劍麻斑馬紋病菌多聚半乳糖醛酸酶Szpg6～Szpg10基因的分子檢測(cè)及其序列分析

吳偉懷，賀春萍，鄭金龍，習(xí)金根，鄭肖蘭，梁艷瓊，劉巧蓮，李銳，易克賢*

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所/海南省熱帶農(nóng)業(yè)有害生物檢測(cè)監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?571101；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海口 571101)

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劍麻斑馬紋病菌多聚半乳糖醛酸酶Szpg6～Szpg10基因的分子檢測(cè)及其序列分析

吳偉懷1，賀春萍1，鄭金龍1，習(xí)金根1，鄭肖蘭1，梁艷瓊1，劉巧蓮2，李銳1，易克賢1*

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所/海南省熱帶農(nóng)業(yè)有害生物檢測(cè)監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?571101；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，?？?571101)

摘要：斑馬紋病是劍麻生產(chǎn)上最嚴(yán)重、毀滅性病害之一。本研究基于寄生疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶pppg6 ～ pppg10等5個(gè)基因cDNA序列設(shè)計(jì)了各基因編碼區(qū)的特異引物。利用5對(duì)引物分別對(duì)不同來源的劍麻斑馬紋病菌DNA進(jìn)行了分子檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明，在被檢測(cè)的劍麻斑馬紋病菌菌株中均存在與寄生疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶pppg6 ～ pppg10對(duì)應(yīng)的基因Szpg6 ～ Szpg10?；蛐蛄斜葘?duì)分析表明，來自斑馬紋病菌的Szpg6、Szpg8基因與對(duì)應(yīng)pppg6、pppg8基因之間序列高度一致。比較而言，來自斑馬紋病菌的Szpg7、Szpg9以及Szpg10基因與對(duì)應(yīng)同源基因之間分別存在3、6及4個(gè)核苷酸序列差異，進(jìn)而導(dǎo)致3、5及3個(gè)推定氨基酸的變異。由此推測(cè)，來自斑馬紋病菌的Szpg7、Szpg9及Szpg10基因可能與對(duì)應(yīng)基因在功能上存在著一定的差異。本研究為進(jìn)一步研究劍麻斑馬紋病菌多聚半乳糖醛酸酶在致病過程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：劍麻斑馬紋病菌；多聚半乳糖醛酸酶；分子檢測(cè)

由煙草疫霉(Phytophoranicotianaevar.parasitica或表示為Phytophoraparasiticavar.nicotianae)引起劍麻斑馬紋病是劍麻生產(chǎn)上最嚴(yán)重的、毀滅性病害之一[1-2]。該病在我國(guó)華南各劍麻產(chǎn)區(qū)均有不同程度地發(fā)生，對(duì)劍麻的生產(chǎn)威脅很大，嚴(yán)重影響劍麻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)[3-5]。如今該病仍然是各生產(chǎn)單位重點(diǎn)盯防的對(duì)象之一。針對(duì)此病害，國(guó)內(nèi)專家學(xué)者相繼開展了病原菌形態(tài)及鑒定[1-2, 6]，生物學(xué)特性[7-8]，流行因素以及防治[9- 10]等相關(guān)研究，而關(guān)于該病原菌的多聚半乳糖醛酸酶(Polygalaturonase, PG)的相關(guān)研究還鮮見報(bào)道。

植物細(xì)胞壁是寄主與病菌互作的重要場(chǎng)所，病菌定植于寄主植物表面后只有穿透細(xì)胞壁的屏障并與之建立了寄生關(guān)系，才能表現(xiàn)出致病性，在此過程中細(xì)胞壁降解酶發(fā)揮了極其重要的作用[11]。因此，研究植物病原菌是否能分泌對(duì)細(xì)胞壁起離析破壞作用的特異性酶，對(duì)于揭示其致病過程將具有重要的理論和實(shí)踐意義。目前，已從寄生疫霉菌中克隆了PG基因pppg1 ～pppg10 共10個(gè)基因[12-13]。在前期研究發(fā)現(xiàn)斑馬紋病菌PG基因Szpg1～Szpg5的編碼區(qū)與寄生疫霉PG基因pppg1～pppg5對(duì)應(yīng)基因序列具有高度的相似性，其氨基酸序列一致性均在90%以上。然而pppg6 ～pppg10基因在劍麻斑馬紋病菌中存在情況以及同源性情況如何，仍然未知。為此，本研究擬以這些基因序列為參考序列設(shè)計(jì)特異引物，檢測(cè)PG基因在劍麻斑馬紋病菌中的存在情況，并對(duì)各基因編碼區(qū)進(jìn)行克隆與測(cè)序，為下一步研究劍麻斑馬紋病菌PG在斑馬紋病菌致病過程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

