二穗短柄草異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(IPT)編碼基因的進(jìn)化及功能分析

周 雪，李 嘉，李艷花，李婷婷，王中華，權(quán) 力

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

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二穗短柄草異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(IPT)編碼基因的進(jìn)化及功能分析

周 雪，李 嘉，李艷花，李婷婷，王中華，權(quán) 力

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

摘要：細(xì)胞分裂素(CTK)是一類重要的植物激素，主要作用是引起細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)芽的形成和促進(jìn)芽的生長(zhǎng)。此外， CTK能夠通過(guò)參與細(xì)胞分化來(lái)調(diào)控根分生組織大小，對(duì)根系生長(zhǎng)有負(fù)調(diào)控作用。異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(IPT)是CTK合成過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵的限速酶，在高等植物中均以多同源拷貝形式存在。為了探尋二穗短柄草IPT基因的進(jìn)化起源，并闡明同源基因間潛在的功能分化及其在根系生長(zhǎng)過(guò)程中的生物學(xué)功能，首先，對(duì)擬南芥及二穗短柄草的IPT基因進(jìn)行了序列比對(duì)和進(jìn)化分析，其次，利用熒光定量的方法對(duì)二穗短柄草中各IPT基因在不同組織不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了定量分析，最后，通過(guò)構(gòu)建IPT基因RNAi的表達(dá)載體，對(duì)二穗短柄草中多個(gè)IPT基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行了沉默干擾。結(jié)果表明，tRNA-IPT可能代表了IPT祖先基因的功能，而且是ATP/ADP-IPT基因的供體基因。二穗短柄草各IPT基因具有一定的組織表達(dá)特異性，大部分ATP/ADP-IPTs處于轉(zhuǎn)錄不活躍狀態(tài)，而tRNA-IPTs在根部和葉部的表達(dá)量都很高。因此，IPT基因在單子葉模式植物二穗短柄草中可能采用了不同于擬南芥的方式發(fā)揮功能，其主要的發(fā)揮功能形式是tRNA類型。二穗短柄草轉(zhuǎn)IPT-RNAi植株表現(xiàn)出根系增強(qiáng)的表型，說(shuō)明在根系早期發(fā)育階段，二穗短柄草ATP/ADP型IPT基因起到了一定的調(diào)節(jié)作用。由于IPT基因在早熟禾亞科物種中較為保守，本研究可為增強(qiáng)麥類作物根系發(fā)育與提高抗旱性提供必要理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：二穗短柄草；IPT基因；細(xì)胞分裂素；RNAi；根系

干旱是制約糧食增產(chǎn)的主要原因，不僅持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，影響范圍廣，而且出現(xiàn)的頻率高，給農(nóng)業(yè)造成了嚴(yán)重的危害，威脅著國(guó)家糧食安全[1-3]，每年因干旱造成的損失達(dá)60～90億美元[4]。因此，如何更大限度地發(fā)揮作物自身的生命潛力和生產(chǎn)能力，提高作物適應(yīng)惡劣環(huán)境的能力及對(duì)有限資源的利用效率，成為應(yīng)對(duì)糧食危機(jī)的重要手段。根系作為植物最重要的營(yíng)養(yǎng)器官之一，其生理形態(tài)、數(shù)量、位置與分布等特征直接決定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝取及運(yùn)輸方式，進(jìn)而決定植物生長(zhǎng)模式，影響產(chǎn)量。剖析植物根系生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)理，運(yùn)用生物技術(shù)手段改良根系，是促進(jìn)糧食增產(chǎn)的必要途徑。

多項(xiàng)研究表明，植物生長(zhǎng)發(fā)育由遺傳控制，且受各種環(huán)境因素影響，同時(shí)也受內(nèi)源性植物激素調(diào)節(jié)。細(xì)胞分裂素(CTK)作為植物五大重要激素之一，是腺嘌呤的衍生物。當(dāng)?shù)?位氨基、第2位碳原子和第9位氨原子上的氫原子被取代時(shí)，則形成各種不同的CTK，其活性因側(cè)鏈的長(zhǎng)度和不飽和度等差異而有很大不同。CTK具有促進(jìn)細(xì)胞分裂、衰老和根分化等作用[5]，在種子萌發(fā)、根系生長(zhǎng)和葉綠體分化等眾多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要功能[6]。其中，CTK對(duì)植物根系生長(zhǎng)的影響主要表現(xiàn)在抑制主根伸長(zhǎng)上，外源施加CTK能抑制擬南芥主根的伸長(zhǎng)和側(cè)根的起始[7-9]。有研究表明，在超表達(dá)CTK氧化酶基因的轉(zhuǎn)基因植株中，內(nèi)源性CTK含量降低，而根系生長(zhǎng)得到增強(qiáng)，主根的延伸加快，抗旱能力增加[10-11]。

