楊桃果實(shí)過(guò)氧化物酶特性及其抑制條件研究

詹嘉紅

摘 要 以愈創(chuàng)木酚為底物，采用分光光度法對(duì)楊桃果實(shí)過(guò)氧化物酶（POD）的酶學(xué)特性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，楊桃POD反應(yīng)時(shí)間不宜超過(guò)3.5 min，最適pH為 5.6，最適溫度為30 ℃，100 ℃處理 30 s 后 POD 活性完全喪失。POD催化的酶促褐變反應(yīng)動(dòng)力學(xué)符合米氏方程，動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km=1.68×10-2 mol/L，Vmax=15.267 U/min，相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程為v=15.267[S]/（0.0168+[S]）（U/min）。抑制劑對(duì) POD活性的抑制效果從大到小依次為抗壞血酸>L-半胱氨酸>亞硫酸氫鈉>檸檬酸。本研究可為楊桃保鮮貯藏和深加工過(guò)程中的酶促褐變控制提供理論參考。

關(guān)鍵詞 楊桃；過(guò)氧化物酶；酶學(xué)特性；抑制劑

中圖分類號(hào) TS201.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract With spectrophotometry method and based on substrate of guaiacol， the enzymatic characteristics of peroxidase（POD） from Averrhoa carambola fruit were investigated. The results showed that the reaction time for POD should not exceed 3.5 min， the optimum pH and temperature of POD were 5.6 and 30 ℃， respectively. The POD activity was completely inactivated when it was incubated at 100 ℃ for 30 s. The reaction kinetic of enzymatic browning was accordant with Michaelis-Menten equation. The Km， Vmax and kinetic Equation were 1.68×10-2 mol/L，15.267 U/min and v=15.267[S]/（0.0168+[S]）（U/min）， respectively. Four inhibitors demonstrated different effects on POD activity，and their inhibitory capacity was decreased in the order：ascorbic acid>L-cysteine>NaHSO3> citric acid. This research aimed to provide reference and theoretical basis to protect Averrhoa carambola fruit from enzymatic browning in the course of processing and storage.

Key words Averrhoa carambola；Peroxidase；Enzymatic characteristics；Inhibitor

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.08.008

楊桃（Averrhoa carambola Linn.），又稱陽(yáng)桃、五斂子、洋桃等，屬酢醬草科五斂子屬，是一種熱帶亞熱帶常綠喬木或灌木果樹(shù)，其果實(shí)也是中國(guó)南方重要的熱帶水果之一。楊桃果脆汁多、甜酸可口，其深加工產(chǎn)品有楊桃飲料、楊桃罐頭、楊桃蜜餞等。楊桃果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，其富含的多酚物質(zhì)具有抗腫瘤、抗氧化和抗動(dòng)脈硬化等多種生理功能[1]。然而，楊桃鮮果在貯藏、運(yùn)輸和加工過(guò)程中極易產(chǎn)生酶促褐變現(xiàn)象，嚴(yán)重影響其食用品質(zhì)和商品價(jià)值。前人的研究表明，水果中的多酚氧化酶（POD）和過(guò)氧化物酶（POD）參與下的酶促反應(yīng)是果實(shí)褐變的主要原因：果實(shí)中的酚類化合物在PPO和POD的催化條件下進(jìn)行氧化還原反應(yīng)而醌式化，再通過(guò)一系列的反應(yīng)而聚合成黑色素[2]，從而導(dǎo)致果實(shí)褐變，如橄欖[3]、荔枝[4]、枇杷[5]等的褐變均與自身存在的這些酚酶密切相關(guān)。目前有關(guān)楊桃的褐變與其PPO的關(guān)系研究已有一些報(bào)道[6-7]，但針對(duì)楊桃POD活性及其與褐變關(guān)系的研究則鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)楊桃鮮果中POD 的部分酶學(xué)特性進(jìn)行探討，以期為楊桃保鮮貯藏和深加工過(guò)程中的酶促褐變控制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為紅種甜楊桃，購(gòu)自當(dāng)?shù)毓麍?chǎng)。愈創(chuàng)木酚、30%過(guò)氧化氫、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、亞硫酸氫鈉、抗壞血酸、L-半胱氨酸等為分析純。