用于本實(shí)驗(yàn)的劍麻斑馬病菌菌株共計(jì)35個(gè)，分別采集自廣東、海南及廣西劍麻種植地(表1)。

1.2方法

1.2.1菌絲體收集及DNA提取

各供試菌株于已滅菌的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，28℃ 160 rpm振蕩培養(yǎng)6天后，對(duì)菌絲體收集與真空干燥。收集的各菌絲體于液氮中充分研磨后，采用DNA提取試劑盒(E.Z.N.A Fungal DNA kit, Omega 公司，美國(guó))進(jìn)行DNA提取。

1.2.2總RNA的提取與cDNA的合成

按TRIzol R試劑盒 (Gibco-BRL) 操作方法對(duì)于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)中培養(yǎng)6天的劍麻斑馬紋病原菌菌絲體進(jìn)行總RNA提取。cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成則利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperscriptTM III Reverse Transcriptase進(jìn)行。

1.2.3引物設(shè)計(jì)與合成

利用軟件primer5.0以寄生疫霉PG基因pppg6 ～pppg10序列為參考，于各基因編碼區(qū)起始密碼子處設(shè)計(jì)正向引物，并于終止密碼子處設(shè)計(jì)反向引物。依據(jù)引物設(shè)計(jì)的一般原則，使預(yù)設(shè)引物序列長(zhǎng)20～25 bp。設(shè)計(jì)好的引物序列委托英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司Invitrogen采用普通脫鹽方式進(jìn)行合成。各引物序列見表2。

表135個(gè)供試劍麻斑馬紋菌株

Tab.135 isolates ofPhytophoranicotianaefrom sisal

電泳號(hào)菌株采集地采集時(shí)間電泳號(hào)菌株采集地采集時(shí)間1PP2廣東雷州東方紅農(nóng)場(chǎng)22/10/201319PP24廣東雷州金星農(nóng)場(chǎng)22/10/20132PP3廣東雷州東方紅農(nóng)場(chǎng)22/10/201320PP29廣東雷州東方紅農(nóng)場(chǎng)04/08/20063PP4廣東雷州金星農(nóng)場(chǎng)22/10/201321PP30海南昌江南迪農(nóng)場(chǎng)19/04/20104PP5廣東雷州金星農(nóng)場(chǎng)22/10/201322PP31廣東湛江東方紅農(nóng)場(chǎng)04/08/20065PP6廣東雷州金星農(nóng)場(chǎng)22/10/201323PP32廣東雷州東方紅農(nóng)場(chǎng)22/10/20136PP7廣東雷州金星農(nóng)場(chǎng)22/10/201324PP34海南省昌江南迪劍麻場(chǎng)28/08/20097PP8廣東雷州東方紅農(nóng)場(chǎng)22/10/201325HJ-8廣東湛江雷州火炬農(nóng)場(chǎng)10/12/20118PP9廣東雷州東方紅農(nóng)場(chǎng)22/10/201326桂南4-1廣西博白桂南農(nóng)場(chǎng)04/11/20109PP10廣東湛江徐聞五一農(nóng)場(chǎng)22/10/201327CH0101廣西南寧山圩農(nóng)場(chǎng)20/08/200710PP11廣東湛江徐聞五一農(nóng)場(chǎng)22/10/201328CH0051廣東湛江東方紅農(nóng)場(chǎng)05/08/200611PP14廣東雷州東方紅農(nóng)場(chǎng)22/10/201329CH0055廣東湛江東方紅農(nóng)場(chǎng)05/08/200612PP15廣東雷州金星農(nóng)場(chǎng)22/10/201330CH0066廣東湛江雷州幸福農(nóng)場(chǎng)20/08/200613PP16廣東雷州東方紅農(nóng)場(chǎng)22/10/201331CH0088廣東湛江徐聞五一農(nóng)場(chǎng)20/08/200614PP17廣東雷州東方紅農(nóng)場(chǎng)22/10/201332CH0025廣東湛江東方紅農(nóng)場(chǎng)04/08/200615PP18廣東雷州東方紅農(nóng)場(chǎng)22/10/201333CH0062廣東湛江雷州幸福農(nóng)場(chǎng)20/08/200616PP20廣東雷州東方紅農(nóng)場(chǎng)22/10/201334CH019廣東湛江東方紅農(nóng)場(chǎng)04/08/200617PP21廣東雷州東方紅農(nóng)場(chǎng)22/10/201335CH0097海南昌江劍麻場(chǎng)30/09/200618PP23廣東雷州東方紅農(nóng)場(chǎng)22/10/2013