植物體內(nèi)CTK的合成主要依靠異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(IPT)進(jìn)行。IPT最先在根癌農(nóng)桿菌中得到鑒定[12]。IPTs由于催化的底物不同而分為兩類：一類是腺嘌呤磷酸-IPT(ATP/ADP-IPT)，另一類是tRNA-IPT。在擬南芥中，兩個(gè)tRNA-IPT編碼基因突變體中未能檢測(cè)出順式玉米素(cis-zeatin，cZ)，因此該類細(xì)胞分裂素基本都是由tRNA類IPT催化合成的。而ATP/ADP-IPT則完全參與了反式玉米素(trans-zeatin，tZ)和異戊烯基腺嘌呤(iP)的合成[13-14]。過(guò)量表達(dá)IPT基因的煙草植株出現(xiàn)根系發(fā)育明顯遲緩的現(xiàn)象[15]，說(shuō)明IPT基因的過(guò)量表達(dá)能抑制側(cè)根的形成[16]。

IPT基因在植物基因組中均以多同源拷貝的形式存在。其中擬南芥基因組含有9個(gè)IPT基因，7個(gè)ATP/ADP型及2個(gè)tRNA型。單個(gè)IPT基因缺失突變后對(duì)CTK的合成影響不大，至少缺失掉其中三個(gè)基因(AtIPT3,5,7)后，植株才表現(xiàn)出矮小單薄的地上組織表型[17]，說(shuō)明IPT各基因間有較強(qiáng)的功能互補(bǔ)性。目前就CTK合成代謝的分子遺傳學(xué)研究主要集中在雙子葉模式植物，而針對(duì)單子葉植物CTK編碼基因的認(rèn)知了解甚少。由于主要糧食作物多為單子葉植物，這些植物究竟是采取何種機(jī)制進(jìn)行CTK合成的，就成為本領(lǐng)域亟需解決的關(guān)鍵問(wèn)題。由于二穗短柄草與眾多谷類作物同屬早熟禾亞科，且與多個(gè)麥類作物有很好的親緣關(guān)系，以二穗短柄草為對(duì)象開展IPT基因的分子遺傳學(xué)研究成為更深層次認(rèn)知CTK合成、進(jìn)行作物根系改良的合理選擇。

二穗短柄草基因組共編碼10個(gè)IPT基因，相關(guān)功能未曾報(bào)道。本研究通過(guò)序列和進(jìn)化分析，對(duì)二穗短柄草各IPT基因的起源和分化進(jìn)行推測(cè)；并通過(guò)鑒定各IPT基因不同發(fā)育時(shí)期在不同組織中轉(zhuǎn)錄表達(dá)的異同，解析二穗短柄草各IPT基因在發(fā)育過(guò)程中的功能差異。此外，由于IPT基因拷貝數(shù)眾多且可能功能高度互補(bǔ)，依靠傳統(tǒng)單基因突變手段無(wú)法獲取有顯著表型的突變體[18]。故采用RNAi的方法，以各IPT基因共享的功能保守區(qū)為靶目標(biāo)，對(duì)目的基因在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行特異干擾，能夠同時(shí)高效地降解多個(gè)目標(biāo)基因，達(dá)到多基因功能缺陷的效果，造成內(nèi)源性細(xì)胞分裂素降低，使得根系生長(zhǎng)增強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)分析基因功能的目的。由于IPT基因在早熟禾亞科植物中高度保守，此研究同時(shí)也可為加快作物根系遺傳改良、培育抗旱型作物提供理論支持。

