利用電激共轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化橡膠樹懸浮細(xì)胞的初步研究

程漢 肖成江 祝建順 安澤偉 黃華孫

摘 要 利用電激轉(zhuǎn)化法對橡膠樹懸浮細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)化，初步確定卡那霉素的篩選濃度、共轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)條件。通過電激共轉(zhuǎn)化法將NPTII、GUS、EGFP和HbCBF1基因成功導(dǎo)入到橡膠樹懸浮細(xì)胞并整合到基因組中。通過卡那霉素抗性篩選、GFP熒光觀察和PCR驗(yàn)證等方法，確定外源DNA片段轉(zhuǎn)化成功。共篩選得到95個(gè)抗性愈傷組織，其中9個(gè)愈傷組織經(jīng)過PCR驗(yàn)證確定整合有外源DNA片段，1個(gè)愈傷組織共轉(zhuǎn)化有NPTII和GUS基因。此結(jié)果表明電激共轉(zhuǎn)化法可成功應(yīng)用于橡膠樹懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)化操作。

關(guān)鍵詞 橡膠樹；電激轉(zhuǎn)化；共轉(zhuǎn)化；HbCBF1

中圖分類號(hào) S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The rubber tree suspension cells were co-transformed using electroporation method. The co-transforming conditions and kanamycin concentration were determined. The NPTII， GUS， eGFP， and HbCBF1 genes were successfully transferred into suspension cells and integrated into genomes in rubber tree. The transgenes were validated by kanamycin resistance selection， GFP fluorescence detection and PCR amplification methods. Totally 95 kanamycin resistant calli were obtained， in which 9 harbored exogenous DNA fragments basing on the PCR validaton results. One callus was co-transformed with NPTII and GUS genes. These results demonstrated that electroporation co-transform method could be successfully applied in genetic manipulation in rubber tree.

Key words Rubber tree；Electroporation；Co-transform；HbCBF1

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.08.010

天然橡膠是重要的戰(zhàn)略物資，巴西橡膠樹作為最主要的天然橡膠來源，在中國熱區(qū)大量種植，既保障了中國的戰(zhàn)略物資供給，也為熱區(qū)農(nóng)民提供了可靠的經(jīng)濟(jì)收入來源。橡膠樹是多年生的高大喬木，異花授粉。其品種選育主要采用常規(guī)育種方法，父母本材料均來源于魏克漢品系及其衍生的無性系。由于育種周期長、遺傳基礎(chǔ)狹窄、多基因雜合等因素，使得橡膠樹的傳統(tǒng)雜交育種及雜種優(yōu)勢的利用受到限制。因此，探索育種新技術(shù)、縮短育種周期、提高育種效率、克服傳統(tǒng)育種的缺陷具有重要理論及現(xiàn)實(shí)意義。近些年，轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)迅速發(fā)展，該技術(shù)能迅速導(dǎo)入新性狀、加快育種周期，并已在水稻、大豆、玉米和棉花等作物中得到大量應(yīng)用[1-4]。

