無(wú)標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析AMACR過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

夏江寶， 邢曉華， 王英超， 沈佐君

(1. 蚌埠醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系， 安徽 蚌埠　233030； 2. 福建省聯(lián)合創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院， 福建 福州　350025； 3. 安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院， 安徽省臨床檢驗(yàn)中心， 安徽 合肥　230001)

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無(wú)標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析AMACR過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

夏江寶1, 2， 邢曉華2， 王英超2， 沈佐君3

(1. 蚌埠醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系， 安徽 蚌埠233030； 2. 福建省聯(lián)合創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院， 福建 福州350025； 3. 安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院， 安徽省臨床檢驗(yàn)中心， 安徽 合肥230001)

摘要：研究α-甲?；o酶A消旋酶(AMACR)過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其分子機(jī)制. 首先建立AMACR穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞株， 然后提取AMACR過(guò)表達(dá)細(xì)胞株的全蛋白， 進(jìn)行無(wú)標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究， 最后對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析和結(jié)果驗(yàn)證, 共篩選出138種差異表達(dá)蛋白. 這些差異表達(dá)蛋白主要參與代謝加工、 細(xì)胞加工等， 證明AMACR的過(guò)表達(dá)對(duì)于肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為影響巨大. IPA分析發(fā)現(xiàn)， 這些差異表達(dá)蛋白主要參與了ERK1/2信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路. 以上結(jié)果說(shuō)明, AMACR的過(guò)表達(dá)通過(guò)調(diào)節(jié)ERK1/2和NF-κB信號(hào)通路等手段改變肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為.

關(guān)鍵詞：肝細(xì)胞癌； α-甲?；o酶A消旋酶； 細(xì)胞增殖； 無(wú)標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)

0引言

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma， HCC， 簡(jiǎn)稱肝癌)是消化系統(tǒng)中常見(jiàn)的惡性腫瘤之一， 其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì). 目前肝癌的治療仍以手術(shù)切除為首選， 局部化療、 介入治療、 射頻消融治療、 免疫治療甚至肝移植等多種方式被廣泛應(yīng)用， 但肝癌病人的遠(yuǎn)期生存率仍不夠理想. 肝癌具有增殖速度快的特點(diǎn)， 以致于出現(xiàn)臨床癥狀并且被診斷時(shí)肝癌通常處于中晚期. 因此持續(xù)、 深入研究肝癌的發(fā)生、 發(fā)展是早日攻克肝癌這一頑疾的必經(jīng)之路.

α-甲?；o酶A消旋酶(AMACR)是一種由P504S基因編碼的包含382個(gè)氨基酸的胞漿蛋白, 存在于人類的線粒體和過(guò)氧化物酶體中， 在側(cè)鏈脂肪酸及脂肪酸衍生物的β氧化和膽酸代謝中間產(chǎn)物的氧化中發(fā)揮重要作用[1]. 在前列腺癌的研究中， AMACR作為重要的愈后診斷因子被廣泛接受. 除前列腺癌外， 在其他惡性腫瘤中AMACR同樣存在過(guò)表達(dá)現(xiàn)象， 如在胃腸道間質(zhì)瘤中， AMACR基因的表達(dá)量增加可增強(qiáng)細(xì)胞增殖， 增加腫瘤侵襲性[2]. 黃新輝等[3]發(fā)現(xiàn)AMACR同樣過(guò)表達(dá)于巨大肝癌的組織樣品中， 后續(xù)研究證實(shí)AMACR同樣可以作為肝癌的愈后指標(biāo). AMACR的過(guò)表達(dá)被證實(shí)與癌癥的發(fā)生、 發(fā)展有密切的關(guān)系， 例如AMACR的過(guò)表達(dá)促進(jìn)粘液纖維肉瘤的增長(zhǎng). 當(dāng)抑制AMACR在前列腺癌和粘液纖維肉瘤中的表達(dá)時(shí)， 發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞的增殖同樣受到了抑制， 同時(shí)， PI3K/AKT信號(hào)通路以及細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期(包括cyclin D1, cyclin T2)均受到了影響[4]. 綜上所述， AMACR的高表達(dá)對(duì)腫瘤的增殖具有積極的促進(jìn)作用， 但這一結(jié)論在肝癌中尚未被證實(shí).

