中藥癌復(fù)康對重癥聯(lián)合免疫缺陷鼠人乳腺癌肺轉(zhuǎn)移及免疫重建的影響

朱華宇，鐘少文，李玉潔，吳元勝

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510120)

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論著

中藥癌復(fù)康對重癥聯(lián)合免疫缺陷鼠人乳腺癌肺轉(zhuǎn)移及免疫重建的影響

朱華宇，鐘少文，李玉潔，吳元勝

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510120)

[摘要]目的探討中藥癌復(fù)康對重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)鼠原位移植人乳腺癌自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移及免疫重建的影響。方法將40只SCID小鼠隨機分為4組，以高轉(zhuǎn)移人乳腺癌細(xì)胞株(MDA-MB-435s)接種于鼠腹部左側(cè)第二乳頭下的乳房脂肪墊上建立小鼠人乳腺癌自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移模型，接種量為0.2 mL/只。接種后，模型對照組給予生理鹽水10 mL/(kg·d)灌胃，1次/d；癌復(fù)康組給予癌復(fù)康3.6g/(kg·d)以生理鹽水10 mL稀釋灌胃，1次/d；免疫重建組腹腔注射人體外周血淋巴細(xì)胞4×107個/只(0.5 mL)，并給予生理鹽水10 mL/(kg·d)灌胃，1次/d；癌復(fù)康+免疫重建組腹腔注射人體外周血淋巴細(xì)胞4×107個/只，并予以癌復(fù)康3.6 g/(kg·d)以生理鹽水10 mL稀釋灌胃，1次/d。觀察各組腫瘤體積、生長速度、腫瘤轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果 癌復(fù)康+免疫重建組成瘤潛伏期明顯長于其余3組(P均<0.05), 癌復(fù)康組和免疫重建組成瘤潛伏期明顯長于模型對照組(P<0.05)；模型對照組腫瘤生長速度較其余3組快，腫瘤體積大于其余3組(P均<0.05)，癌復(fù)康組和免疫重建組腫瘤生長速度相近(P>0.05),癌復(fù)康+免疫重建組腫瘤生長速度最慢(P均<0.05)；癌復(fù)康組、免疫重建組、癌復(fù)康+免疫重建組乳腺癌肺轉(zhuǎn)移抑制率分別為64.7%，38.4%和84.8%，3組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論中藥癌復(fù)康能延長人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435s接種SCID鼠成瘤潛伏時間，促進(jìn)SCID鼠的免疫重建，具有一定的抑制腫瘤生長和抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。

[關(guān)鍵詞]乳腺癌；癌復(fù)康；人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435s；重癥聯(lián)合免疫缺陷；小鼠；免疫重建

中醫(yī)藥扶正祛邪法治療乳腺癌在機制上與免疫生物治療相似，主要是提高腫瘤患者的免疫功能。中藥復(fù)方癌復(fù)康為全國名老中醫(yī)林毅教授治療乳腺癌經(jīng)驗方，具有顯著抗腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移作用[1]。本研究采用嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷基因(Severe combined imunodeficiency，SCID)小鼠和高轉(zhuǎn)移人乳腺癌細(xì)胞株(MDA-MB-435s)建立小鼠人乳腺癌自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移模型，旨在觀察癌復(fù)康對原位移植人乳腺癌SCID鼠肺轉(zhuǎn)移及免疫重建模型的干預(yù)作用。

1實驗資料

1.1實驗動物選取4～6周齡無免疫滲漏(血IgG<5 μg/mL)的雌性SCID小鼠40只，體質(zhì)量15～22 g，由中國科學(xué)院北京動物實驗中心提供，合格證號：SCXK(京)2005-0013。飼養(yǎng)在廣東省醫(yī)學(xué)動物實驗中心無特定病原體(specific pathogen free,SPF)環(huán)境中，許可證號：SYXK(粵)2003-0002。動物實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料、飲水、灌胃用藥及墊料均經(jīng)高壓滅菌處理(126 ℃，20 min)。飼養(yǎng)條件：室溫(25±2)℃，濕度45%～50%，在SPF實驗室獨立自動送風(fēng)分籠隔離系統(tǒng)(IVC)內(nèi)飼養(yǎng)。