橡膠樹對低溫極其敏感，寒害嚴(yán)重影響橡膠單產(chǎn)及橡膠樹的經(jīng)濟(jì)壽命。低溫寒害是限制中國天然橡膠種植的主要環(huán)境限制因子。長期以來，抗寒育種始終是中國橡膠樹育種的一個(gè)主要研究方向。近幾年，隨著橡膠樹抗寒分子機(jī)理研究的進(jìn)展，獲得了一些與橡膠樹抗寒密切相關(guān)的基因，如HbCBF1等[5-8]。這些基因?yàn)橄鹉z樹抗寒轉(zhuǎn)基因育種提供了可供選擇的基因來源。然而，由于橡膠樹轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究相對滯后，使得這些基因的應(yīng)用受到嚴(yán)重限制。在橡膠樹中，由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)尚未完善，使得轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)的應(yīng)用嚴(yán)重滯后。在已經(jīng)發(fā)表的橡膠樹轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究中，多數(shù)是以花藥為外植體，誘導(dǎo)愈傷組織，再通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，或基因槍法將外源基因片段導(dǎo)入細(xì)胞中[9-12]。由于橡膠樹每年花期時(shí)間短，使得轉(zhuǎn)基因所需的外植體來源受到季節(jié)性限制。利用橡膠樹細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物不僅可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量細(xì)胞，還可不受季節(jié)性限制開展研究。利用懸浮體系進(jìn)行電激轉(zhuǎn)基因研究，一方面能以大量體細(xì)胞群體為基礎(chǔ)，高效進(jìn)行轉(zhuǎn)化研究；另一方面，根據(jù)前期研究結(jié)果，電激轉(zhuǎn)化能取得比農(nóng)桿菌等其他方法更高的轉(zhuǎn)化效率[13]，且能在短時(shí)間內(nèi)得到大量的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，為獲得陽性轉(zhuǎn)化植株提供更多起始材料。電激轉(zhuǎn)移法是利用電脈沖使細(xì)胞膜發(fā)生瞬時(shí)的可逆穿孔，從而使游離的外源基因穿過細(xì)胞膜而進(jìn)入到細(xì)胞中去，電穿孔操作對受體細(xì)胞產(chǎn)生的擾動(dòng)很小，從而保持了活細(xì)胞的正常生理?xiàng)l件。電穿孔的脈沖參數(shù)和過程容易控制，強(qiáng)度適當(dāng)?shù)碾娒}沖不會(huì)使DNA和受體細(xì)胞受到任何損害。因此，電激轉(zhuǎn)移是一種很好的基因轉(zhuǎn)移方法，操作簡單，轉(zhuǎn)化效率高，沒有細(xì)胞種屬限制。細(xì)胞電穿孔技術(shù)對各種類型的細(xì)胞具有高效率、低毒性、普遍性和可控制性的優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛用于細(xì)胞工程和基因工程方面。在植物中也大量開展了電激基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的研究，如大白菜[14]、水稻[15]、玉米[16]等。本研究以橡膠樹細(xì)胞懸浮系為受體材料，研究電激共轉(zhuǎn)化法介導(dǎo)轉(zhuǎn)化抗寒基因HBCBF1，探討培育抗寒轉(zhuǎn)基因橡膠樹的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)以中國橡膠樹雜交種B1（Hevea brasiliensis×H. nitida）細(xì)胞懸浮系為材料[13]。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)參照肖成江等[13]的方法，繼代周期為7～9 d。愈傷組織誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)選取生長狀態(tài)良好的橡膠樹懸浮細(xì)胞，接種至易碎胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)易碎胚性愈傷組織，30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。易碎胚性愈傷組織誘導(dǎo)率=易碎胚性愈傷組織數(shù)/懸浮細(xì)胞團(tuán)數(shù)×100%。

1.2.2 質(zhì)粒表達(dá)框的構(gòu)建 EGFP、GUS、NPTII基因分別來自pCAMBIA1302載體和pCAMBIA2301載體，通過PCR法從載體上擴(kuò)增，HbCBF1基因來自本實(shí)驗(yàn)室克隆。將EGFP、GUS、HbCBF1和NPTII基因的編碼區(qū)通過亞克隆分別插入至pBI221載體的XbaI和SacI酶切位點(diǎn)間，形成如圖1所示的表達(dá)框結(jié)構(gòu)。線性表達(dá)框的制備采用PCR法，根據(jù)載體序列在表達(dá)框兩側(cè)設(shè)計(jì)可擴(kuò)增完整表達(dá)框的上下游引物：上游P1： 5′-TGTAAAACGACGGCCC

AGT-3′，下游P2： 5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′。

將質(zhì)粒稀釋500倍后作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物取1 μL經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并經(jīng)過酒精沉淀后回收備用。

1.2.3 電激法轉(zhuǎn)化 電激轉(zhuǎn)化操作根據(jù)肖成江等[13]的方法進(jìn)行。按照1 ∶ 1 ∶ 1等摩爾比例加入線性化的EGFP、NPTII和HbCBF1基因片段進(jìn)行電激轉(zhuǎn)化。電激后將細(xì)胞靜置培養(yǎng)24 h，小心地移去上清液，用MS液體培養(yǎng)基洗滌3次。將洗滌后的細(xì)胞在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（附加卡那霉素）中進(jìn)行培養(yǎng)，并誘導(dǎo)其愈傷組織形成。

1.2.4 瞬時(shí)表達(dá)率和細(xì)胞成活率的測定 將恢復(fù)培養(yǎng)后的細(xì)胞懸液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于熒光顯微鏡（Leica）下進(jìn)行細(xì)胞熒光觀察。EGFP在藍(lán)光激發(fā)下呈現(xiàn)綠色熒光。隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野懸浮細(xì)胞，記下呈現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)，獨(dú)立重復(fù)3次試驗(yàn)，按下式計(jì)算瞬時(shí)表達(dá)率：

細(xì)胞成活率測定加入500 μL 0.01% FDA（熒光素雙醋酸酯），室溫下靜置5～10 min后，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。有活力的細(xì)胞在藍(lán)光激發(fā)下呈現(xiàn)綠色熒光。隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野懸浮細(xì)胞，記下呈現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)，獨(dú)立重復(fù)3次試驗(yàn)，按下式計(jì)算細(xì)胞成活率。