1材料與方法

1.1材 料

供試材料為二穗短柄草Bd21，由本實(shí)驗(yàn)室保存。表達(dá)載體Pcambia1301和農(nóng)桿菌EHA105由本實(shí)驗(yàn)室保存；RNAi的載體pUCCRNAi由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所儲(chǔ)成才研究員提供；RNA提取、cDNA合成試劑盒購(gòu)于TIANGEN(北京)公司；熒光定量試劑盒購(gòu)于Takara公司；引物由上海立菲生物技術(shù)有限公司合成。

1.2方 法

1.2.1二穗短柄草IPT基因序列的獲得及進(jìn)化分析

以擬南芥各IPT蛋白序列為查詢序列，通過(guò)tBLASTn程序在phytozome 10.3中的二穗短柄草數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)(http://phytozome. jgi. doe. gov/ pz/ portal. html)。繼而對(duì)獲得的候選蛋白序列進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域分析驗(yàn)證(http://pfam.xfam.org/)。擬南芥和二穗短柄草cDNA序列通過(guò)MAFFT程序(http:// mafft. Cbrc. jp/ alignment/ server/)進(jìn)行序列比對(duì)。比對(duì)序列進(jìn)而通過(guò)Genedoc 2.7.000(http://iubio. bio. indiana. edu/ soft/ molbio/ ibmpc/ genedoc-readme. html)進(jìn)行編輯。最終通過(guò)MEGA 6.06軟件進(jìn)行進(jìn)化分析。進(jìn)化分析采用Neighbor-joining方法，并以1 000次循環(huán)進(jìn)行計(jì)算及泊松分布進(jìn)行運(yùn)算。

1.2.2材料的培養(yǎng)及收集

將剝好的成熟二穗短柄草種子置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，在4 ℃下春化2 d，然后置于22 ℃光照培養(yǎng)箱(16 h光照/8 h黑暗)培養(yǎng)1周，待兩片葉子長(zhǎng)出后，將一部分幼苗插入漂浮板水培10 d，分別收集葉片和根部組織，剩余幼苗則移栽到培植土中，從第20天開始每隔10 d取1次葉片和根部組織，直至第50天。所取的材料均在液氮中速凍，并于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3二穗短柄草基因組總DNA及總RNA的提取

采用SDS法提取二穗短柄草葉片基因組總DNA。依照植物基因組RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取1.2.2中所保存的不同處理方式及其不同時(shí)期的根和葉片組織的總RNA，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，然后用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析

以1.2.3中得到的cDNA為模板，以二穗短柄草Actin基因?yàn)閮?nèi)參進(jìn)行qRT-PCR分析。qRT-PCR試驗(yàn)操作在BIO-RAD CFX實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，其反應(yīng)體系及程序參照TaKaRa公司SYBR○RPremix ExTaqTM(Perfect Real Time)試劑盒說(shuō)明書。試驗(yàn)設(shè)定3次重復(fù)，反應(yīng)完成后進(jìn)行熔解曲線分析，然后按照2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。具體引物信息見(jiàn)表1。

1.2.5以ATP/ADP型IPT基因?yàn)楦蓴_靶基因的RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建

基于序列比對(duì)結(jié)果，截取各ATP/ADP型IPT基因編碼區(qū)相對(duì)保守的區(qū)域，以二穗短柄草Bradi1g619601.1序列為參考模板設(shè)計(jì)引物，并在正反向引物兩端分別引入BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)(表1)。以生長(zhǎng)25 d的二穗短柄草葉片DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。獲取的目的片段經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證序列準(zhǔn)確性后，分別被正反向插入沉默載體pUCCRNAi中。通過(guò)PstI酶切回收后，將含有正反向重復(fù)的表達(dá)片段插入雙元表達(dá)載體pCambia1301中。

1.2.6RNAi表達(dá)載體轉(zhuǎn)化二穗短柄草

將ATP/ADP-IPTRNAi的表達(dá)載體及pCambia1301空載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，再通過(guò)農(nóng)桿菌侵染二穗短柄草愈傷，并誘導(dǎo)成苗。利用潮霉素(Hgy)引物通過(guò)PCR法檢測(cè)T0代轉(zhuǎn)化植株。

2結(jié)果與分析

2.1二穗短柄草中IPT基因的序列及進(jìn)化分析

以已知擬南芥中IPT蛋白序列進(jìn)行BLAST搜索，獲取二穗短柄草基因組中全部IPT基因序列。

表1　本研究所用引物

下劃線部分表示酶切位點(diǎn)；HPT表示潮酶素抗性基因

The underlined parts represent restriction enzyme cutting sites；HPTrepresents hygromycin resistance gene