表2pppg6 ～pppg10基因編碼區(qū)特異引物序列及相關(guān)信息

Tab.2Specific primer sequences based onpppg6 ～pppg10 genes coding regions and related information

引物名稱引物序列(5'-3')退火溫度(℃)預(yù)期大小(bp)pppg6F/RF:ATGAAGCTTCTCACCGCAGR:TTAGCAGTTGACGCTGCTCGG601092pppg7F/RF:ATGAAAGTCCTCGCCCTCAC-TATCCR:TTAGCAGCTAATGCCACTAGGT-TCA631077pppg8F/RF:ATGAAGAACCTCTCCACCGCR:TTAGCACTTGGCGGTGCTGG621086pppg9F/RF:ATGAAGTTCGTCTACCCCGCCR:TTAGCAGCCTACTCCACTCGG601539pppg10F/RF:ATGAAGATCTTCGCA-CACTCTTTCR:TTAGCACTGTACGTTGCTCGGTC611176

1.2.4PCR擴(kuò)增及程序

每個(gè)PCR反應(yīng)體中，約含有20-30 ng DNA模板，10 μL 2×EcoTaq PCR SuperMix，正反向引物各0.5 μL(10.0 μM)，最后用ddH2O補(bǔ)齊反應(yīng)體系至20 μL。通過Mastercycler gradient Mastercycler PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，其程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；隨后94℃變性30 s，60～65℃退火30 s(根據(jù)所用引物的Tm值確定退火溫度)，72℃延伸30 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min，20℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)照相記錄。

1.2.5克隆與序列分析

取各基因PCR產(chǎn)物4 μL與pEASYTM Cloning Vector分別連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。用含氨芐青霉素的X-gal/IPTG/LB平板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，并隨即各挑取5個(gè)白斑，利用通用引物M13F/R進(jìn)行菌落PCR鑒定。經(jīng)藍(lán)白斑篩選后以及分子鑒定后，各選取3個(gè)陽性克隆子送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司Invitrogen公司測(cè)序。獲得的序列經(jīng)人工去除載體序列后，利用DNAStar進(jìn)行序列拼接。利用DNAStar software (www.DNAStar.com) 進(jìn)行序列拼接與相關(guān)分析。蛋白質(zhì)序列相似性分析則利用http://www.uniprot.org/uniprot/?query網(wǎng)站完成；蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)(Theoretical isoelectric points, pI)和分子量(molecular weights, Mw)計(jì)算利用Compute pI/ Mw工具(www.expasy.ch/tools/pi_tool.html[14])進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2.1Szpg6 ～Szpg10 基因分子檢測(cè)

5對(duì)基因特異引物，分別對(duì)35個(gè)劍麻斑馬紋病菌供試DNA進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明，5對(duì)特異引物在35個(gè)供試菌株DNA中均擴(kuò)增出單一條帶。換而言之，引物pppg6F/R、pppg7F/R、pppg8F/R等從35個(gè)目標(biāo)菌中均檢測(cè)出單一條帶，其大小均略大于1 kb，與預(yù)期大小比較一致(圖1A-C；僅列出部分?jǐn)?shù)據(jù)，下同)；而引物pppg9F/R則從供試的35個(gè)模板中檢測(cè)出約1.5 kb的特異條帶(圖1D)。與前4對(duì)引物結(jié)果相似，引物pppg10F/R也從供試的35個(gè)菌株DNA中檢測(cè)出與預(yù)期大小一致的特異條帶(數(shù)據(jù)未列出)。由此推測(cè)，Szpg6 ～Szpg10基因在劍麻斑馬紋病菌菌中是普遍存在的。

M: DNA 分子標(biāo)記DL2000；1～24：為電泳號(hào)。A,Szpg6基因分子檢測(cè)；B,Szpg7基因分子檢測(cè)；C,Szpg8基因分子檢測(cè)； D,Szpg9基因分子檢測(cè)

圖1Szpg6 ～Szpg9基因的分子檢測(cè)