FA2004電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司天平儀器廠）；UV2100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（尤尼柯（上海）儀器有限公司）；JJ-2組織搗碎勻漿機(jī)（富華儀器有限公司）；GL-16G-Ⅱ型高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所）；PHS-2C型精密酸度計(jì)（上海雷磁儀器廠）等。

1.2 方法

1.2.1 楊桃POD粗酶液的提取 稱取楊桃果肉25 g，先加適量4 ℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖溶液（0.05 mol/L，pH5.8），低溫研磨至勻漿，并定容至50 mL，放于4 ℃下的冰箱里浸提30 min后，將勻漿液以10 000 r/min轉(zhuǎn)速在4 ℃下離心20 min，上清液即為酶的粗提液，低溫保存用于酶活性分析。

1.2.2 楊桃POD活性測(cè)定 參考李合生[8]的愈創(chuàng)木酚法，略有改進(jìn)。吸取 0.05 mol/L pH5.8磷酸緩沖液2.25 mL，加入0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚2.0 mL，加入2% H2O2 0.25 mL，再加入0.5 mL粗酶液后迅速搖勻啟動(dòng)反應(yīng)，于室溫下測(cè)定波長(zhǎng)470 nm的OD值，對(duì)照以緩沖液代替酶液。

1.2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)POD活性的影響 按照1.2.2 的測(cè)定方法，總反應(yīng)體系分別反應(yīng) 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 min，測(cè)其吸光值。

1.2.4 pH對(duì)POD活性的影響 配制pH值分別為2.2、2.6、3.0、3.4、3.8、4.2、4.6、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.2、6.6、7.0、7.4、8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液。按1.2.2的方法，在室溫下測(cè)定不同pH值下的吸光值。

1.2.5 反應(yīng)溫度對(duì)POD活性的影響 按1.2.2方法建立反應(yīng)體系，分別于5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃下預(yù)先保溫10 min，再加入0.5 mL粗酶液，振蕩后在原溫度條件下繼續(xù)保溫3 min，然后測(cè)定吸光值

1.2.6 POD的熱穩(wěn)定性研究 取等量酶液若干份，在100 ℃水浴中分別熱燙5、10、15、20、25、30 s，取出后迅速冷卻，按1.2.2的方法測(cè)定不同熱燙時(shí)間的吸光值。

1.2.7 底物濃度對(duì)POD活性的影響 分別配制濃度為0.005、0.01、0.02 、0.05、0.1、0.15 mol/L的愈創(chuàng)木酚溶液為底物，按照 1.2.2 的測(cè)定方法，測(cè)其在最適溫度、最適pH值及酶液濃度保持固定條件下的吸光值，計(jì)算酶活性。以每分鐘吸光度變化0.01為1個(gè)酶活性單位（以U/min表示）。

1.2.8 抑制劑對(duì)POD活性的影響 探討抗壞血酸（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L）、亞硫酸氫鈉（0、20、40、60、80、100 mmol/L）、L-半胱氨酸（0、2、4、6、8、10 mmol/L）和檸檬酸（0、50、150、250、350、450 mmol/L）等抑制劑對(duì)POD活性的抑制作用，按1.2.2的方法，向反應(yīng)體系分別加入各種濃度的抑制劑0.5 mL，緩沖液的量相應(yīng)減少0.5 mL，在室溫下測(cè)定不同抑制劑作用下的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均取3次重復(fù)平均值，采用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊桃POD反應(yīng)進(jìn)程曲線