蛋白質(zhì)組學(xué)作為后基因組時(shí)代的一個(gè)非常重要的領(lǐng)域， 在生物系統(tǒng)及疾病和醫(yī)療領(lǐng)域起到非常重要的作用. 研究和分析差異蛋白便于人們更好地理解疾病發(fā)病機(jī)制、 篩選生物靶標(biāo)等. 無(wú)標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法與標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法相比具有樣品制備簡(jiǎn)單、 成本低廉、 數(shù)據(jù)分析便捷等優(yōu)點(diǎn)， 同時(shí)無(wú)標(biāo)記定量方法與基于標(biāo)記的定量方法可達(dá)到相似的準(zhǔn)確度[5]. 應(yīng)用無(wú)標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法比較分析AMACR過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞的改造作用， 在蛋白組水平上闡釋AMACR促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、 增殖的分子機(jī)制.

1材料與方法

1.1材料及試劑

人肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)自ATCC； AMACR慢病毒表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室人員構(gòu)建, 該載體在過(guò)表達(dá)AMACR的同時(shí)還表達(dá)有綠色熒光蛋白， 經(jīng)測(cè)序分析質(zhì)粒完全正確； AMACR抗體購(gòu)自abcam公司； 質(zhì)譜儀為Thermo公司的LTQ系列； 蛋白提取液配方包含： 8 mol·L-1尿素， 50 mmol·L-1NH4HCO3， 50 mmol·L-1的碘乙酰胺和cocktail 蛋白酶抑制劑； 酶解液為含有100 ng·μL-1胰酶、 50 mmol·L-1NH4HCO3和50 g·L-1乙腈的水溶液.

1.2方法1.2.1慢病毒的包裝

接種1×107個(gè)293T細(xì)胞， 待細(xì)胞匯合度達(dá)70%～80%時(shí)(約24 h)， 更換為Opti-MEM培養(yǎng)基， 并使用Lipofectamine 3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染， 實(shí)驗(yàn)步驟參照廠家說(shuō)明書. 收集24 h和48 h的細(xì)胞上清液， 4 ℃、 2 000g離心10 min， 然后將上清液用0.45 μm的濾器過(guò)濾， 分裝并于-80 ℃保存.

1.2.2AMACR過(guò)表達(dá)肝癌細(xì)胞株構(gòu)建

接種 5×105個(gè)細(xì)胞， 培養(yǎng)24 h后， 利用AMACR過(guò)表達(dá)慢病毒(pAMACR)和空白對(duì)照慢病毒(按照病毒 ∶細(xì)胞=10 ∶1的比例)感染HepG2細(xì)胞. Polybrene(5 μg·mL-1) 作為感染增強(qiáng)劑， 在感染的同時(shí)加入. 24 h后更換培養(yǎng)基， 48 h后加入2 μg·mL-1的嘌呤霉素篩選， 此后以1 μg·mL-1的嘌呤霉素維持培養(yǎng).

1.2.3蛋白樣品的制備及酶解

細(xì)胞經(jīng)PBS沖洗3次后， 使用500 μL細(xì)胞裂解液抽提蛋白， 然后用細(xì)胞刮刀回收提取液， 超聲破碎細(xì)胞， 條件為： 超聲1 s， 停5 s， 共8 min. 離心取上清液. 往蛋白提取液中加入DTT至終濃度為8 mmol·L-1， 55 ℃加熱25 min， 室溫冷卻后加IAA至終濃度為50 mmol·L-1， 避光反應(yīng)30 min. BCA法測(cè)定蛋白濃度， 操作按照儀器公司說(shuō)明書進(jìn)行. 取30 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳， 檢測(cè)蛋白提取質(zhì)量.

將200 μg蛋白加入超濾管中， 離心至殘留體積為20 μL左右. 加入400 μL、 50 mmol·L-1NH4HCO3， 離心后棄濾液， 將濾膜放入新的EP管中， 加入酶解液， 37 ℃搖床過(guò)夜. 加入5%(體積分?jǐn)?shù))的TFA終止消化， 再加100 μL、 50 mmol·L-1NH4HCO3離心至殘留體積約為20 μL. 將濾液混合均勻， 取5 μg至PCR管， 蒸干用于檢測(cè)樣品質(zhì)量. 其余濾液用低溫濃縮儀濃縮， 至體積小于100 μL時(shí)轉(zhuǎn)移至PCR管， 蒸干用于質(zhì)譜檢測(cè).

