DCE-MRI評價結(jié)腸癌裸鼠藥物治療的實驗研究

古麗巴哈·耐買提丁 爽王云玲王 紅馬景旭賈文霄

作者單位：1新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院影像中心　2新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院影像中心

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DCE-MRI評價結(jié)腸癌裸鼠藥物治療的實驗研究

古麗巴哈·耐買提1丁 爽2王云玲1王 紅1馬景旭1賈文霄1

作者單位：1新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院影像中心2新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院影像中心

【摘要】目的 在通過建立結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤，探討動態(tài)增強檢查（DCE-MRI）反映抗腫瘤藥物治療后腫瘤血管生成關(guān)閉的應(yīng)用價值。方法：48只結(jié)腸癌裸鼠移植瘤隨機分兩組，對照組：24只、抗腫瘤藥物組：24只，對照組注射等量的0.9%氯化鈉溶液、灌胃稀釋小艾飛蜜膏，分別在治療前與治療后2天、7天、14天以及21天進行常規(guī)MRI檢查和動態(tài)增強檢查，治療后每個時間段各處死6只老鼠行免疫組化染色，與動態(tài)增強檢查各參數(shù)與免疫組化結(jié)果行相關(guān)性分析。結(jié)果：在DCE - MRI各參數(shù)，實驗組Ktrans值及Kep值與對照組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其余不存在統(tǒng)計學意義，治療后14天和21天，同時間點Ktrans值及同時段的Kep值實驗組與對照組比較均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），參數(shù)值Ve不存在統(tǒng)計學意義。結(jié)論：DCE-MRI中定量參數(shù)Ktrans值及Kep值可以作為影像標記物無創(chuàng)性的評價抗腫瘤藥物治療后腫瘤血流灌注及血管通透性方面有較大的應(yīng)用價值。

【關(guān)鍵詞】結(jié)腸癌移植瘤；動態(tài)增強；Ktrans；Kep

中國醫(yī)學計算機成像雜志，2016，22：182-186

Chin Comput Med Imag，2016，22：182-186

1Department of Radiology， The Second Affiliated Hospital，Xinjiang Medical University

2Department of Radiology， The Frist Affiliated Hospital，Xinjiang Medical University

Address： 38 Nanhu East Rd， Urumqi 830063，P.R.C

Address Corresponding to：JIA Wen-xiao （Email：jwzxj@ sina.com）

Foundation item：Natural Science Foundation of China（No.81360214）

惡性腫瘤是危害人類健康的嚴重疾病之一，當前治療惡性腫瘤的手段非常有限。除了外科手術(shù)外，抗腫瘤血管藥物治療也成為了重要手段。但在藥物的研發(fā)過程中需要建立有效、便捷的生物標志物來監(jiān)測腫瘤的血流動力學變化、細胞代謝等以評價藥物的療效、指導臨床用藥。MRI動態(tài)增強檢查技術(shù)在評價腫瘤藥物療效等方面有很大的優(yōu)勢。本文就主要分析動態(tài)增強掃描（DCE-MRI）結(jié)合藥代動力學模型獲得的定量指標來明確動態(tài)增強掃描技術(shù)是否可以作為影像生物標記物來評價腫瘤藥物治療后腫瘤血管生成關(guān)閉的應(yīng)用價值。

方 法

1.實驗對象及實驗設(shè)計

購買人型結(jié)腸癌HT-29細胞株，嚴格試驗室操作進行擴增，配制成瘤細胞濃度為1x106個/ml的懸液0.1～0.2 ml，接種于BALB/c-nu，鼠齡6～8周的裸鼠左下肢皮下，建立結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤模型。模型建立成功的標準為皮下移植瘤體積測量達200mm3。

建模成功的48只結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤模型隨機分為兩組：對照組（n=24）按20mg/kg腹腔注射9%生理鹽水，維吾爾藥（n=24）稀釋后按0.02ml/kg灌胃，隨后每組均治療前和治療后2天、7天、14天21天行常規(guī)MRI檢查與DCE-MRI檢查并與治療后每個時間段處死6只老鼠行病理免疫組化染色。