由圖1可見(jiàn)，在反應(yīng)初期，即3.5 min內(nèi)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，OD值（即產(chǎn)物生成量）幾乎成直線上升，即在這一時(shí)間段，酶促反應(yīng)速率基本保持不變。因此，本實(shí)驗(yàn)確定酶促反應(yīng)時(shí)間以不超過(guò)3.5 min為宜。

2.2 pH對(duì)楊桃POD活性的影響

由圖2可見(jiàn)，該酶在pH值為5.6時(shí)，酶活性最高，表明該酶的最適pH值為5.6，當(dāng)pH值為2.2和8.0時(shí)，POD活性分別為最大時(shí)的29.7%和55.9%。

2.3 溫度對(duì)楊桃POD活性的影響

由圖3可以看出，溫度與楊桃POD活性的關(guān)系曲線為較典型的鐘形曲線，在30 ℃以下酶活性隨著溫度的升高而升高，當(dāng)溫度達(dá)到30 ℃時(shí)，吸光度出現(xiàn)峰值，酶活性達(dá)到最高，當(dāng)溫度超過(guò)30 ℃，酶活性隨著溫度的升高而降低。當(dāng)溫度達(dá)到65 ℃時(shí)，POD殘留的相對(duì)活性降至10.3%，而在5 ℃時(shí)，POD的相對(duì)活性是27.0%。因此，30 ℃為該酶的最適溫度。

2.4 楊桃POD熱穩(wěn)定性

由圖4可知，隨著處理時(shí)間的增加，POD活性迅速下降。當(dāng)處理20 s后，殘存活性僅剩下38.1%，而處理30 s后，酶活性已很微弱。

2.5 底物濃度對(duì)楊桃POD活性的影響

由圖5可以看出，在底物濃度較低時(shí)（<0.01 mol/L），反應(yīng)速率與底物濃度的關(guān)系幾乎呈斜率大于零的線性關(guān)系；隨著底物濃度增大，反應(yīng)速率依然升高，但由于酶的數(shù)量有限，反應(yīng)速率與底物濃度的關(guān)系不再是線性關(guān)系；當(dāng)?shù)孜餄舛认喈?dāng)高時(shí)（>0.1 mol/L），酶促反應(yīng)速率與底物濃度無(wú)關(guān)，反應(yīng)達(dá)到最大反應(yīng)速率[9]。

由Lineweaver-Burk方程1/v=Km/Vmax×1/[S]+1/Vmax，作出1/v對(duì)1/[S]的雙倒數(shù)圖（圖6），得直線方程y=0.001 1x + 0.065 5，根據(jù)直線斜率和截矩求得該反應(yīng)的米氏常數(shù)Km=1.68×10-2 mol/L，最大反應(yīng)速率Vmax=15.267 U/min，相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程為v=15.267[S]/（0.016 8+[S]）（U/min），其中擬合直線相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999，可見(jiàn)楊桃POD的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)符合米氏方程。

2.6 抑制劑對(duì)楊桃POD活性的影響

由圖7可見(jiàn)，隨著抗壞血酸濃度增加抑制效果明顯增強(qiáng)，當(dāng)抗壞血酸濃度為1.0 mmol/L時(shí)，POD受抑制程度為66.8%；當(dāng)濃度為2.5 mmol/L時(shí)，酶活性幾乎被完全抑制。

由圖8可知，當(dāng)亞硫酸氫鈉濃度小于40 mmol/L時(shí)，POD酶活性被抑制的效果較弱，當(dāng)濃度大于40 mmol/L時(shí)，隨著亞硫酸氫鈉濃度增加抑制效果顯著提高，當(dāng)濃度為100 mmol/L，酶活性受抑制程度高達(dá)95.0%。

由圖9可見(jiàn)，當(dāng)L-半胱氨酸濃度小于6 mmol/L時(shí)，隨著濃度的升高，其抑制效應(yīng)逐漸增強(qiáng)。當(dāng)濃度從6 mmol/L增加到10 mmol/L時(shí)，抑制作用增強(qiáng)不明顯，酶活性受抑制程度僅從79.0%增至87.5%。

