榛子產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌Penicillium aurantiogriseum中GGPP合酶基因的克隆與表達

劉洪偉， 楊艷芳， 李艷艷， 王　帥， 邱德有

( 林木遺傳育種國家重點實驗室， 中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所， 北京 100091 )

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榛子產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌Penicillium aurantiogriseum中GGPP合酶基因的克隆與表達

劉洪偉， 楊艷芳， 李艷艷， 王帥， 邱德有*

( 林木遺傳育種國家重點實驗室， 中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所， 北京 100091 )

摘要：牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶是產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌紫杉醇合成下游途徑中的關鍵步驟之一，在榛子產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌中進行紫杉醇生物合成研究時首先要確認GGPP合酶的存在。該研究通過RT-PCR方法克隆得到了榛子產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌Penicillium aurantiogriseum中GGPP合酶基因PaGGPPS (GenBank登錄號為KM881430)的cDNA 開放閱讀框 (Open reading frame， ORF)。利用生物信息學方法，我們分析了該基因的序列，并對其編碼的氨基酸序列進行了預測。結果發(fā)現(xiàn)該基因ORF長度為1 113 bp，預計蛋白分子量為40.98 kD，等電點為6.168， 表明該蛋白呈酸性。對其進行親疏水性分析發(fā)現(xiàn)肽鏈整體呈現(xiàn)為親水性。PaGGPPS的主要二級結構元件為α-螺旋，并且包含一個異戊二烯類化合物合酶功能域。對榛子產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌與其他物種的GGPPS進行氨基酸同源性分析，發(fā)現(xiàn)其與婁地青霉、曲霉菌和費氏新薩托菌的一致性較高，分別為94%、76%和76%。進化樹分析表明來自動物、真菌和酵母的GGPPS聚為一類，來自植物的GGPPS聚為一類，其中榛子產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的GGPPS和青霉菌的進化關系最近，與植物的GGPPS的進化關系最遠。對其進行基礎生物信息學分析后，我們構建了原核表達載體，成功誘導其表達并得到可溶性蛋白。該研究結果為下一步深入研究GGPPS基因在內(nèi)生真菌Penicillium aurantiogriseum紫杉醇合成途徑中的作用及和構建高產(chǎn)紫杉醇基因工程菌株奠定了一定的基礎。

關鍵詞：內(nèi)生真菌， GGPP合酶， 原核表達， 基因克隆， 紫杉醇

紫杉醇是Wall(1971)從短葉紅豆杉(Taxusbrevifolia)中分離到的二萜，它對乳腺癌等多重癌癥具顯著療效，已被廣泛應用在臨床上(Craag et al， 1993)。紅豆杉生長緩慢，資源有限，紫杉醇含量低(占樹皮干重的0.01%～0.02%)，所以資源與開發(fā)的矛盾相當突出。Strobel et al(1993)從短葉紅豆杉分離到產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌Taxomycesandreanae，并證明它能合成納克級的紫杉醇。此后，人們陸續(xù)從西藏紅豆杉、東北紅豆杉等紅豆杉中分離到產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌(Metz et al， 2000；Kumaran & Hur， 2009；Sreekanth et al， 2009；Liu et al， 2009；Zhang et al， 2009)，也有從內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)其他抗癌物質(李良群等，2011)。還有從松樹Wollemianobilis(Strobel et al， 1997)、榛子Corylusavellana(Hoffman et al， 1998)、落羽杉Taxodiumdistichum(Li et al， 1996)、羅漢松Podocarpusforrestii(孫端方等，2008)、香櫞Citrusmedica(Kumaran et al， 2008)等植物中分離到產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌。它們分屬青霉屬(Penicillium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)、樹狀多節(jié)孢(Noduzisporium)、鏈格孢菌(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、黑孢霉屬(Periconiasp.)、莖點霉屬(Phomopsis)、瘤座菌屬(Tuberculariasp.)等。這些產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的發(fā)現(xiàn)為紫杉醇的生產(chǎn)又提供了一條途徑。在多種紫杉醇生產(chǎn)途徑中，最佳的選擇是進行植物細胞和內(nèi)生真菌大規(guī)模培養(yǎng)，但至今植物細胞中紫杉醇產(chǎn)量不高且不穩(wěn)定(Tabata， 2004；Pan et al， 2000)。與紅豆杉培養(yǎng)細胞相比，內(nèi)生真菌大規(guī)模培養(yǎng)的優(yōu)勢更為明顯，但內(nèi)生真菌紫杉醇產(chǎn)量還不高，仍需從優(yōu)化發(fā)酵條件和改造紫杉醇合成通路等方面進一步提高(康冀川等，2013)。