Fig.1Molecular detection ofSzpg6 ～Szpg9 genes

2.2Szpg6 ～Szpg10 編碼區(qū)基因結(jié)構(gòu)及其序列比較分析

通過對(duì)各基因的cDNA序列與gDNA序列分析表明，Szpg6基因完整ORF為1092 bp，在第266處核苷酸處存在一個(gè)67 bp的內(nèi)含子。推斷基因產(chǎn)物由363個(gè)氨基酸殘基組成，估計(jì)等電點(diǎn)為5.44, 分子量3.75 kDa。與寄生疫霉PG基因pppg6的序列相比，Szpg6基因在編碼區(qū)存在1個(gè)同義核苷酸突變，其氨基酸序列一致性水平為100%(圖2A)。

Szpg7基因完整ORF為1077 bp，推斷基因產(chǎn)物由358個(gè)氨基酸殘基組成，估計(jì)等電點(diǎn)為4.04，分子量為3.71 kDa。與寄生疫霉PG基因pppg7的序列相比，Szpg7基因在編碼區(qū)存在3個(gè)核苷酸差異，且均為非同義突變，最終導(dǎo)致S19P、S27P、G345D等3處氨基酸變化，其氨基酸序列一致性水平為99.16%(圖2B)。

Szpg8基因完整ORF為1086 bp，推斷基因產(chǎn)物由361個(gè)氨基酸殘基組成，估計(jì)等電點(diǎn)為9.54，分子量為3.74 kDa。與寄生疫霉PG基因pppg8的序列相比，在Szpg8基因編碼區(qū)存在1個(gè)核苷酸差異，且為同義突變，其氨基酸序列一致性水平為100% (數(shù)據(jù)未顯示)。

Szpg9基因完整ORF為1539 bp, 推斷基因產(chǎn)物由512個(gè)氨基酸組成，估計(jì)等電點(diǎn)為4.00，分子量5.20 kDa。與對(duì)應(yīng)寄生疫霉PG基因pppg9的序列相比存在6個(gè)核苷酸差異，其中5處為非同義突變，其氨基酸序列一致性水平為99.02%。最終導(dǎo)致L246P、G367S、V406I、D454V以及M490T等5處氨基酸變異(圖2C)。

Szpg10基因完整ORF為1176 bp，在第349 bp核苷酸處存在一個(gè)66 bp的內(nèi)含子，推斷基因產(chǎn)物由391個(gè)氨基酸組成，估計(jì)分子量4.13 kDa，等電點(diǎn)為5.23。與pppg10基因的序列相比，Szpg10基因在編碼區(qū)存在4個(gè)核苷酸變異，其中3處為非同義突變，其氨基酸序列一致性水平為99.23%。最終導(dǎo)致V129D、I174V、D345G等3處氨基酸變異(圖2D)。

總之，來自劍麻斑馬紋病菌Szpg6 ～Szpg10基因編碼區(qū)序列與寄生疫霉PG基因pppg6 ～pppg10對(duì)應(yīng)基因之間同源性十分高，對(duì)應(yīng)氨基酸序列一致性均在99%以上。

圖2A　Szpg6基因與pppg6基因之間推定氨基酸序列比較

圖2B　Szpg7基因與pppg7基因之間推定氨基酸序列比較

圖2C　Szpg9基因與pppg9基因之間推定氨基酸序列比較

圖2D　Szpg10基因與pppg10基因推定氨基酸序列比較

3討論

近年來，已從不同植物病原菌中分離出多種PG, 并對(duì)其生化特性等進(jìn)行了較為詳盡地研究。綜觀現(xiàn)有研究結(jié)果，針對(duì)PG在致病過程中的作用主要存在如下幾類觀點(diǎn)，一是認(rèn)為PG作為一種致病因子，在侵染寄主過程中起著非常重要的作用[15]。然而，通過生物技術(shù)與遺傳操作技術(shù)使PG基因突變并非總是證明PG在真菌致病過程中的作用是必需的[16- 17]。除此之外，也有研究結(jié)果支持PG除了作為細(xì)胞壁降解酶與毒性因子之外，還可以通過釋放寡聚半乳糖醛酸作為一種無毒因子，從而激發(fā)寄主的防御反應(yīng)[18]。對(duì)于上述“矛盾”的結(jié)果而言，一個(gè)合理的解釋即PG基因在真菌中存在多基因家系，即在侵染過程中，每個(gè)基因僅執(zhí)行一個(gè)有限的生物學(xué)功能[13]。事實(shí)也已證明，目前已經(jīng)鑒定的許多致病真菌的PG基因，其都不是單基因，而是以多基因的形式存在。最近的研究表明，引起灰霉病的灰葡萄病菌中，至少包含6個(gè)編碼PG的基因，只是在與寄主互作過程中具有不同表達(dá)或是其生長(zhǎng)需要不同的碳源[19-20]。而菌核病菌能分泌多種不同表達(dá)模式的endoPG。其中在健康植株組織中sspg1 (Sclerotiniasclerotiorumpolygalacturonase1)，sspg2、sspg3被上調(diào)，sspg5則是在最后侵漬階段被誘導(dǎo)；相比之下，sspg6與sspg7在整個(gè)侵染過程中穩(wěn)定表達(dá)[21- 22]?？傊?，endoPG基因往往以簇形式存在，其成員也具有不同功能。