通過(guò)序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在擬南芥(AtIPT1/3/4/5/6/7)及二穗短柄草(Bradi1g04580/Bradi1g29490/Bradi1g54060/Bradi2g13410/Bradi2g17400/Bradi2g46920/Bradi4g27860)中，絕大多數(shù)ATP/ADP型IPT基因不含內(nèi)含子；而tRNA型的IPT基因均有9～10個(gè)內(nèi)含子，且內(nèi)含子和外顯子分布形態(tài)非常相似。前人研究已表明，在擬南芥中AtIPT9和AtIPT2均屬tRNA型IPT基因[17]，從進(jìn)化樹的結(jié)構(gòu)(圖1)可以看出Bradi1g29490及Bradi1g70200分別與擬南芥的兩個(gè)同源基因形成單系群，且各單系群中均只有一個(gè)基因拷貝得到保留。所以，這些基因的共同祖先可能早在單雙子葉植物分離前既已出現(xiàn)。其中，AtIPT9/Bradi1g29490所在的分支可能形成的更早，可能代表著IPT祖先基因的功能。

與之形成對(duì)比的是ATP/ADP類型IPT基因，采用了不同的進(jìn)化方式形成。擬南芥與二穗短柄草在物種形成分離后，各自獨(dú)立經(jīng)歷了若干次的基因復(fù)制事件，從而形成了多拷貝的模式，也可能進(jìn)一步造成了IPT基因間較強(qiáng)的功能互補(bǔ)性。鑒于ATP/ADP型IPT基因與AtIPT2所在分支的進(jìn)化關(guān)系，極有可能AtIPT2/Bradi1g70200的祖先基因是ATP/ADP型IPT基因的供體基因。

2.2二穗短柄草IPT基因組織表達(dá)譜分析

擬南芥的研究表明，在物種形成分離后，經(jīng)過(guò)若干次獨(dú)立基因復(fù)制事件，ATP/ADP型IPT基因形成了多拷貝。但是，遺傳學(xué)結(jié)果表明，各IPT基因的單突變不能造成植株的明顯異常，說(shuō)明IPT基因的基本功能較為相似且存在較強(qiáng)的互補(bǔ)性。然而不同的突變組合造成了不同的植物表型，說(shuō)明IPT基因間可能也存在功能差異。為了解析各IPT基因?qū)Χ攵瘫莅l(fā)育的時(shí)空調(diào)控作用，本研究采用qRT-PCR的方式對(duì)各IPT基因在不同發(fā)育階段、不同組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。結(jié)果(圖2、圖3)表明，二穗短柄草各IPT基因具有一定的組織表達(dá)特異性，根部表達(dá)量普遍低于葉部。ATP/ADP-IPTs中只有Bd1g15770表達(dá)量較高，其他基因的表達(dá)量極低，說(shuō)明二穗短柄草中大部分ATP/ADP型IPT基因要么處于轉(zhuǎn)錄不活躍狀態(tài)，要么只在特定時(shí)間、組織瞬時(shí)表達(dá)。而tRNA-IPTs(Bd4g29490、Bd1g70200)在根部和葉部的表達(dá)量都很高，說(shuō)明這兩個(gè)基因可能在二穗短柄草細(xì)胞分裂素合成過(guò)程中發(fā)揮著駐家基因的重要作用。