1.2藥物癌復(fù)康方由黃芪、茯苓、炒白術(shù)、太子參、淮山藥、肉蓯蓉、山萸肉、女貞子、南沙參、制首烏、枸杞、莪術(shù)、半枝蓮、薏苡仁組成。本實驗藥材均購自廣東省中醫(yī)院中藥房，由廣東省中醫(yī)院制劑室鑒定均符合《中華人民共和國藥典》2005年版質(zhì)量要求，并按傳統(tǒng)工藝煎煮、過濾、醇沉，回收溶劑至浸膏狀，使每毫升含生藥3.2 g，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3腫瘤細(xì)胞系人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-435s由中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所提供，用含10%胎牛血清(FBS)、0.01 mg/mL 谷氨酰胺、0.01 mg/mL胰島素的L15培養(yǎng)基在5%CO2，37 ℃條件下培養(yǎng)，傳代1～2次/周。

1.4主要試劑及儀器Lympholyte-H 人淋巴細(xì)胞分離液、Leibovitz L15培養(yǎng)基(上海博升生物科技有限公司)；IgG ELISA檢測試劑盒(華美公司)；電子數(shù)顯卡尺(廣州廣卓精密儀器有限公司)；倒置顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)；電子天平(德國sartorius公司)。

1.5方法

1.5.1人體外周血淋巴細(xì)胞(PBL)的分離抽取健康人外周血，用人淋巴細(xì)胞分離液(比重為1.077)按常規(guī)方法分離(密度梯度離心法分離)。生理鹽水洗滌2遍(1 500 r/min×10 min) 后用37 ℃ RPMI-1640培養(yǎng)液吹打重懸離心沉淀細(xì)胞，制成均勻細(xì)胞懸液；倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行測量，細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為8×107mL-1備用。

1.5.2動物造模參照文獻(xiàn)[2-3]方法，取體外培養(yǎng)的對數(shù)生長期MDA-MB-435s人乳腺癌細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)整為2×107mL-1。無菌條件下，將MDA-MB-435s人乳腺癌細(xì)胞接種于SCID小鼠腹部左側(cè)第二乳頭下的乳房脂肪墊上，接種量為0.2 mL/只。所有操作均在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行。

1.5.3動物分組與給藥方法40只SCID小鼠隨機分為4組，每組10只。模型對照組：接種后給予生理鹽水10 mL/(kg·d)灌胃，1次/d；癌復(fù)康組：按《抗癌藥物研究與實驗技術(shù)》人和動物間按體表面積折算表計算出小鼠的癌復(fù)康用量為3.6 g/(kg·d)，接種后用生理鹽水10 mL將之稀釋灌胃，1次/d；免疫重建組：接種后腹腔注射PBL 4×107個/只(0.5 mL)，并給予生理鹽水10 mL/(kg·d)灌胃，1次/d；癌復(fù)康+免疫重建組：接種后腹腔注射PBL 4×107個/只(0.5 mL)，并予以癌復(fù)康3.6 g/(kg·d)用生理鹽水10 mL稀釋灌胃，1次/d。各組均干預(yù)12周。