1.2.5 卡那霉素選擇壓對轉(zhuǎn)化的影響 采用平鋪法對電激后的B1懸浮細(xì)胞進(jìn)行選擇。將懸浮細(xì)胞均勻平鋪在含卡那霉素的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基M2中進(jìn)行培養(yǎng)?？敲顾貪舛确謩e為：0、50、75、100、125、200 mg/L。培養(yǎng)4～6周后，觀察并統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織的形成情況，以確定適宜的卡那霉素篩選濃度。

1.2.6 轉(zhuǎn)化愈傷組織的鑒定 （1）轉(zhuǎn)化愈傷組織EGFP熒光觀察：具有卡那霉素抗性的愈傷組織在培養(yǎng)基上能夠正常生長，且呈現(xiàn)鮮黃色，而非抗性愈傷組織則褐化死去。電激轉(zhuǎn)化12 h后，用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)化愈傷組織中EGFP的表達(dá)，使用I3濾光片組進(jìn)行觀察，激發(fā)波長范圍為450～490 nm，檢測波長為515 nm。

（2）轉(zhuǎn)化愈傷組織的PCR法鑒定：電激轉(zhuǎn)化懸浮細(xì)胞，并經(jīng)過2個(gè)月培養(yǎng)后，提取形成的抗性愈傷組織基因組DNA，通過PCR法鑒定外源DNA片段是否成功整合進(jìn)入橡膠樹基因組中。分別使以下引物對進(jìn)行擴(kuò)增：HbCBF1基因引物：5′-ATCAAAGGCCATGGAGTCAA-3′和5′- TCCTAATGTCCTTTGCTTCTCTG-3′；NPTII基因引物：5′- AAAGCACGAGGAAGCGGTCAGC-3′和5′-TGGAGAGGACACGCTGAAATCACC-3′；GUS基因引物：5′-GAAATTCCATACCTGTTCACCGACGACG-3′和5′-TGCTGCGTTTCGATGCGGTCAC-3′。擴(kuò)增HbCBF1基因的引物有一條來自CaMV 35S啟動(dòng)子序列，以避免擴(kuò)增出內(nèi)源HbCBF1基因。最后PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)框的構(gòu)建

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將EGFP、GUS、NPTII和HbCBF1基因分別克隆至目標(biāo)載體中，構(gòu)建出如圖1所示的表達(dá)框。

構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)過大量抽提純化、PCR擴(kuò)增，得到DNA片段分別為線性EGFP、GUS、NPTII和HbCBF1基因表達(dá)框，將核酸共沉劑或PCR產(chǎn)物回收純化，得到相應(yīng)的片段沉淀，經(jīng)1.0%瓊脂膠鑒定純化片段并測定線性表達(dá)框各DNA的濃度（圖2）。

2.2 抗性選擇壓濃度的確定

首先測試懸浮細(xì)胞在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中平鋪培養(yǎng)的生長情況。在不添加卡那霉素的培養(yǎng)基中，懸浮細(xì)胞生長旺盛，誘導(dǎo)愈傷組織率接近100%，平鋪1個(gè)月后，培養(yǎng)基中長滿黃豆般大小的小愈傷組織。在分別添加了50、75、100、125 mg/L卡那霉素的培養(yǎng)基中，經(jīng)過2個(gè)月的培養(yǎng)，胚性細(xì)胞團(tuán)形成率分別為53.24%、31.48%、11.87%、2.14%（圖3和圖4）。

采用平鋪法進(jìn)行抗生素的抗性篩選，有利于轉(zhuǎn)化細(xì)胞充分接觸培養(yǎng)基，以確保其生長。同時(shí)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，愈傷組織對卡那霉素的耐受能力逐漸增強(qiáng)。因此，本研究確定在胚性愈傷組織誘導(dǎo)及增殖階段卡那霉素的篩選濃度均為100 mg/L。

2.3 EGFP基因在轉(zhuǎn)化愈傷組織中的表達(dá)情況

電激共轉(zhuǎn)化并經(jīng)過15 d繼續(xù)培養(yǎng)后，將米粒大小的愈傷組織放在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)部分小愈傷組織能發(fā)出綠色熒光（圖5），初步判斷為轉(zhuǎn)化的愈傷組織。

2.4 PCR鑒定轉(zhuǎn)化愈傷組織

經(jīng)過選擇培養(yǎng)存活下來的愈傷組織為潛在的轉(zhuǎn)化愈傷組織（圖6）。提取95個(gè)愈傷組織樣品的基因組DNA，經(jīng)過PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性的愈傷組織有9個(gè)。其中帶有HbCBF1基因表達(dá)框的愈傷組織有4個(gè)，帶有NPTII基因表達(dá)框的愈傷組織有4個(gè)，帶有GUS基因表達(dá)框的愈傷組織有2個(gè)。只有1個(gè)愈傷組織同時(shí)整合有NPTII和GUS基因（圖7）。從共轉(zhuǎn)化的效率來看，共同轉(zhuǎn)化的愈傷組織數(shù)量較少，原因可能有2個(gè)：一是卡那霉素的篩選效率不高。在95個(gè)抗性愈傷組織中，僅有4個(gè)檢測出NPTII基因，大大降低了陽性檢出率。二是陽性樣本數(shù)量偏少，導(dǎo)致共轉(zhuǎn)化檢出率偏低，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。