紅豆杉細胞紫杉醇生物合成基因已有報道(Walker & Croteau， 2001)。從FPP和IPP開始到紫杉醇是由20個蛋白所催化完成，通路第一步在GGPP合酶催化下完成。GGPP合酶即牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase， geranylgeranyl diphosphate synthase， GGPPS )，又稱香葉基香葉基焦磷酸合酶(化文平等，2014)。它的主要功能為催化3分子異戊烯基焦磷酸 (Isopentenyl diphosphate， IPP ) 和1分子法尼基焦磷酸(Farnesyl diphosphate， FPP )縮合生成20碳的牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(Geranylgeranyl pyrophosphate， GGPP )，可以為赤霉素類、二萜類等物質骨架結構的合成提供起始前體物(Kojima et al，2000)。目前已在多個物種中開展了該基因的克隆和功能分析(化文平等，2014;王歆等，2012)。與紅豆杉相比，內(nèi)生真菌紫杉醇生物合成的研究還很少。在內(nèi)生真菌中，GGPP合酶作為紫杉醇合成途徑下游的第一個酶，有必要最先鑒定闡明。本研究以從榛子中分離到的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌Penicilliumaurantiogriseum為材料，在對其基因組測序(Yang et al， 2014)得到的數(shù)據(jù)基礎上，展開了該內(nèi)生真菌GGPPS基因cDNA的克隆、原核表達及純化的研究，為下一步深入研究該內(nèi)生真菌GGPPS基因的作用和構建高產(chǎn)紫杉醇基因工程菌株提供了基礎。

1材料與方法

1.1 材料

內(nèi)生真菌PenicilliumaurantiogriseumNRRL 62431是由Angela Hoffman教授從美國俄勒岡州的奧羅拉市的榛子(Corylusavellana)中分離得到并贈送的。克隆載體pUC-19，及大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)plysS均是從康為世紀購得。表達載體pET30a是由山東省果樹研究所院陳新老師贈送。

1.2 真菌RNA的提取

在PDA培養(yǎng)基平板上接種真菌菌種，1周后從平板上挑菌接種到200 mL PDA液體培養(yǎng)基中，并在28 ℃搖床中200 r·min-1培養(yǎng)3 d，8 000 × g離心收集菌絲，液氮保存。

使用天恩澤公司的真菌RNAout試劑盒，并按照其說明書步驟提取真菌總RNA。然后使用TAKARA公司的PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit按照其說明書進行cDNA合成。

1.3 基因全長克隆與序列分析

通過對真菌基因組(Yang et al，2014)進行分析，比對找到GGPPS基因的DNA序列，通過和其他GGPPS序列進行比較找出其ORF，并設計上游引物PaGGPPS1-1：ATGAATTCAAACCCCTTTCAAC，和下游引物PaGGPPS2-1：CTAGTGCGCATTGGAATCCGAC，交由中美泰和公司合成。使用KAPA公司的HIFI 熱啟動高保真酶進行擴增，PCR條件如下：95 ℃預變性 3 min； 98 ℃ 20 s，65 ℃ 15 s， 72 ℃ 1 min，共 32 個循環(huán)； 72 ℃ 10 min。