1.6觀察項目每天觀察小鼠的精神狀態(tài)、活動力、 反應(yīng)、飲食、毛色、毛順滑度及瘤組織的生長情況，注意是否出現(xiàn)皮疹、腹瀉、步態(tài)改變等表現(xiàn)，參照文獻(xiàn)[2]標(biāo)準(zhǔn)確定小鼠是否發(fā)生移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)；每周2次觀察并記錄每只小鼠體質(zhì)量、瘤生長潛伏期，統(tǒng)計每組腫瘤移植成功率(每組成瘤只數(shù)/ 每組總只數(shù)×100%)。 各組小鼠飼養(yǎng)12周后脫頸處死，稱體質(zhì)量；免疫重建組取血用ELISA法測定血中IgG含量；各組解剖取腫瘤瘤塊和肺組織，分別用電子天平稱質(zhì)量，計算抑瘤率 [(對照組平均瘤質(zhì)量-實驗組平均瘤質(zhì)量)/對照組平均瘤質(zhì)量×100%]；肉眼計數(shù)肺表面的灰白色結(jié)節(jié)，即轉(zhuǎn)移灶,計算肺轉(zhuǎn)移抑制率[(對照組平均肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)-用藥組平均肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù))/對照組平均肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)×100%]。電子數(shù)顯卡尺測量腫瘤最長徑(a)及垂直徑(b)，按公式V=πab2/6計算腫瘤相對體積。將腫瘤瘤塊放入10%中性福爾馬林液中固定，石蠟包埋，超薄切片，蘇木素-伊紅染色(HE染色)，顯微鏡觀察瘤細(xì)胞生長情況。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。率的比較用卡方檢驗，均數(shù)比較用t檢驗或單因素方差分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1SCID小鼠成瘤情況4組SCID小鼠全部存活，均未發(fā)生GVHD；接種人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435s后在接種部位乳墊處出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)，質(zhì)地較硬；成瘤率為100%，顯微鏡下肺轉(zhuǎn)移率為100%。免疫重建組12周時小鼠血中IgG達(dá)(128.48±4.76)mg/L。模型對照組成瘤潛伏期為(6.5±1.3)d，癌復(fù)康組為(14.7±2.5)d，免疫重建組為(13.8±2.7)d，癌復(fù)康+免疫重建組為(21.8±3.6)d。癌復(fù)康+免疫重建組成瘤潛伏期明顯長于其余3組(P均<0.05)，癌復(fù)康組和免疫重建組成瘤潛伏期均長于模型對照組(P均<0.05),癌復(fù)康組與免疫重建組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2腫瘤體積變化情況4組SCID小鼠在接種部位乳墊處出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)漸增大。模型對照組腫瘤直徑為(24.3±0.5)mm，腫瘤生長速度較其余3組快，腫瘤體積顯著大于其余3組(P均<0.05)；癌復(fù)康組和免疫重建組腫瘤直徑分別為(17.8±0.6)mm和(18.3±0.4)mm，腫瘤生長速度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；癌復(fù)康+免疫重建組腫瘤直徑為(12.7±0.2)mm，腫瘤生長速度顯著慢于其余3組。見圖1。

圖1　各組SCID鼠腫瘤體積變化曲線

2.3抑瘤率癌復(fù)康組、免疫重建組、癌復(fù)康+免疫重建組瘤質(zhì)量均明顯低于模型對照組(P均<0.05)，癌復(fù)康+免疫重建組瘤質(zhì)量明顯低于癌復(fù)康組和免疫重建組(P均<0.05)，抑瘤率明顯高于癌復(fù)康組和免疫重建組(P均<0.05)，癌復(fù)康組和免疫重建組瘤質(zhì)量及抑瘤率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1　各組抑瘤率比較

注：①與模型對照組比較，P<0.05；②與癌復(fù)康+免疫重建組比較，P<0.05。

2.4腫瘤轉(zhuǎn)移情況癌復(fù)康組、免疫重建組、癌復(fù)康+免疫重建組肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量均明顯少于模型對照組(P均<0.05)；癌復(fù)康+免疫重建組肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量明顯少于癌復(fù)康組和免疫重建組(P均<0.05)，肺轉(zhuǎn)移抑制率明顯高于癌復(fù)康組和免疫重建組(P均<0.05)；癌復(fù)康組肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量明顯少于免疫重建組(P均<0.05)，轉(zhuǎn)移抑制率明顯高于免疫重建組(P均<0.05)。見表2。