3 討論與結(jié)論

本研究中，利用電激轉(zhuǎn)化法對橡膠樹懸浮細(xì)胞進(jìn)行初步研究，成功將HbCBF1等基因的線性表達(dá)框整合進(jìn)入橡膠樹基因組中，并得到了卡那霉素抗性愈傷組織，這表明電激轉(zhuǎn)化方法能成功應(yīng)用于橡膠樹的遺傳轉(zhuǎn)化，并且具有巨大的潛在應(yīng)用前景。本研究還通過共轉(zhuǎn)化策略將標(biāo)記基因和目的基因同時(shí)整合到目標(biāo)基因組中。在實(shí)驗(yàn)中，以1 ∶ 1 ∶ 1混合含有目的基因和含有標(biāo)記基因的DNA片段進(jìn)行共轉(zhuǎn)化，共篩選獲得轉(zhuǎn)化愈傷組織為95個(gè)。經(jīng)過PCR鑒定，其中9個(gè)愈傷組織帶有外源DNA片段，僅有1個(gè)愈傷組織共轉(zhuǎn)化了NPTII和GUS基因，轉(zhuǎn)化效率相對低下。筆者分析其中原因：一是檢測成功轉(zhuǎn)化的樣品數(shù)量太少，不能代表真正的比例；二是使用卡那霉素進(jìn)行篩選效率不高，在95個(gè)卡那霉素抗性的愈傷組織中，僅有4個(gè)檢測到整合有NPTII基因片段。因此，下一步工作需要進(jìn)一步提高卡那霉素的篩選濃度，或者更換更高效率的潮霉素進(jìn)行篩選，以提高篩選的效率。利用懸浮細(xì)胞基數(shù)大的特點(diǎn)，高效篩選出轉(zhuǎn)化陽性愈傷組織。在此基礎(chǔ)上，再進(jìn)一步優(yōu)化共轉(zhuǎn)化比例，以完善橡膠樹懸浮細(xì)胞電激轉(zhuǎn)化體系。

近年來，中國在利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化橡膠樹愈傷組織方面取得了一些突破性進(jìn)展[9-10，17]，但總的來看，橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化效率還很低下，操作相對困難。一方面限制了該技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用，另一方面，也制約了橡膠樹轉(zhuǎn)基因育種研究，使得許多克隆和鑒定到的基因無法進(jìn)一步在橡膠樹中進(jìn)行驗(yàn)證和應(yīng)用。本研究初步探索了電激轉(zhuǎn)化法在橡膠樹懸浮細(xì)胞中的應(yīng)用，獲得了一些整合有外源DNA片段的抗性愈傷組織，也成功篩選到了共轉(zhuǎn)化愈傷組織。這表明在橡膠樹中利用電激共轉(zhuǎn)化進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作的可行性，為該方法的進(jìn)一步應(yīng)用奠定了初步基礎(chǔ)。

同之前的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化愈傷組織策略相比[9，11-12，18]，本研究中使用的電激轉(zhuǎn)化技術(shù)未使用農(nóng)桿菌和T-DNA載體，僅僅通過線性表達(dá)框即可將目標(biāo)基因整合到基因組中，使得載體構(gòu)建變得十分簡單。另外，由于未使用農(nóng)桿菌，電激轉(zhuǎn)化法無需使用抑制農(nóng)桿菌的抗生素，降低了實(shí)驗(yàn)成本，也沒有農(nóng)桿菌污染的風(fēng)險(xiǎn)，提高了實(shí)驗(yàn)的成功率。同農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化相比，電激轉(zhuǎn)化的受體材料是懸浮細(xì)胞系，具有群體大的特點(diǎn)。因此，即使橡膠樹離體組織的轉(zhuǎn)化率十分低下，仍然能獲得相當(dāng)多的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，大大提高了獲得轉(zhuǎn)基因愈傷組織的可能性。然而，目前，電激轉(zhuǎn)化法還存在著不足之處，主要是共轉(zhuǎn)化頻率過低，使得多基因轉(zhuǎn)化的成功率大大降低。另外，電激轉(zhuǎn)化必須使用懸浮細(xì)胞系，使得轉(zhuǎn)基因操作的前期準(zhǔn)備工作變得復(fù)雜，這些制約因素還需要在后續(xù)研究中加以克服和改進(jìn)。

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