將PCR得到的片段進行膠回收，然后連接到pUC-19克隆載體上送到中美泰和公司進行測序驗證。利用EditSeq軟件對序列進行初步分析，之后使用在線分析軟件ProtScale(http://www.expasy.ch/tools/protscale.html)和SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?GENOMIC=1)和 SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat. pl?page /NPSA/npsa_sopma. html)對序列進行進一步分析。

1.4 同源性分析和系統(tǒng)進化樹的構建

使用NCBI的blastx對PaGGPPS進行比對，找出同源性高的序列。用GenBank數(shù)據(jù)庫進行PaGGPPS氨基酸序列搜索，找到斑馬魚(Daniorerio， NP_956329.1 )、果蠅(Drosophilamelanogaster， NP_523958.2)、小鼠(Musmusculus， NP_034412.1)、人類(Homosapiens， NP_001032354.1)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis， XP_455003.1)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae， NP_015256.1)、棉病囊菌(Ashbyagossypii， NP_984623.1)、稻瘟病菌(Magnaportheoryzae， XP_003718242.1)、脈孢菌(Neurosporacrassa， XP_960695.2)、青霉菌(Penicilliumroqueforti， CDM28596.1)、玉米(Zeamays， ABQ85646.1)、擬南芥(Arabidopsislyrata， XP_002884145.1)、曼地亞紅豆杉(Taxus×media， AAS67008.1)和銀杏(Ginkgobiloba， AAQ72786.1)14個物種的GGPPS的氨基酸序列，使用軟件ClustalX和MEGA4.1對這15個GGPPS進行多序列比對并構建分子進化樹。

1.5 表達引物的設計和載體構建

使用軟件Primer 5分析克隆到的GGPPS基因序列的以及原核表達載體pET30a的酶切位點，分別選用KpnI和NotI兩個酶切位點(下劃線處標出)，并設計引物，上游引物為G- pET -1-1：CGGGGTACCATGAATTCAAACCCCTTTCAAC；下游引物為G-pET-2-1：TTGCGGCCGCCTAGTGCGCATTGGAATCCGAC。

以含有GGPPS的pUC-19質粒為模板，使用KAPA公司的HIFI 熱啟動高保真酶進行PCR擴增，PCR條件如下：95 ℃預變性3 min； 98 ℃ 20 s，65 ℃ 15 s， 72 ℃ 1 min，共 5 個循環(huán)；98 ℃ 20 s，68 ℃ 15 s， 72 ℃ 1 min，共28個循環(huán)； 72 ℃ 10 min。

將得到的PCR產(chǎn)物(用Axygen公司的PCR產(chǎn)物回收試劑盒進行回收)，和表達載體分別使用NEB公司的酶進行KpnI和NotI雙酶切。酶切2 h后進行純化，并用NEB的T4 DNA連接酶16 ℃連接6 h。轉化大腸桿菌DH5α，倒置37 ℃過夜培養(yǎng)，菌落PCR篩選陽性菌株。將陽性菌株送中美泰和公司測序驗證，并將陽性菌株擴大培養(yǎng)，使用Axygen質粒小提試劑盒提取質粒，進行雙酶切鑒定。

1.6 重組蛋白的原核表達

將酶切鑒定的重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3) plysS菌株。篩選出陽性菌株進行擴大培養(yǎng)，并保存部分菌株。

取新鮮菌液1 mL到50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床在200 r·min-1下培養(yǎng)3 h至菌液OD為0.5～0.6時，再調至20 ℃繼續(xù)培養(yǎng)1 h。向菌液中加IPTG至終濃度為0.2 mmol·L-1，進行誘導表達，繼續(xù)在20 ℃培養(yǎng)8 h。收集菌液，4 000×g離心10 min收集菌體。加入5 mL康為世紀公司的細菌蛋白提取試劑，充分混勻后500 W超聲2 min裂解細菌，直至菌液清亮。12 000×g離心10 min，收集上清并進行SDS-PAGE電泳，鑒定蛋白表達是否可溶。