1.2.4高pH值反相分離肽段

凍干的肽段樣品復(fù)溶于A緩沖液中(A緩沖液： 50 g·L-1乙腈， 0.1%甲酸(體積分?jǐn)?shù))的水溶液， pH值用NH4HCO3調(diào)至10.0). 肽段的第一維分離使用的HPLC系統(tǒng)是Agilent 1260 Infinity system， 選用高pH值反向?qū)游鲋?Durashell C18, 5 μm, 4.6 mm×250 mm, Bonna-Agela Technologies)進(jìn)行分離.

1.2.5低pH值 nano色譜分離及串聯(lián)質(zhì)譜分析

每一個(gè)組分的樣品， 首先經(jīng)filter過(guò)濾， 再在trap柱中富集除鹽后以300 nL·min-1的流速經(jīng)過(guò)Acclaim PepMap C18, 75 μm×15 cm 分析柱分離樣品. 洗脫肽段經(jīng)由納升級(jí)電噴霧離子源接口噴出， 進(jìn)入LTQ Orbitrap Velos高分辨率質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)分析. 每組樣品應(yīng)用2D-LC MS/MS檢測(cè)3次.

1.2.6蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索

使用MaxQuant(Version 1.4.1.2)搜索引擎對(duì)MS/MS肽段進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索， 搜庫(kù)結(jié)果采用Target-decoy策略進(jìn)行過(guò)濾， 并設(shè)定肽段和蛋白質(zhì)鑒定FDR≥99%.

1.2.7qRT-PCR方法二次驗(yàn)證AMACR的過(guò)表達(dá)和蛋白質(zhì)組定量結(jié)果

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞， 采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA并定量， 取1 μg的 RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄， 然后通過(guò)qPCR 分析AMACR 在mRNA水平的表達(dá). 實(shí)驗(yàn)使用的引物包括： AMACR上游引物為5’-ATTTGGCTTTGTCAGTGTTCT-3’， 下游引物為5’-GCGGTCAAAAAGAGCCATTAT-3’；β-actin上游引物5’-CCACTGGCATCGTGATGGAC-3’， 下游引物5’-GCGGATGTCCACGTCACA -CT-3’； FABP5上游引物5’-ATGAAGGAGCTAGGAGTGGGA-3’， 下游引物 5’-TGCACCATCTGTAAA GTTGCAG-3’. PCR擴(kuò)增條件： 94 ℃， 5 min. 然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的基因擴(kuò)增， 條件為： 95 ℃， 15 s； 60 ℃， 31 s； 72 ℃， 31 s. 每次實(shí)驗(yàn)包含2個(gè)技術(shù)重復(fù)， 并且每個(gè)基因獨(dú)立檢測(cè)3次， 所得qRT-PCR結(jié)果使用2-ΔΔCT進(jìn)行計(jì)算.

1.2.8Western blot驗(yàn)證AMACR的過(guò)表達(dá)

AMACR過(guò)表達(dá)的細(xì)胞樣品經(jīng)RIPA試劑裂解后， 回收上清液作為粗提蛋白， 經(jīng)BCA定量后取50 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳； 轉(zhuǎn)膜， 封閉后， 孵育AMACR抗體(1/600稀釋的)或GAPDH抗體(1/2 000)， 4 ℃過(guò)夜； 再使用TBST洗滌3次后， 孵育HRP標(biāo)記的二抗(1/5 000稀釋)， 室溫反應(yīng)1 h； 再次洗膜后， 進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè).

1.2.9質(zhì)譜鑒定蛋白的生物信息學(xué)分析

應(yīng)用GO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)鑒定出的差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞成分和生物學(xué)加工分析. 差異蛋白間的相互作用網(wǎng)絡(luò)通過(guò)Ingenuity Pathway Analysis(IPA)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析.

1.2.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

通過(guò) t檢驗(yàn)， 將蛋白表達(dá)差異大于2倍或小于0.5倍， 同時(shí)P<0.05的蛋白定義為顯著差異蛋白.

2結(jié)果

2.1穩(wěn)定過(guò)表達(dá)AMACR肝癌細(xì)胞株的建立

慢病毒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后經(jīng)嘌呤霉素篩選熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)良好， 說(shuō)明慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞沒(méi)有明顯毒性作用； 綠色熒光和明場(chǎng)重合度極高， 證明細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%以上(見(jiàn)圖1(a)). 同時(shí)， Western blot結(jié)果顯示AMACR的表達(dá)量在過(guò)表達(dá)組中比參照組中高8.36倍(見(jiàn)圖1(b)、 (c)).

