兩種化學(xué)發(fā)光法測(cè)定乙肝五項(xiàng)性能評(píng)估

王　軍，劉妮妮，趙　權(quán)，葉琳琳，劉　婧，劉玉琳，徐　菲

兩種化學(xué)發(fā)光法測(cè)定乙肝五項(xiàng)性能評(píng)估

王軍，劉妮妮，趙權(quán)，葉琳琳，劉婧，劉玉琳，徐菲

［關(guān)鍵詞］光激化學(xué)發(fā)光法；乙型肝炎；定量分析

光激化學(xué)發(fā)光法（light initiated chemiluminescence assay，LICA）是以納米級(jí)高分子微粒為載體的免疫化學(xué)發(fā)光技術(shù)，本研究對(duì)該方法與化學(xué)發(fā)光微粒免疫分析法（chemiluminescent microparticle immunoassay，CMIA）檢測(cè)乙型肝炎病毒（HBV）感染的血清學(xué)標(biāo)志物的結(jié)果做比較，以分析該方法檢測(cè)性能與CMIA的符合程度及對(duì)臨床診斷的影響。

1　材料和方法

1.1儀器、試劑及檢測(cè)樣本收集1015例疑似HBV感染者靜脈血，分離血清待測(cè)；收集乙肝五項(xiàng)同時(shí)為陰性（經(jīng)CMIA篩查）的一個(gè)血清盤。光激化學(xué)發(fā)光法的儀器（LiCA HT高通量免疫分析儀和LiCA SP全自動(dòng)移液器）和試劑，均為上海博陽(yáng)生物科技有限公司產(chǎn)品；化學(xué)發(fā)光微粒免疫分析法的儀器（ARCHITECT i2000SR）和試劑，均為美國(guó)雅培公司產(chǎn)品；相關(guān)試劑批號(hào)如下：

雅培試劑批號(hào)：HBsAg（26057LF00）；HBsAb （27235LF00）；HBeAg（24065LI00）；HBeAb（24512L I00）；HBcAb（22362LI00）。

博陽(yáng)試劑批號(hào)：HBsAg（A1019）；HBsAb（A1020）；HBeAg（A1021）；HBeAb（A1021）；HBcAb（A1021）。

1.2結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)（1）雅培結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：HBsAg＞0.05 IU/mL；HBsAb＞10 mIU/mL；HBeAg＞1 S/CO；HBeAb＜1 S/CO；HBcAb＞1 S/CO。（2）博陽(yáng)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：HBsAg＞0.2 ng/ml；HBsAb＞10 mIU/ml；HBeAg＞1 PEIU/ml；HBeAb＞2 PEIU/ml；HBcAb＞5.3 PEIU/ml。

1.3評(píng)價(jià)方法

1.3.1精密度根據(jù)EP5-A文件中關(guān)于實(shí)驗(yàn)方案的要求，應(yīng)對(duì)標(biāo)本每天做2批實(shí)驗(yàn)，批間相隔的時(shí)間不少于2 h，每批對(duì)樣品進(jìn)行雙份測(cè)定，20 d后得到80個(gè)結(jié)果，共40對(duì)。每次檢測(cè)前，分別取出HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的陰性血清盤、低值質(zhì)控品QL和高值質(zhì)控品QH，室溫放置30 min后再上機(jī)檢測(cè)。按EP5-A文件的要求對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算CV值。

1.3.2回收率測(cè)定分別取上海博陽(yáng)生物科技有限公司提供的HBsAg、HBsAb 6點(diǎn)定標(biāo)液各200 μl，按濃度梯度分別加入5個(gè)試管中，0濃度管為空白，不加定標(biāo)液；隨機(jī)取一份HBsAg陽(yáng)性血清和HBsAb陽(yáng)性血清，通過(guò)光激化學(xué)發(fā)光法分別測(cè)其濃度，然后將兩份血清各200 μl分別加入已知濃度的試管中，每管重復(fù)測(cè)量2次，取其均值，以各濃度點(diǎn)的實(shí)測(cè)平均值占其理論期望值的百分?jǐn)?shù)計(jì)算其回收率。

1.3.3檢測(cè)結(jié)果比較通過(guò)兩種方法對(duì)1015例HBV感染者臨床樣本的平行檢測(cè)，以雅培CMIA為參考對(duì)象來(lái)評(píng)估博陽(yáng)LICA方法檢測(cè)的乙型肝炎病毒5項(xiàng)血清學(xué)指標(biāo)與CMIA檢測(cè)結(jié)果的符合率。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，曲線擬合采用3次樣條曲線擬合，對(duì)兩種方法檢測(cè)結(jié)果差異的顯著性比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1工作曲線對(duì)不同檢測(cè)項(xiàng)，取同一批號(hào)不同靶值的定標(biāo)品連續(xù)檢測(cè)5 d，2次/d。曲線擬合采用3次樣條曲線擬合，根據(jù)各自的均值繪制工作曲線，r2＝0.998。

2.2試驗(yàn)性能評(píng)價(jià)