2. MR檢查方法

治療前與治療后2天，7天，14天，21天

（1）常規(guī)掃描方式：采用PHILIPS 1.5T磁共振成像系統(tǒng)，采用25mm實驗動物專用線圈。受檢裸鼠麻醉后，放到線圈里固定，采用TFE序列進行定位，采用SE- T1WI、T2WI等掃描方法。分別觀察裸鼠腹主動脈，腎臟及腫瘤體積，有無液化壞死等變化。

（2）動態(tài)增強檢察技術(shù)：檢查前，在裸鼠尾靜脈接針，固定裸鼠在線圈內(nèi)，冠狀位掃描。DCEMRI掃描參數(shù)為：連續(xù)無中斷的掃描100個動態(tài)圖像，共1200幅原始圖像，TR=2.56 ，TE=0.77 ，層厚3 mm，層間距3.0 mm，層數(shù)64層，F(xiàn)OV=350，采集次數(shù)（NSA）1次，矩陣70×128。注射對比劑前6個動態(tài)時相為增強前的基礎(chǔ)掃描，磁共振對比劑為釓貝葡胺注射液，原濃度0.3ml造影劑稀釋在4.7ml生理鹽水中，配制成對比劑，按照0.1/10g的劑量注射，注射部位為裸鼠尾靜脈，由同一個人按相同的速率人工推注。

3.圖像處理與分析

將DCE-MRI圖像輸入Biomap軟件進行后處理，在腹主動脈劃取感興趣區(qū)R1（ROI），通過Biomap軟件獲得老鼠的動脈輸入功能函數(shù)（arterial input function，AIF），在載瘤裸鼠移植瘤劃取感應(yīng)趣區(qū)R2，在AIF基礎(chǔ)上Biomap軟件自動計算出移植瘤中反映有關(guān)微血管通透性的各定量參數(shù)，即轉(zhuǎn)運常數(shù)（Ktrans），血管外細胞外間隙體積百分數(shù)（Ve），速率常數(shù)（Kep）

4.組織病理學檢查

裸鼠移植瘤腫瘤組織以10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)包埋及切片進行HE染色及微血管密度測定（MVD）

5.統(tǒng)計學分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，不同治療組間，同一組治療不同時期的動態(tài)增強掃描檢查獲得的各項參數(shù)進行重復的方差分析。各觀察指標與病理結(jié)果進行相關(guān)性分析，檢查水準取α=0.05

結(jié) 果

1.影像學實驗結(jié)果

所有結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤在T1WI上呈低信號，T2WI上呈高信號，增強后明顯強化。有部分未見明顯強化區(qū)為液化壞死區(qū)見圖1 ，實驗組治療后的增強曲線見圖2，病理見圖3。

2.治療前后時間段的各參數(shù)比較結(jié)果

對照組及實驗組各24只，每組治療后處死6只。以下為對照組與實驗組各參數(shù)值變化：

兩組結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤對照組及藥物組不同時間段的得的Ktrans值見表1，治療前兩組比較無統(tǒng)計學意義。治療后2天及7天均無統(tǒng)計學意義。治療后14對照組Ktrans值仍上升，藥物組下降。Ktrans值小于對照組，兩組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），治療后21天測得藥物組Ktrans值均低于對照組，兩組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）

兩組結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤對照組及藥物組不同時間段測得的Kep見表2。治療前兩組比較無統(tǒng)計學意義。治療后2天及7天兩組比較均無統(tǒng)計學意義。治療后14天兩組比較測得Kep值藥物組低于對照組，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），治療后21天得Kep值藥物組均低于對照組，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

（3）兩組結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤對照組及藥物組不同時間段測得的Ve值見表3。治療后Ve數(shù)值不穩(wěn)定，不存在明顯在統(tǒng)計學意義。

3.與病理實驗結(jié)果相關(guān)性

實驗組與對照組治療后的病理圖片，實驗組血管較對照組稀疏，動態(tài)增強參數(shù)Ktrans值及Kep值與病理結(jié)果MVD做spearman相關(guān)分析結(jié)果見表4。