1.7 重組蛋白的純化

使用康為世紀公司的Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒(可溶型蛋白)進行重組蛋白的純化，主要步驟按照其說明書進行，在清洗雜蛋白過程中，添加一次10柱體積的50 mmol·L-1咪唑洗脫一次，后續(xù)步驟和說明書相同。最后將純化的蛋白進行SDS-PAGE電泳進行鑒定。

2結果與分析

2.1 PaGGPPS基因的克隆和序列分析

以真菌的cDNA為模版，通過PCR得到一段1 113 bp的ORF片段(圖1)，并將該片段提交GenBank，得到登錄號：KM881430。命名該基因為PaGGPPS。

用EditSeq軟件分析發(fā)現(xiàn)ORF可編碼370個氨基酸，預計表達蛋白分子量約為40.98 kD，預測蛋白等電點為6.168。使用在線預測軟件ProtScal (Kyce & Doolittle， 1982)，設定參數(shù)為默認，分析該蛋白的親疏水性，預測結果顯示其整體為親水性蛋白。用結構域預測工具SMART (Schultz et al， 1998)對其氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因包含類異戊二烯類化合物合酶特有的一個polyprenyl_synt特征結構域。用在線軟件SOPMA (Geourjon & Deléage， 1995)進行二級結構預測，結果顯示該GGPPS蛋白由185個氨基酸組成的20個α- 螺旋，23個氨基酸組成的8延伸鏈，18個氨基酸組成的 10 個β-轉角和144個氨基酸組成的20個隨意卷曲構成，它們分別占50%、6.22%、4.86%和38.92%。

圖 1　榛子內(nèi)生真菌Penicillium aurantiogriseum NRRL 62431 GGPPS基因的PCR電泳圖　M. DL 5 000 分子標記； 1. PCR產(chǎn)物。下同。Fig. 1　Agarose gel electrophoresis analysis of PaGGPPS gene fragment in Penicillium aurantiogriseum NRRL 62431M. DL 5 000 Marker； 1. PCR product. The same below.

2.2 同源性及系統(tǒng)演化分析

通過NCBI的blastx對PaGGPPS氨基酸序列在NCBI上進行同源性比對， 結果表明榛子內(nèi)生真菌的PaGGPPS氨基酸序列與婁地青霉(Penicilliumroqueforti)、曲霉菌(Aspergillusclavatus)、費氏新薩托菌(Neosartoryafischeri)、絲衣霉菌(Byssochlamysspectabilis)、黃絲曲霉菌(Talaromycesstipitatus)、副球孢子菌(Paracoccidioides)、夾膜組織胞漿菌(Ajellomycescapsulatus)、巴西芽生菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)和球孢子菌(Coccidioidesimmitis)等菌的GGPPS氨基酸序列有較高的同源性， 分別為94%、76%、76%、76%、71%、71%、71%、71%、70%。我們從NCBI上下載了一些物種的GGPPS，并用ClustalX(Thompson et al，1997) 和 MEGA 4.1 (Tamura et al， 2007) 對榛子內(nèi)生真菌的和下載的PaGGPPS氨基酸序列進行多序列比對， 構建系統(tǒng)進化樹，采用 default 參數(shù)， 自檢舉1 000次， 結果如圖2所示。從進化樹中可以看出，榛子內(nèi)生真菌的GGPPS和青霉菌的進化關系最近；幾種真菌的GGPPS和動物的GGPPS的進化關系比酵母的更近，而與幾種植物的GGPPS的進化關系最遠。