2.2蛋白樣品濃度測(cè)定和樣品質(zhì)量檢測(cè)

在562 nm波長(zhǎng)下讀取蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的吸光值， 繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線， 得到直線回歸方程y=1.495x+0.14 (R2=0.996 7). 計(jì)算得出AMACR過(guò)表達(dá)組和參照組的蛋白質(zhì)量濃度分別是1.623和2.294 μg·μL-1. 取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳, 結(jié)果顯示， 2組樣品之間平行度較好， 蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量主要富集在25～100 ku區(qū)域， 蛋白條帶清晰， 初步表明蛋白提取效果理想， 樣品適合進(jìn)行蛋白質(zhì)組研究.

2.3蛋白鑒定及差異蛋白的篩選

經(jīng)無(wú)標(biāo)定量質(zhì)譜分析， 共鑒定到1 886種蛋白滿足我們?cè)O(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)(FDR≥99%). 如圖2(a)所示， 這些蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分布于1～200 ku內(nèi)， 主要集中于30～50 ku范圍， 與文獻(xiàn)[6]報(bào)道相似， 證明質(zhì)譜鑒定結(jié)果準(zhǔn)確、 可靠. 另外， 將特異性表達(dá)在AMACR過(guò)表達(dá)細(xì)胞或參照細(xì)胞上的蛋白以及表達(dá)差異大于2倍或小于0.5倍(p<0.05)的蛋白定義為差異蛋白. 根據(jù)該設(shè)置， 共篩選出138種差異蛋白(見(jiàn)圖2(b))， 包括124種上調(diào)蛋白， 14種下調(diào)蛋白， 其中105種蛋白在AMACR過(guò)表達(dá)組和參照組中均有表達(dá)， 另外有28種蛋白只在AMACR過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中特異性地出現(xiàn)， 有5種蛋白在AMACR過(guò)表達(dá)的細(xì)胞株中特異性地消失. 這些特異性存在和特異性缺失的蛋白充分體現(xiàn)了AMACR對(duì)于細(xì)胞的改造作用.

2.4差異蛋白的生物信息學(xué)分析

利用GO對(duì)差異蛋白的亞定位分析發(fā)現(xiàn)， 差異蛋白主要存在于細(xì)胞器、 大分子復(fù)合物中(見(jiàn)圖3(a)). 由于AMACR主要存在于溶酶體和線粒體中， 它表達(dá)量的變化對(duì)與之作用的蛋白會(huì)產(chǎn)生直接影響， 因此差異蛋白亞定位結(jié)果是合理的. 通過(guò)生物學(xué)加工分析發(fā)現(xiàn)， 這些差異蛋白所參與的生物加工主要是細(xì)胞加工、 代謝加工、 生物調(diào)節(jié)等過(guò)程(見(jiàn)圖3(b)). 這說(shuō)明由于AMACR的過(guò)表達(dá)直接改變了HepG2細(xì)胞的正常代謝， 對(duì)細(xì)胞生物學(xué)性狀的改變明顯.

應(yīng)用IPA軟件對(duì)差異蛋白所涉及的信號(hào)通路以及相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析. 圖3(c)、 (d)是IPA分析中得分最高的兩個(gè)蛋白網(wǎng)絡(luò)圖. 兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)分別聚集了30種和24種差異蛋白. 如圖3(c)所示， 線粒體復(fù)合物作為該蛋白網(wǎng)絡(luò)的一個(gè)節(jié)點(diǎn)與7種差異蛋白相連， 這一結(jié)果與AMACR的定位一致. 同時(shí)， IPA的結(jié)果提示這些差異蛋白間的相互調(diào)節(jié)主要由ERK1/2和NF-κB兩條信號(hào)通路相連. ERK1/2信號(hào)途徑是一個(gè)重要的癌細(xì)胞的增殖、 生長(zhǎng)和凋亡的調(diào)節(jié)子[7]. NF-κB是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子， 對(duì)于癌細(xì)胞的存活、 增殖、 抗凋亡均有調(diào)節(jié)作用[8-9].