分析結(jié)果Ktrans值在治療后14天及21天與MVD計數(shù)具有良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)較高，分別為0.774 0.831均存在統(tǒng)計學意義。參數(shù)Kep同樣與MVD計數(shù)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為：0.761 0.829均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），Ve值與MVD未觀察到線性相關(guān)。

表1 兩組結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤治療后不同時間段Ktrans值的測量結(jié)果（Ktrans×10-1）（/s）

表2 兩組結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤治療后不同時間段Kep值的測量結(jié)果（Kep×10-1）（/s）

表3 兩組結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤治療后不同時間段Ve值的測量結(jié)果

表4 實驗組結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤治療后DCE-MRI各參數(shù)與免疫組化（MVD計數(shù)）相關(guān)性分析

圖1 增強后的結(jié)腸癌裸鼠，箭頭指的部分的腫瘤組織。

圖2 治療前后，Biomap軟件做出來的強化曲線及各參數(shù)值。

圖3 病理圖片。

討 論

當前腫瘤藥物的研發(fā)是治療惡性腫瘤除外科手術(shù)外最關(guān)鍵的治療手段，但在評估藥物的療效時缺乏早期、快速、便捷與無創(chuàng)性地監(jiān)測手段、以及確定合適的藥物劑量、選擇合適的給藥時間及臨床藥物療效觀察時間。近幾年來的大量研究結(jié)果表明，新生血管在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程中起非常關(guān)鍵作用［2］，所以，現(xiàn)在研究腫瘤新生血管生成的過程與機制，對腫瘤預(yù)防與治治療具有重要意義［1］以往對于腫瘤血供豐富程度的判斷主要是通過測定腫瘤組織的微血管密度（MVD）。微血管密度（MVD）作為腫瘤血管生成的標志物，反映血管生成的程度，因此腫瘤組織尤其惡性腫瘤組織微血管密度的測定對于判斷腫瘤病人的預(yù)后、指導臨床治療和判斷療效等均具有重要作用［4］，但測定時創(chuàng)傷性大，無法在患者身上重復測定而檢測抗腫瘤藥物的療效，所以我們需要找更合適的方法來檢測腫瘤藥物治療的療效。

這幾年來，探討腫瘤分子生物學因素與影像之間的關(guān)系的研究逐漸成為影像學研究的重要方向［7］。影像技術(shù)的快速發(fā)展，尤其是MRI技術(shù)在臨床上廣泛應(yīng)用，動態(tài)增強技術(shù)功能成像在發(fā)現(xiàn)疾病、治療后的預(yù)后方面有了很大的優(yōu)勢。MRI動態(tài)增強掃描作為作為一種非創(chuàng)傷性的評價腫瘤微血管的生成技術(shù)，病理生理基礎(chǔ)是腫瘤的血流動力學，其強化的程度及時間主要取決于腫瘤的血管化程度，血管對比劑的通透性以及腫瘤間質(zhì)的壓力，可以從細胞分子水平獲取多個反映腫瘤血流動力學，細胞代謝障礙等的影像標記物［7］。我們選擇的動態(tài)增強參數(shù)轉(zhuǎn)運常數(shù)（Ktrans）值代表為單位時間內(nèi)每單位體積組織中從血液進入血管外細胞外間隙的對比劑量。血管外細胞外間隙體積常數(shù)（Ve）值代表為單位體積組織內(nèi)血管血管外細胞外間隙的體積，Kep代表由單位時間內(nèi)由血管外細胞外間隙進入血管的對比劑量。Ktrans值和Kep值反映血管滲透性和組織灌注，同時可以反映腫瘤內(nèi)新生血管形成程度［7-8］。