圖1　IPT基因的系統(tǒng)發(fā)生分析

圖2　　　二穗短柄草IPT基因在根部

2.3ATP/ADP-IPTRNAi沉默載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化

擬南芥的研究表明，AtIPT3/5/7在根系中表達(dá)量很高，三個(gè)基因同時(shí)缺失的情況下植物發(fā)育異常，表明這三個(gè)基因?qū)?xì)胞分裂素的合成起主要作用。tRNA型IPT在細(xì)胞分裂素合成中也有一定作用，但主要是在增生組織中表達(dá)[19]。因此，挑選與AtIPT3/5/7同源性較高的基因作為靶基因進(jìn)行沉默干擾是研究二穗短柄草IPT基因?qū)Ω底饔玫氖滓x擇。基于序列比對(duì)結(jié)果，篩選合適的保守序列作為靶區(qū)域設(shè)計(jì)引物，利用PCR擴(kuò)增得到了570 bp的目的靶片段(圖4A)，將目的片段插入沉默載體并進(jìn)行了酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖4B所示，說(shuō)明ATP/ADP-IPTRNAi沉默載體構(gòu)建成功。通過(guò)農(nóng)桿菌侵染幼胚愈傷組織培養(yǎng)方式，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。提取T0代植株DNA，并用Hyg引物檢測(cè)，擴(kuò)增出374 bp的片段(圖5)，說(shuō)明這些植株為陽(yáng)性植株，可用于后續(xù)根系表型觀察。

圖3　　　二穗短柄草IPT基因在葉部

A圖中M表示DL2000；B圖中M、1和2分別表示DL5000、XhoI和BamHI雙酶切pUCCRNAi載體及PstI酶切pUCCRNAi載體

M in Fig.A represents DL2000;M,1 and 2 in Fig.B represent DL5000,double enzyme digestion of pUCCRNAi withXhoI andBamHI,and single enzyme digestion of pUCCRNAi withPstI,respectively

圖4二穗短柄草IPT基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果(A)

及RNAi表達(dá)載體的酶切鑒定結(jié)果(B)

Fig.4PCR product ofIPTgene (A) and identification

results of restriction enzyme digestion ofIPT-

RNAi(B) inBrachypodiumdistachyon

M:DL2000;1～3:轉(zhuǎn)化植株

M:DL2000;1-3:Transgenic plants

圖5RNAi轉(zhuǎn)基因植株的PCR驗(yàn)證

Fig.5Identification of transgenic plants by PCR

2.4二穗短柄草轉(zhuǎn)IPT-RNAi植株的表型分析

與空載體轉(zhuǎn)基因植株相比，二穗短柄草轉(zhuǎn)IPT-RNAi的陽(yáng)性植株根系有異常表現(xiàn)。剛剛長(zhǎng)出幼根的二穗短柄草的根毛數(shù)量明顯增多且根毛密而長(zhǎng)(圖6A)。生長(zhǎng)一周后，根毛差異變得不明顯，但是基因植株的初生根顯著增長(zhǎng)(圖6B)。說(shuō)明在根系早期發(fā)育階段，二穗短柄草ATP/ADP型IPT基因起到了一定的調(diào)節(jié)作用。

A:幼根根毛；B:生長(zhǎng)一周的根

A:Young root hair; B:Root after a week growth

圖6二穗短柄草轉(zhuǎn)IPT-RNAi的陽(yáng)性

植株與對(duì)照根系表型比對(duì)

Fig.6Root phenotype comparison between the

positiveBdIPT-RNAi plant and the control

3討 論

本研究通過(guò)對(duì)二穗短柄草IPT基因的序列、進(jìn)化、表達(dá)及功能分析表明，IPT基因在單子葉模式植物二穗短柄草中可能采取了與雙子葉模式植物擬南芥不同的工作模式對(duì)根系發(fā)育生長(zhǎng)進(jìn)行調(diào)控。