圖 2　GGPPS蛋白系統(tǒng)進化分析　Fig. 2　Phylogenetic analysis of GGPPS proteins

2.3 表達載體pET-30a-PaGGPPS的構建及鑒定

將轉化pET-30a-PaGGPPS表達載體的菌株進行PCR鑒定，鑒定結果為陽性。比對測序結果表明，PaGGPPS基因片段已成功連接到表達載體。KpnI和NotI雙酶切鑒定重組質粒，重組質粒可以成功切出一個1 100 bp左右的插入片段和一個大于5 000 bp的載體片段，如圖3所示。

圖 3　重組質粒pET-30a-PaGGPPS的雙酶切鑒定Fig. 3　Double digested identification of recombinant plasmid pET-30a-PaGGPPS

圖 4　PaGGPPS 在大腸桿菌中表達　M. 蛋白分子量標準; 1. PaGGPPS重組菌裂解后上清; 2. PaGGPPS 重組菌裂解后沉淀。Fig. 4　PaGGPPS express in Escherichia coli　M. Protein Marker standard; 1. Products of recombinant bacteria of PaGGPPS protein in supernatant; 2. Products of recombinant bacteria of PaGGPPS protein in precipitate.

2.4 重組蛋白的可溶性鑒定

重組菌株在20 ℃經(jīng)0.2 mmol·L-1IPTG誘導表達8 h后，收集菌體并裂解，上清液進行SDS-PAGE電泳驗證，結果發(fā)現(xiàn)重組蛋白在51 kD左右得到表達，并得到了良好的可溶性表達，如圖4所示。

2.5 重組蛋白純化結果

經(jīng)試劑盒純化后，得到了較高純度的重組GGPPS蛋白。經(jīng)SDS-PAGE檢測顯示，重組GGPPS蛋白純化的效果良好，得到較高濃度的單一條帶，如圖5所示。

圖 5　重組PaGGPPS 蛋白純化產(chǎn)物Fig. 5　Purification product of PaGGPPS recombine protein

3討論

目前已從不同的宿主植物中分離出了大量的產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌(馬玉超等，2003)，但對這些內(nèi)生真菌的紫杉醇合成通路研究并不多見。GGPP是二萜類化合物合成的前體物質，而GGPPS催化IPP和FPP縮合成GGPP，是GGPP合成途徑中的關鍵酶，在植物次生代謝中，處于代謝分支點前體的代謝方向受其調控(Croteau， 1998)。Aharoni et al(2003)和Han et al(2006)通過在擬南芥細胞中過表達GGPPS發(fā)現(xiàn)，擬南芥細胞中GGPP的量制約著萜類在其細胞內(nèi)的合成，GGPP合成所需要的GGPPS在初級水平上對二萜類化合物的合成起著調節(jié)作用。因此，要提高內(nèi)生真菌生產(chǎn)紫杉醇的能力，在合成通路上，最先需要研究GGPPS。本研究的GGPPS和青霉菌的進化關系最近，與其他真菌的進化關系也很近，可能是真菌類的GGPPS進化很保守；而與植物和動物的GGPPS分別屬于不同的亞類，可以初步判斷真菌和植物之間沒有GGPPS基因的水平基因轉移，植物和真菌的萜類合酶是否也是不同進化來源？榛子(或紅豆杉)與其內(nèi)生真菌的紫杉烷類化合物的合成能力是否分別進化得到？這些都為后續(xù)需要研究的問題。

本研究完整克隆出內(nèi)生真菌PenicilliumaurantiogriseumNRRL 62431的GGPPS基因的完整ORF序列，并用生物信息學預測和分析了PaGGPPS的氨基酸序列、理化性質、疏水性/親水性、功能結構域和二級結構，這為后面的原核表達提供了一定的理論參考依據(jù)。通過預測，PaGGPPS蛋白的等電點為6.168，在進行原核表達時，調節(jié)培養(yǎng)基的pH值使其和重組蛋白的等電點不同，從而可以增加表達的重組蛋白的可溶性。成功構建原核表達載體后，轉化大腸桿菌進行誘導表達，通過低溫誘導，成功表達出可溶性的蛋白，并通過試劑盒進行了純化。這些工作都為下一步深入研究該內(nèi)生真菌的紫杉醇合成途徑中此基因的作用和構建高產(chǎn)紫杉醇基因工程菌株提供了一定的基礎。