2.5差異蛋白質(zhì)的熒光定量PCR驗(yàn)證

如圖4(a)所示， AMACR的mRNA表達(dá)水平在過(guò)表達(dá)細(xì)胞中比參照細(xì)胞中高約200倍， 再次證明建立的AMACR過(guò)表達(dá)細(xì)胞系成功. 另外以FABP5基因?yàn)槔?對(duì)質(zhì)譜鑒定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證， 結(jié)果證明AMACR過(guò)表達(dá)組中FABP5的mRNA表達(dá)量較參照組高3倍， 該結(jié)果與質(zhì)譜結(jié)果一致(見(jiàn)圖4(b))， 證明質(zhì)譜鑒定結(jié)果正確、 可信(結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05).

3討論

之前的實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)， AMACR是一種新的肝癌標(biāo)志物[3, 10-11]. 在其它類型癌癥中， AMACR不僅是一種腫瘤標(biāo)志物， 更是一種腫瘤惡化的促進(jìn)因子[12]， 而AMACR的促癌功能在肝細(xì)胞癌中仍沒(méi)有被驗(yàn)證. AMACR是一種存在于溶酶體、 線粒體中的支鏈脂肪酸氧化酶， 它的過(guò)表達(dá)可以加快支鏈脂肪酸的β氧化， 而脂肪酸β-氧化過(guò)程可以生成乙酰CoA， 后者是一種十分重要的中間化合物， 既可以進(jìn)入三羧酸循環(huán)為細(xì)胞提供能量， 還可以為許多重要化合物合成提供原料， 如酮體、 膽固醇和類固醇化合物. 因此， AMACR的過(guò)表達(dá)一方面可以為細(xì)胞提供過(guò)剩的能量， 另一方面可以為細(xì)胞的代謝提供過(guò)剩的原料， 進(jìn)而加快細(xì)胞的代謝. 因此從生化的角度分析， AMACR的過(guò)表達(dá)存在促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、 增殖的潛力.

另外， GO分析發(fā)現(xiàn)， AMACR的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致58.3%的差異蛋白參與了代謝加工和細(xì)胞加工的過(guò)程， 這說(shuō)明AMACR的過(guò)表達(dá)必然引起細(xì)胞的生物學(xué)行為發(fā)生改變. 而IPA分析發(fā)現(xiàn)， 由于AMACR過(guò)表達(dá)引起的差異表達(dá)蛋白主要涉及ERK1/2信號(hào)途徑和NF-κB信號(hào)途徑. 如前文所述， 這兩個(gè)信號(hào)途徑在癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、 增殖、 凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用. 它們可能是AMACR促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、 增殖所依賴的最重要的分子機(jī)制.

結(jié)合之前的文獻(xiàn)報(bào)道， 共找到5種與癌細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白(見(jiàn)表1)， 包括： U2AF2、 FABP5、 SDC1、 ADGB和C1QBP. 以表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid binding protein5, FABP5)基因?yàn)槔? 據(jù)報(bào)道沉默F(xiàn)ABP5 基因能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖, 將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期, 使肝癌細(xì)胞凋亡顯著增加. JEONG等[13]報(bào)道在肝內(nèi)膽管癌中FABP5的表達(dá)量與癌癥分期顯著正相關(guān)， 并且當(dāng)FABP5被過(guò)表達(dá)后， 癌細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增加、 細(xì)胞的增殖侵襲能力增強(qiáng). 在本課題研究中， FABP5被AMACR顯著上調(diào)， 而且FABP5同樣涉及脂肪酸的代謝， 因此猜測(cè)FABP5與AMACR可能存在某種相互作用， 進(jìn)而協(xié)同地調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖. 再如補(bǔ)體1Q結(jié)合蛋白(C1QBP)存在于線粒體的基質(zhì)中. 據(jù)報(bào)道該蛋白在其它類型的癌癥中顯著上調(diào)， 而當(dāng)C1QBP被缺失后， 細(xì)胞的增殖減弱， 凋亡增多. 結(jié)合IPA結(jié)果(見(jiàn)圖4(c))發(fā)現(xiàn)， C1QBP與線粒體復(fù)合物發(fā)生直接的相互作用， 因此推測(cè)AMACR的過(guò)表達(dá)增加了C1QBP的表達(dá)量， 后者進(jìn)一步促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖. 除此之外， 還發(fā)現(xiàn)由于AMACR的過(guò)表達(dá)， 造成BCL-2樣蛋白1(B2LCL1)的表達(dá)量顯著升高， 該蛋白是一個(gè)已經(jīng)被證實(shí)的、 重要的細(xì)胞凋亡抑制蛋白. 這說(shuō)明AMACR的過(guò)表達(dá)將通過(guò)調(diào)節(jié)BCL-2的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的抑制.