表2　各組腫瘤轉(zhuǎn)移情況比較

注：①與模型對照組比較，P<0.05；②與癌復(fù)康+免疫重建組比較，P<0.05；③與免疫重建組比較，P<0.05。

3討論

大多數(shù)乳腺癌患者致死的主要原因是腫瘤轉(zhuǎn)移而非原發(fā)病變，免疫功能低下是惡性腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腫瘤的發(fā)生發(fā)展是內(nèi)因和外因綜合作用的結(jié)果，在強調(diào)外因(邪毒蘊聚于經(jīng)絡(luò)、臟腑)的同時，更強調(diào)內(nèi)因(正氣虛弱、臟腑功能失調(diào)等)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。中醫(yī)治療乳腺癌著眼于標(biāo)本結(jié)合，整體性調(diào)節(jié)機體陰陽、氣血、臟腑、經(jīng)絡(luò)功能，調(diào)動機體內(nèi)在防御功能，阻遏腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。目前中醫(yī)藥抗腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移機制研究及探索阻斷腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的治療方法、中醫(yī)藥治療與乳腺癌腫瘤免疫之間的關(guān)系逐漸成為近年來乳腺腫瘤研究領(lǐng)域的重要課題。

全國名老中醫(yī)林毅教授認(rèn)為乳腺癌的發(fā)生是在正氣虧虛、臟腑功能紊亂的基礎(chǔ)上，外邪與內(nèi)生的痰濕與血瘀等病理產(chǎn)物相搏而成，乳腺癌患者多因脾腎不足，導(dǎo)致正氣內(nèi)虛，免疫功能低下。正氣虧虛、正不抑邪是腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的主要因素，而扶正尤重脾腎。癌復(fù)康是其經(jīng)多年臨床實踐總結(jié)而成的中藥方劑，方中黃芪、茯苓、炒白術(shù)、太子參、淮山藥益氣健脾，使氣血生化有源；肉蓯蓉、山萸肉、女貞子等補腎生髓，調(diào)攝沖任；南沙參、制首烏、枸杞養(yǎng)陰補血生津；莪術(shù)、半枝蓮、薏苡仁活血化瘀，清熱解毒，利濕消腫。全方具益氣健脾、補腎生髓、抗癌解毒之功。經(jīng)15年臨床應(yīng)用，在臨床取得了延長患者生存期、提高生命質(zhì)量、穩(wěn)定瘤灶、防止癌瘤轉(zhuǎn)移的確切療效。

免疫缺陷動物的出現(xiàn)促進(jìn)了腫瘤模型、腫瘤免疫和腫瘤治療等相關(guān)研究，SCID小鼠作為腫瘤抗原免疫應(yīng)答的研究模型，也是研究淋巴細(xì)胞分化作用和調(diào)控作用的主要模型，其缺乏體液免疫和細(xì)胞免疫功能，可以不受干擾地進(jìn)行免疫誘導(dǎo)、免疫調(diào)節(jié)、免疫治療等研究[3-5]。SCID小鼠人類腫瘤移植存活率高達(dá)36.9%，一般裸鼠為16.8%，其對惡性腫瘤的移植不但轉(zhuǎn)移率高，而且能廣泛擴散，其浸潤和轉(zhuǎn)移與人類腫瘤自發(fā)性轉(zhuǎn)移相似[6]。由于小鼠乳腺微環(huán)境與人相似，植入到SCID小鼠體內(nèi)的腫瘤組織可出現(xiàn)類似人體內(nèi)的浸潤和轉(zhuǎn)移過程。MDA-MB-435s乳腺癌細(xì)胞是一高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系，能穩(wěn)定地發(fā)生肉眼可見的肺轉(zhuǎn)移，不同于其他細(xì)胞株主要是肺部彌漫性浸潤，便于實驗量化觀測[7]。本研究4組SCID小鼠全部存活，均未發(fā)生GVHD，成瘤率為100%，顯微鏡下肺轉(zhuǎn)移率為100%，表明該細(xì)胞系可建立良好的乳腺癌原位移植自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移模型。