擬南芥和二穗短柄草中大部分ATP/ADP型IPT基因沒(méi)有內(nèi)含子，可能是由于逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座的方式形成。逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座是由于某個(gè)前體基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA，在某些特定環(huán)境下，由于某種原因發(fā)生了逆轉(zhuǎn)錄，使形成的cDNA隨機(jī)插入基因組中并得到整合。這種方式形成的基因沒(méi)有內(nèi)含子，且由于缺乏上游的調(diào)控序列往往在基因組中呈沉默狀態(tài)。由熒光定量PCR結(jié)果也進(jìn)一步表明，大部分二穗短柄草ATP/ADP型IPT都呈現(xiàn)極低的轉(zhuǎn)錄水平。部分基因所表現(xiàn)出的略高表達(dá)狀態(tài)可能是在基因形成后，在進(jìn)化過(guò)程中啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)域逐漸通過(guò)序列變異而產(chǎn)生了部分轉(zhuǎn)錄活性。但是相對(duì)可能繼承了IPT祖先基因功能的tRNA型IPT2/IPT9分支的基因而言，ATP/ADP-IPTs的表達(dá)量是極低的。雖然擬南芥中tRNA型IPT被認(rèn)為多在分生組織中表達(dá)來(lái)控制細(xì)胞分裂素的形成，也發(fā)現(xiàn)AtIPT3/5/7可能是在控制擬南芥根及地上部分的發(fā)育中起主導(dǎo)作用[17]，但由于擬南芥和二穗短柄草ATP/ADP-IPTs是在物種分化后，各自進(jìn)行獨(dú)立基因復(fù)制所形成的，所以這兩個(gè)物種中的此類基因并無(wú)絕對(duì)的對(duì)應(yīng)關(guān)系。有可能發(fā)生的機(jī)制是兩個(gè)物種的ATP/ADP-IPTs基因分別獨(dú)立進(jìn)化，部分?jǐn)M南芥ATP/ADP-IPTs(如AtIPT3/5/7)能夠產(chǎn)生必要的表達(dá)活性，從而在發(fā)育階段起了關(guān)鍵作用。而二穗短柄草未能形成類似的機(jī)制，從而導(dǎo)致絕大部分ATP/ADP-IPTs依然處于缺乏顯著轉(zhuǎn)錄調(diào)控的狀態(tài)，不能高效催化合成細(xì)胞分裂素。由于細(xì)胞分裂素在植物生長(zhǎng)發(fā)育各階段都有重要作用，在自然選擇壓力下，tRNA型IPTs則在二穗短柄草各發(fā)育階段起了主導(dǎo)作用。對(duì)于IPT各基因的具體形成分化可能需要在未來(lái)使用更多的物種序列來(lái)進(jìn)行精細(xì)判斷。

從系統(tǒng)發(fā)生樹來(lái)看，在單雙子葉分化前，應(yīng)該有兩個(gè)IPT祖先基因。其中一個(gè)進(jìn)化成IPT9分支，并在各物種中以單拷貝的形式進(jìn)行保留，可能代表了祖先基因的部分功能。另一個(gè)基因則形成了IPT2及ATP/ADP-IPTs所在的大分支。IPT2分支在各物種中也以單拷貝的形式存在，結(jié)合其序列特征，也應(yīng)該是繼承了祖先的部分功能。IPT2及IPT9與細(xì)菌中部分tRNA修飾酶編碼基因有一定的同源性，因此不難理解tRNA類型的IPT基因代表著一類古老的基礎(chǔ)性的功能，在維持植物基本生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮著作用。由于ATP/ADP-IPTs沒(méi)有內(nèi)含子，該分支形成的機(jī)制極有可能是發(fā)生在單雙子葉分離階段，IPT2類型的祖先基因的轉(zhuǎn)錄子因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座機(jī)制形成了ATP/ADP-IPTs型的祖先基因，繼而得到保留以及經(jīng)歷了物種分離后各自的獨(dú)立復(fù)制和進(jìn)化事件。也因此可以推論出，IPT2基因可能是ATP/ADP-IPTs的供體基因。

此外，由于有證據(jù)顯示擬南芥可能在進(jìn)化階段經(jīng)歷了起碼三次全基因組復(fù)制事件，最近的一次是發(fā)生在4 000-7 000萬(wàn)年前單雙子葉分離后。也就是說(shuō)理論上講，AtIPT2和AtIPT9應(yīng)該至少各有2個(gè)拷貝的，但是單雙子葉中這兩個(gè)分支分別只有一個(gè)拷貝得到了保留，說(shuō)明IPT基因所參與的生物學(xué)過(guò)程是對(duì)劑量敏感的。多余的拷貝會(huì)由于自然選擇的結(jié)果從基因組中刪除。由于IPT基因的功能是催化合成細(xì)胞分裂素，一類在植物各發(fā)育階段起重要作用的激素，尤其是在芽萌發(fā)等關(guān)鍵階段，促使細(xì)胞分化。因此IPT基因在植物發(fā)育階段是扮演一個(gè)精細(xì)調(diào)控的角色。