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Cloning and expression of the GGPP synthase gene from the paclitaxel-producing endophytic fungus

(Penicilliumaurantiogriseum) inCorylusavellanaLIUHong-Wei，YANGYan-Fang，LIYan-Yan，WANGShuai，QIUDe-You*

( State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding， Research Institute of Forestry，Chinese Academy of Forestry，Beijing100091，China)

Abstract:Geranylgeranyl diphosphate synthase is one of the key enzymes in taxol synthesis pathway in paclitaxel-producing endophytic fungus. To study taxol synthesis in paclitaxel-producing endophytic fungus， we need to identify the existence of GGPP synthase in the first place. With RT-PCR method， we cloned the ORF fragment of PaGGPPS (GenBank accession number: KM881430) from the paclitaxel-producing endophytic fungus Penicillium aurantiogriseum in Corylus avellana. The bioinformatics methods were employed to analyze and predict the composition of nucleic acid and amino acid sequence of this gene. The results showed that the length of ORF was 1 113 bp， the molecular weight of the protein was 40.98 kD， and the theoretical isoelectric point was 6.168， which suggested that PaGGPPS protein was acidic. The hydrophilicity analysis found that PaGGPPS was a hydrophilic protien. The α-helix was the dominant secondary structure constructional element of the protein which contained one tpolyprenyl_synt function domain. The identity alignment of GGPPS nucleic acid sequences of taxol producing endophytic fungi in hazelnut and other species showed that the identity were highest between Penicillium roqueforti， Aspergillus clavatus and Neosartorya fischeri， respectively 94%， 76% and 76%. The homologous alignment of Amino acids showed that GGPPS genes were divided into two groups. The GGPPS genes from animal， fungal and yeast were clustered in one group， the GGPPS genes from plant were in the other group. The homologous alignment of nucleic acid sequences showed that the homologous were the highest between GGPPSs in paclitaxel-producing endophytic fungus (Penicillium aurantiogriseum) in Corylus avellana and in Penicillium roqueforti， and GGPPSs in paclitaxel-producing endophytic fungus and plant have the longest distance in the phylogenetic tree. After the bioinformatics analysis， we constructed a pET30a prokaryotic expression vector of PaGGPPS. The protein of PaGGPPS was successfully expressed in the soluble state in Escherichia coli. All the experiments we had done can provide some information for the further research.

Key words:endophytic fungus(Penicillium aurantiogriseum)， GGPP synthase， prokaryotic expression， gene cloning， taxol

中圖分類號：Q943.2

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142(2016)04-0456-06

作者簡介：劉洪偉(1987- )，男，山東日照人，在讀博士，主要從事紫杉醇相關分子生物學方面的研究，(E-mail)lhwei1987@126.com。 *通訊作者： 邱德有，博士，研究員，主要從事次生代謝方面的研究，(E-mail)qiudy@caf.ac.cn。

基金項目：中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項(RIF2014-01，CAFYBB2012-042)[Supported by the Basic Research Fund for Non-profit Research Institutes at the Central Levels(RIF2014-01，CAFYBB2012-042)]。

*收稿日期:2014-10-09修回日期： 2014-12-03

DOI:10.11931/guihaia.gxzw201410011

劉洪偉，楊艷芳，李艷艷，等. 榛子產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌Penicilliumaurantiogriseum中GGPP合酶基因的克隆與表達[J]. 廣西植物， 2016， 36(4)：456-461

LIU HW，YANG YF，LI YY，et al. Cloning and expression of the GGPP synthase gene from the paclitaxel-producing endophytic fungus (Penicilliumaurantiogriseum) inCorylusavellana[J]. Guihaia， 2016， 36(4)：456-461