圖10顯示，楊桃中POD 活性抑制需要使用較高濃度檸檬酸溶液，當(dāng)檸檬酸濃度為150 mmol/L時(shí)，其受抑制程度為45.2%；當(dāng)濃度為450 mmol/L時(shí)，其受抑制程度達(dá)到91.9%。

根據(jù)上述研究結(jié)果，以較低的抑制劑濃度呈現(xiàn)的最佳抑制效應(yīng)分析，抗壞血酸的抑制效果最佳，其次是L-半胱氨酸，再次是亞硫酸氫鈉，檸檬酸抑制效果最差。

3 討論與結(jié)論

POD廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)，是一類以血紅素為輔基的氧化還原酶，在 H2O2存在下，它能催化酚類、類黃酮的氧化和聚合，從而導(dǎo)致組織褐變。POD活性受pH、溫度、底物濃度、抑制劑等因素的影響。楊桃果實(shí)POD有較廣泛的pH范圍，最適pH值為5.6，與甘薯葉[10]的最適pH一致，略高于枇杷果肉[11]POD的最適pH（5.0），在pH2.2～8.0之間，楊桃果實(shí)POD活性保持在30%以上，說(shuō)明耐受范圍較廣。此外，本研究結(jié)果表明，楊桃果實(shí)POD的最適溫度為30 ℃，與香蕉果皮[12]、草莓[13]的最適溫度一致，略低于雪蓮果[14]和香蕉果實(shí)[15]的最適溫度（均為35 ℃）。POD是一種非常耐熱的酶，在果蔬加工中常被用作熱處理是否充分的指標(biāo)[16]。大蕉的POD具有良好的熱穩(wěn)定性，100 ℃下加熱 30 min殘存活性還保持18.28%[17]，龍眼果肉中POD在100 ℃水浴處理7 min即完全失活[18]，相比之下楊桃果實(shí)POD對(duì)熱敏感，經(jīng)沸水浴30 s處理酶活則被鈍化。對(duì)于酶促褐變來(lái)說(shuō)，在適宜溫度下，反應(yīng)酶活越強(qiáng)，則酶促褐變程度越高，因此在實(shí)際操作中，可通過(guò)短時(shí)間高溫滅酶來(lái)抑制楊桃果實(shí)酶促褐變。

在POD活性測(cè)定系統(tǒng)中，以愈創(chuàng)木酚為底物的楊桃果實(shí)POD的Km值為1.68×10-2 mol/L，這比梅州金柚[19]POD的Km（8.74 mmol/L）值大，但比富士蘋果[20]POD的Km（129.09 mmol/L）值小很多，米氏常數(shù)（Km）是酶的一個(gè)特征性常數(shù)，Km值可近似地表示酶與底物之間的親和程度。說(shuō)明楊桃果實(shí)POD氧化酚類物質(zhì)的能力比梅州金柚POD的氧化能力弱，但比富士蘋果POD的氧化能力強(qiáng)很多。

抗壞血酸、亞硫酸氫鈉、L-半胱氨酸和檸檬酸均能有效抑制楊桃果實(shí)POD活性，但抗壞血酸抑制楊桃果實(shí)POD活性的效果最佳，當(dāng)抗壞血酸濃度為2.5 mmol/L時(shí)，酶活性幾乎為零。雖然抗壞血酸抑制效果好、安全性高，但若添加量過(guò)大時(shí)，也易引起非酶褐變。目前，在果蔬防褐處理中，提倡多種抑制劑結(jié)合使用以提高抗褐變效果。因此，在單因素抑制劑研究的基礎(chǔ)上，對(duì)不同抑制劑多因素協(xié)同作用的抑制效應(yīng)今后還有待進(jìn)一步深入研究。

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