雖然我們認(rèn)為從基因表達(dá)角度講，二穗短柄草中tRNA-IPTs比ATP/ADP-IPTs可能發(fā)揮了更重要作用。但是二穗短柄草轉(zhuǎn)IPT-RNAi的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄受到干擾的ATP/ADP-IPTs基因依然能夠影響植物的發(fā)育。其中可能的解釋為ATP/ADP-IPTs在局部、瞬時(shí)調(diào)控發(fā)揮作用，對(duì)特定細(xì)胞特殊時(shí)期發(fā)育有影響。而tRNA-IPTs更多的是起一個(gè)“駐家基因”的效果，對(duì)大部分細(xì)胞分裂素的合成起主導(dǎo)作用，從而保證植物生長(zhǎng)階段能夠在合適時(shí)間、組織器官中有該激素的分布。

轉(zhuǎn)ATP/ADP-IPTRNAi的二穗短柄草陽(yáng)性植株根系生長(zhǎng)明顯得到了增強(qiáng)，可能的原因是由于參與合成細(xì)胞分裂素的ATP/ADP-IPTs表達(dá)量減少，造成內(nèi)源性細(xì)胞分裂素的降低，尤其是反式玉米素的減少。研究表明，通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)源性細(xì)胞分裂素的降解能夠有效促進(jìn)植物根系發(fā)育。本研究也同時(shí)表明，減少細(xì)胞分裂素的合成也能有效的增強(qiáng)植物根系。根系對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育有重要意義，通過(guò)基因調(diào)控手段使根系強(qiáng)壯，根毛增多來(lái)增強(qiáng)植物抗旱性是應(yīng)對(duì)干旱脅迫的一個(gè)有效手段。麥類作物作為主要糧食之一，增強(qiáng)其抗旱性對(duì)提高糧食產(chǎn)量，維護(hù)糧食安全至關(guān)重要。二穗短柄草與早熟禾亞科作物親緣關(guān)系較近，且IPT基因在早熟禾亞科植物中都相對(duì)比較保守，研究解析IPT對(duì)根系的影響，并通過(guò)遺傳手段改良基因，則成為有效提高作物抗旱性的重要舉措。

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Evolutionary Analysis and Functional Characterizations ofIPTGenes inBrachypodiumdistachyon

ZHOU Xue,LI Jia,LI Yanhua,LI Tingting,WANG Zhonghua,QUAN Li

(College of Agronomy of Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China)

Abstract:Cytokinin (CTK) is one of the most important plant hormones,causing cell divisions and promoting shoot emergence and development. In addition,CTK plays a negative regulatory role in root growth by engaging through the cell differentiation process within root meristem. In plants,CTK is primarily synthesized by a group of isopentenyl transferases (IPTs) that are encoded by multiple homologous IPT genes. To figure out the evolutionary origin of IPT genes,sequence comparisons and phylogenetic analysis were carried out using full length IPT protein sequences from Arabidopsis and Brachypodium distachyon. Moreover,qPCR experiment was conducted to investigate the transcription levels of each IPT gene in Brachypodium distachyon,providing an overall picture of their functional divergences. To further look into their biological functions,an RNAi approach was employed targeting the conserved coding regions of these IPT genes. The results showed that,tRNA-IPT is inferred to be the ancestral gene of IPT and the gene donor of ATP/ADP-IPT. Phenotype resulted from the suppressed expressions of IPT genes allowed insightful understandings of their physiological functions. It was found that IPT genes were preferentially expressed in various tissues. Although most of the ATP/ADP-IPTs were low in the transcription level,the tRNA-IPTs were highly expressed in both root and leaf,suggesting that the tRNA type IPTs might play a predominant role during Brachypodium distachyon root development,which was different from that in Arabidopsis. IPT-RNAi plants exhibited enhanced root system phenotypes.It was inferred ATP/ADP-IPTs played a regulatory role in the early development stage of root in Brachypodium distachyon.Because IPT genes are fairly conserved among Pooideae species,our research may provide a theoretical base for the genetic improvement of root in Triticeae crops,thereby advancing their drought tolerance.

Key words:Brachypodium distachyon; IPT gene; Cytokinin; RNAi; Root system

中圖分類號(hào)：S512.1；S330

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-1041(2016)03-0273-08

通訊作者：權(quán) 力(E-mail:lquan@nwafu.edu.cn)

基金項(xiàng)目：陜西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014JQ3095)；陜西省遺傳育種新技術(shù)團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2014KCT-25)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(Z109021426)

收稿日期：2015-11-05修回日期：2015-12-22

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-03-01

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160301.1338.006.html

第一作者E-mail：694180602@qq.com