表1　細(xì)胞增殖相關(guān)的差異表達(dá)蛋白

注： ↓代表蛋白在AMACR過(guò)表達(dá)組與空載組中表達(dá)量比值下降, ↑代表蛋白在AMACR過(guò)表達(dá)組與空載組中表達(dá)量比值升高

綜上所述， AMACR的過(guò)表達(dá)一方面為肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、 增殖提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)， 另一方面， 依賴ERK1/2和NF-κb信號(hào)通路并且上調(diào)多種促癌因子增強(qiáng)腫瘤生長(zhǎng)、 增殖和抗凋亡的能力.

4結(jié)論

研究采用無(wú)標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)AMACR過(guò)表達(dá)細(xì)胞與正常細(xì)胞進(jìn)行比較分析， 共篩選出138種表達(dá)差異在2倍以上的差異蛋白， 其中有58%的差異蛋白涉及代謝加工和細(xì)胞加工， 證明AMCR的過(guò)表達(dá)對(duì)于肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為影響巨大. IPA分析發(fā)現(xiàn)， 這些差異蛋白主要涉及ERK1/2信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路. 結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)到共找到6種促癌細(xì)胞增殖蛋白.

綜合以上結(jié)果證明, AMACR的過(guò)表達(dá)通過(guò)調(diào)節(jié)ERK1/2和NF-κB信號(hào)通路以及上調(diào)多個(gè)促癌因子的表達(dá)量等手段改變肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為， 并具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖的潛力， 為進(jìn)一步研究AMACR的分子功能提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ).

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(責(zé)任編輯： 洪江星)

Label-free quantitative proteomic analysis of the effect of AMACR overexpression on biological behaviors of hepatocellular carcinoma cells

XIA Jiangbao1, 2, XING Xiaohua2, WANG Yingchao2, SHEN Zuojun3

(1. Department of Medicine Laboratory of Bengbu Medical College, Bengbu, Anhui 233030, China；2. The United Innovation of Mengchao Hepatobiliary Technology Key Laboratory of Fujian Province,Mengchao Hepatobiliary Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou, Fujian 350025, China；3. Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University, Anhui Provincial Center for Clinical Laboratories，Hefei, Anhui 230001, China)

Abstract:This study attempted to investigate the effect of AMACR overexpression on the biological behavior of HCC cells using label free quantitative proteomic approch. A stable cell line that overexpressed AMACR was produced by transducing engineered lentivirus containing AMACR complete sequence into HepG2 cells. Afterwards, the whole protein extracted from the AMACR-overexpressed cells and the normal cultured cells (control) were comparatively quantified by 2D LC-MS/MS. A total of 138 differentially expressed proteins were identified. These dysregulated proteins were mostly enriched for metabolic process and cellular process, which suggested a big change at biological behaviors occurred in the host cells due to AMACR overexpression. The signalings pathway analysis revealed that the dysregulated proteins in AMACR-overexpressed cells are more concentrated to the ERK1/2 and NF-κB signaling pathways. Thus, AMACR overexpression induced the alterations at biological behaviors of HCC cells majorly through modulating the ERK1/2 and NF-κB signalings.

Keywords:hepatocellular carcinoma; AMACR; cell proliferation; label-free quantitative proteomics

中圖分類號(hào)：R735.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

基金項(xiàng)目：福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2015J05174)； 福建省衛(wèi)生計(jì)生委青年科研課題資助項(xiàng)目(2015-1-94)； 福州市科技強(qiáng)院建設(shè)項(xiàng)目(編號(hào)：2014-S-139-3)； 福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院科研資助項(xiàng)目(QDZJ-2014-005)； 福建中醫(yī)藥大學(xué)校管科研課題資助項(xiàng)目(XB2014096)

通訊作者:王英超(1983-)， 博士， 助理研究員， 主要從事腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)研究， yingchaowang@live.com

收稿日期:2015-11-30

文章編號(hào)：1000-2243(2016)02-0282-07

DOI:10.7631/issn.1000-2243.2016.02.0282

沈佐君(1963-)， 博士， 副教授， 主任檢驗(yàn)師， 主要從事腫瘤的早期診斷和預(yù)后判斷， shenzuojun@163.com