jié)果顯示，D301-R樹(shù)脂對(duì)龍眼多糖具有較好脫色除蛋白效果，經(jīng)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，確定其最佳工藝條件為溫度48 ℃，pH5.0，樹(shù)脂用量0.61 g/mL，吸附時(shí)間2.0 h。在此工藝條件下，龍眼多糖的脫色率為75.32%，蛋白去除率為91.83%，多糖保留率為93.37%，其蛋白去除率、多糖保留率較文獻(xiàn)報(bào)道[11-12]有顯著提高。同時(shí)研究顯示，在脫色除蛋白過(guò)程中，樹(shù)脂可能會(huì)吸附部分糖-蛋白、糖-色素等絡(luò)合物，造成多糖的損失。對(duì)龍眼多糖脫色除蛋白工藝還需進(jìn)一步研究。

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