SCID小鼠體內(nèi)植入人外周血淋巴細(xì)胞是一種新型的模擬人免疫系統(tǒng)的實驗?zāi)Ｐ?，也是迄今為止較具說服力的用于評估生物治療的體內(nèi)模型。本研究通過SCID鼠皮下接種高轉(zhuǎn)移性人乳腺癌細(xì)胞，同時腹腔內(nèi)植入人PBL，建立了同時具有人免疫系統(tǒng)和人乳腺癌的復(fù)合動物模型，從整體動物模型的角度觀察了中藥復(fù)方癌復(fù)康等干預(yù)措施對SCID小鼠人乳腺癌自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移及免疫重建的影響，目前國內(nèi)外類似報道較少。本研究顯示癌復(fù)康+免疫重建組成瘤潛伏期明顯長于其余3組，癌復(fù)康組和免疫重建組成瘤潛伏期均長于模型對照組,癌復(fù)康組與免疫重建組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表明人PBL的植入和中藥癌復(fù)康均能使SCID小鼠成瘤潛伏期延長，抑制腫瘤生長，具有一定的抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，并能促進(jìn)SCID小鼠的免疫重建，但癌復(fù)康組抗轉(zhuǎn)移作用優(yōu)于免疫重建組，癌復(fù)康與免疫重建結(jié)合效果更明顯。

綜上所述，中藥癌復(fù)康能延長人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435s接種SCID鼠成瘤潛伏時間，促進(jìn)SCID小鼠的免疫重建，具有一定的抑制腫瘤生長和抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，其可能是通過提高機體免疫功能而防治乳腺癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，具體作用機制有待今后進(jìn)一步研究。

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Effect of Aifukang on the human breast cancer lung metastasis and immune reconstitution in severe combined immunodeficiency mice

ZHU Huayu, ZHONG Shaowen, LI Yujie, WU Yuansheng

(The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510120，Guangdong, China)

Abstract:Objective It is to investigate the effect of Aifukang on spontaneous lung metastasis and immune reconstitution of severe combined immunodeficiency (SCID) mice orthotopic transplantation model of human breast cancer. Methods 40 cases of SCID mice were randomly divided into 4 groups, the spontaneous lung metastasis model of human breast cancer was established by inoculation of high metastatic breast cancer cell line (MDA-MB-435s) on the second breast fat pad of left side of the abdomen in mice, and inoculation amount was 0.2 mL. After inoculation, the animals were treated with normal saline 10 mL/(kg·d) by intragastric administration in the model control group, 1 times per day; and with Aifukang 3.6 g/(kg·d) diluted with normal saline 10 mL by intragastric administration in the Aifukang group, 1 times per day; and with human peripheral blood lymphocytes 4×107/0.5 mL by intraperitoneal injection, and then received normal saline 10 mL/(kg·d) by intragastric administration in immune reconstitution group, 1 times per day; and with human peripheral blood lymphocytes 4×107 by intraperitoneal injection, and Aifukang 3.6 g/(kg·d) diluted with normal saline 10 mL by intragastric administration in the combine group, 1 times per day. The tumor volume, growth rate and tumor metastasis were observed in each group. Results The latent period of tumor formation of the combine group were obviously longer than those of the other three groups (all P<0.05), and which of the Aifukang group and immune reconstitution group were significantly longer than that of model control group (all P<0.05). The tumor growth rate of the blank control group was markedly faster and the tumor volume was markedly larger than those of the other three groups (all P<0.05); the tumor growth rates of Aifukang group and immune reconstitution group were similar (P>0.05), and of the combine group was the slowest (P<0.05). The human breast cancer spontaneous lung metastasis inhibition rate of the Aifukang group, the immune reconstitution group and the combine group was 64.7%, 38.4% and 84.8% relatively, there were significant difference between the three groups (P<0.05). Conclusion Aifukang can prolongs the latent period of tumor formation tumorigenic period in the SCID mice injected with MDA-MB-435s, and promotes the immune reconstitution in SCID mice. It has certain effect on inhibition of tumor growth and metastasis.

Key words:breast cancer; Aifukang; human breast cancer cell line MDA-MB-435s; severe combined immunodeficiency; mouse; immune reconstitution

[收稿日期]2015-12-01

[中圖分類號]R-332

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)15-1597-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.15.001

[基金項目]廣東省自然科學(xué)基金課題(07300287)；廣東省科技計劃項目(2012B031800422)；廣州中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新基金項目(2005c060)；廣東省中醫(yī)藥局科技項目(2007066)；廣東省中醫(yī)院中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究專項名醫(yī)工作室項目(E194)

[作者簡介]朱華宇，女，博士，副主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療乳腺癌研究。