目前，研究結(jié)果表明，寄生疫霉endoPG基因事實(shí)上為一個(gè)多基因家系，除了pppg1之外，至少還包含pppg2 ～pppg10等9個(gè)基因[12-13]。本研究利用同源法對(duì)劍麻斑馬紋病菌中細(xì)胞壁降解霉基因Szpg6 ～Szpg10的編碼區(qū)進(jìn)行了分子檢測(cè)以及序列比較分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞壁降解霉基因Szpg6～Szpg10在劍麻斑馬紋病菌中普遍存在，其基因序列與寄生疫霉pppg6 ～pppg10對(duì)應(yīng)基因序列具有高度的相似性，其氨基酸序列一致性均在99%以上。結(jié)合先前已報(bào)道的劍麻斑馬紋Szpg1～Szpg5的結(jié)果[23]，由此可見，在劍麻斑馬紋病菌中至少存在由10個(gè)基因組成的細(xì)胞壁降解霉基因家系。

根據(jù)已有的表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明，寄生疫霉基pppg7于本生煙表達(dá)10天后顯示輕微銀葉癥狀，而pppg10則導(dǎo)致本生煙葉產(chǎn)生明顯的黃化與矮小[13]。在本研究中，除pppg6與pppg8之外，在Szpg7、Szpg9及Szpg10基因與對(duì)應(yīng)基因之間均存在核苷酸差異。分別到達(dá)了3、6及3個(gè)，其中3、5及3個(gè)為非同義突變。這些推定氨基酸的變異，是否導(dǎo)致功能上的變化還有待進(jìn)一步地實(shí)驗(yàn)。

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Molecular Detection and Sequence Analysis of PolygalacturonaseSzpg6 toSzpg10 Gene of Zebra Disease of Sisal

WU Weihuai1, HE Chunping1, ZHENG Jinlong1, XI Jingen1, ZHENG Xiaolan1,LIANG Yanqiong1, LIU Qiaolian2, LI Rui1, YI Kexian1*

(1.Environment and Plant Protection Institute, CATAS/Hainan Key Laboratory for Detection and Control of Tropical Agricultural Pests, Haikou 571101，China；2.Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, CATAS, Haikou 571101, China)

Abstract：Sisal zebra disease caused by Phytophora nicotianae var. parasitica is a kind of main diseases which can cause serious damage to the sisal. In the present study, five specific primer pairs were designed in coding region based on the reference sequence of pppg6 to pppg10 gene from Phytophora parasitic. Five specific primer pairs were used for the molecular detection and gene cloning from sisal zebra pathgoen DNA. The results showed that Szpg6 (sisal zebra polygalacturonase 6) to Szpg10 genes were conserved in all the tested sisal zebra isolates. Sequence alignment with the reference sequences of pppg6 to pppg10 gene from Phytophora parasitic revealed that 1, 3, 1, 6 and 4 SNPs were identified in the Szpg6 to Szpg10 genes coding regions, respectively. There, five and three of these mutations were nonsynonymous in Szpg7, Szpg9 and Szpg10, and the rest were synonymous. Thus we speculated that there were some differences in function when Szpg7, Szpg9 and Szpg10 genes were compared to pppg7, pppg9 and pppg10. The results have laid a solid foundation for the further study of the role of sisal zebra germs polygalaturonase in the pathogenic process.

Key words:zebra disease of sisal; polygalaturonase; molecular detection

中圖分類號(hào)：S563.8

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

作者簡(jiǎn)介：吳偉懷(1977-), 男，博士，副研究員，研究方向：植物病理。E-mail: weihuaiwu2002@163.com。*通訊作者：易克賢(1964-)，男，博士，研究員，研究方向：分子抗性育種。E-mail: yikexian@126.com。

基金項(xiàng)目：海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(314105)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-19)；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng) (NO.2014hzs1J012)；中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)植所自主選題項(xiàng)目(2013hzsJY04)

收稿日期：2015-12-10

文章編號(hào)：1671-3532(2016)02-0062-07