2.2.1精密度檢測(cè)LICA五項(xiàng)血清學(xué)標(biāo)志精密度結(jié)果見表1、2。

表1　LICA乙肝五項(xiàng)低值質(zhì)控品精密度

表2　LICA乙肝五項(xiàng)高值質(zhì)控品精密度

2.2.2回收率測(cè)定不同濃度HBsAg、HBsAb的回收率見表3、4，HBsAg平均回收率為100.16% （96.81%～102.69%）；HBsAb平均回收率為99.7% （95.85%～104.55%）。

表3　不同濃度的HBsAg回收率

表4　不同濃度的HBsAb回收率

2.2.3兩種方法檢測(cè)結(jié)果比較見表5。

表5　LICA與CMIA檢測(cè)HBV感染5項(xiàng)血清學(xué)標(biāo)志結(jié)果比較

3　討　論

LICA檢測(cè)原理源于90年代問(wèn)世的單線態(tài)氧分子能量傳遞發(fā)光免疫分析技術(shù)［2-4］，該技術(shù)采用了納米級(jí)顆粒，大大增加了生物分子的包被面積，同時(shí)借助鏈霉親和素-生物素放大系統(tǒng)，使單位體積反應(yīng)體系中含有更高濃度的生物分子，為實(shí)現(xiàn)超高敏感性，減少樣本和試劑用量奠定了基礎(chǔ)。另外，這種納米顆粒在液相中保持穩(wěn)定的懸浮狀態(tài)，并借助于結(jié)合則發(fā)光原理，實(shí)現(xiàn)了均相免清洗檢測(cè)，和其他化學(xué)發(fā)光法相比具有如下特點(diǎn)：（1）LICA反應(yīng)體系為均相反應(yīng)，傳統(tǒng)免疫檢測(cè)技術(shù)多為非均相反應(yīng)，非均相反應(yīng)具有反應(yīng)不充分、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、反應(yīng)體系溫度均一性差的缺點(diǎn)，而LICA整個(gè)反應(yīng)是在均相中進(jìn)行的，均相具有反應(yīng)充分、反應(yīng)時(shí)間短、反應(yīng)體系溫度均一性好的優(yōu)點(diǎn)，顯示出該方法具有很高的精密度；（2）LICA另一個(gè)特點(diǎn)是免清洗，由于在均相中反應(yīng)，加上其獨(dú)特的檢測(cè)原理結(jié)合則發(fā)光，所以檢測(cè)過(guò)程無(wú)須進(jìn)行清洗分離，則能有效降低檢測(cè)過(guò)程中的隨機(jī)誤差和交叉污染，最大限度地提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度；（3）LICA樣本及試劑用量微量化，每項(xiàng)樣本及試劑用量?jī)H25 μL，隨著樣本用量地大幅減少，使得檢測(cè)小型化芯片化和高通量成為可能；（4）LICA超敏感性，由于采用了納米級(jí)微粒，增加了反應(yīng)表面積，縮短了反應(yīng)時(shí)間，使檢測(cè)的敏感性大大提高。有文獻(xiàn)報(bào)道，該方法對(duì)可能存在的干擾物質(zhì)，如單線態(tài)氧淬滅物質(zhì)（抗氧化劑、血紅蛋白、維生素C等）生物素結(jié)構(gòu)類似物如總膽紅素、三酰甘油等具有較好的耐受能力，少數(shù)物質(zhì)在較高的濃度時(shí)的確存在干擾，但在常規(guī)濃度情況下，這些干擾作用可以忽略不計(jì)，表現(xiàn)出較高的特異性［5-7］以CMIA為參照，LICA對(duì)1015例臨床樣本檢測(cè)結(jié)果顯示，2種檢測(cè)方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果的符合率分別為99.9%、99.7%、99.8%、99.51%、99.7%，具有很高的一致性，而作為輔助指標(biāo)的抗HBe和HBeAg存在一定差異，其中兩者不符的樣本多處于灰區(qū)弱陽(yáng)或弱陰范圍，導(dǎo)致差異的原因是由于2種方法在抗HBe和HBeAg的原材料和溯源選擇上存在一定差異［8］；當(dāng)2種方法檢測(cè)結(jié)果發(fā)生分歧時(shí)，可尋求第三方驗(yàn)證，本次試驗(yàn)，由于樣本剩余量不足，未能將所有與CMIA不符的結(jié)果進(jìn)行第三方驗(yàn)證?？傮w上，LICA與CMIA在HBV感染的血清學(xué)標(biāo)志項(xiàng)目上符合率很高，而在個(gè)別項(xiàng)目上存在一定的差異，但這并不影響本評(píng)價(jià)試驗(yàn)得出的結(jié)論?？傊?，LICA以其獨(dú)特的檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了微量敏感快速均相免清洗檢測(cè)，與CMIA相比，具有相近的檢測(cè)性能。

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［2015-08-18收稿，2015-09-16修回］［本文編輯：吳蓉］

［中圖分類號(hào)］R512.62

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］B

［作者單位］266071山東青島，解放軍401醫(yī)院檢驗(yàn)科（王軍，劉妮妮，趙權(quán)，葉琳琳，劉婧，劉玉琳，徐菲）

DOI：10.14172/j.issn1671-4008.2016.02.010