在本實驗中對照組在每個時間段里所觀察的各參數(shù)都有增大的趨勢，原因分析，隨著觀察時間的延長，腫瘤血流的灌注增加，微血管通透性增加，腫瘤新生血管數(shù)目增多，從而MVD增加。實驗組藥物治療后與對照組對比后結(jié)果顯示，治療14天與21天后，藥物抑制腫瘤新生血管形成，腫瘤血管有明顯稀疏，MVD計數(shù)有減少，相應(yīng)的腫瘤血流灌注減少，微血管通透性減少，進入血管的造影劑減少，對應(yīng)的Ktrans值與Kep值有下降。而治療后2天及7天未見各參數(shù)值的變化，原因分析，因我們選用的藥物為維吾爾藥，雖然在臨床上應(yīng)用廣泛，但因長效藥物，所以結(jié)果比較不穩(wěn)定。免疫組化結(jié)果表示MVD與動態(tài)增強檢查參數(shù)Ktrans值及Kep值良好的正相關(guān)性。所觀察的Ve值與病理結(jié)果不存在相關(guān)性，是否還可以作為影像生物標記物來檢測藥物療效，應(yīng)進一步研究。所以實驗結(jié)果可以表明Ktrans值與Kep值能夠較好地反映用抗腫瘤藥物干預(yù)后腫瘤血流灌注與細胞增殖活性的變化。

總而言之，通過觀察抗腫瘤藥治療結(jié)腸癌裸鼠移植瘤后的動態(tài)增強相關(guān)參數(shù)與免疫組化結(jié)果對照，在結(jié)果表明動態(tài)增強MRI在作為影像生物標記物評價抗腫瘤藥物治療后腫瘤血管生成關(guān)閉有很好的應(yīng)用價值，從而為開發(fā)快速，無創(chuàng)性，有效地評價藥物干預(yù)后腫瘤血管變化情況的技術(shù)有著很重要的價值，為抗腫瘤藥的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。動態(tài)增強掃描具有較高的空間分辨率，且能定量分析血流灌注及血管通透性，其中我們選用的參數(shù)Ktrans值與Kep值最有很好的應(yīng)用價值。

參 考 文 獻

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Experimental Study of Evaluation of Anti-tumor Therapeutic Effect of Nude Mouse with Colon Cancer by DCE-MRI

GULIBAHA.Naimaiti DING Shuang，WANG Yun-ling，WANG Hong，MA Jing-xv，JIA Wen-xiao

【Abstract】Purpose：To establish colon cancer nude mouse tumor model by tumor grafted subcutaneously， and to assess the application value of DCE-MRI in anti-tumor therapeutic effect evaluation. Methods: Forty-eight nude mice with colon cancer were randomly divided into 2 groups. There were 24 nude mice in control group and 24 nude mice in Uyghur anti-tumor medicine group. The mice in anti-tumor medicine group were intra-gastric administration of dilution Uyghur medicine Majuni Affiy Kiqik； and the mice in control group were injected with equal amount of 0.9% sodium chloride solution. Conventional MRI and DCE-MRI were respectively conducted on 2 days， 7 days， 14 days and 21 days before and after therapy. In each time point， 6 mice were killed and immunohistochemical staining was conducted， and correlation of the parameters of DCE-MRI and immunohistochemistry results was analyzed. Results: The transplanted tumor was significantly enhanced on DCE-MRI. There were statistically significant differences of Ktransand Kep values between the experimental group and control group （p＜0.05）， while the other parameters were not with statistically significant differences between them. On 21 days and 14 days after therapy， the differences of the Ktransvalue， the Kep value between the experimental group and the control group were with statistical significant （＜0.05）. There was no statistical significance difference of the values of Ve （P＞0.05）. Conclusion: The quantitative parameter Ktransvalue and Kep value in DCE-MRI can be used as the noninvasive imaging markers for the tumor blood flow perfusion and vascular permeability after therapy， which is of quite significant application value.

【Key words】Colon cancer xenograft；DCE-MRI；Ktrans；Kep

收稿時間：（2015.10.22；修回時間：2015.11.20）

基金項目：國家自然科學基金 （81360214）

通信地址：新疆烏魯木齊市南湖東路北二巷38號 ，烏魯木齊 830063通信作者：賈文霄 （電子郵箱：jwxxj@sina.com）

中圖分類號：R445.2

文獻標志碼：B

文章編號：1006-5741（2016）-02-0182-05