腸S9溫孵法研究川芎多成分腸吸收過程中的腸壁代謝

楊文寧　李博　王豪　陳新晶　楊立媛　劉洋

[摘要]生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)（biopharmaceutics classification system，BCS）研究中，腸吸收性評價實驗要考慮吸收過程中的腸壁代謝問題，因此該研究選用大鼠腸S9對川芎中多成分的腸壁代謝進(jìn)行研究，為進(jìn)一步BCS腸吸收性評價實驗厘清代謝影響。利用大鼠腸S9對川芎水提液進(jìn)行體外溫孵實驗研究，通過HPLC指紋圖譜技術(shù)，對比研究多成分色譜峰面積溫孵前后的變化。結(jié)果表明川芎水提液經(jīng)腸S9溫孵后，以指紋圖譜表征的多成分譜圖中，洋川芎內(nèi)酯I等多個成分發(fā)生腸壁代謝，有1個代謝轉(zhuǎn)化成分生成。阿魏酸等多個成分不發(fā)生腸壁代謝。因此，建議下一步川芎的BCS腸吸收性評價實驗可以對不發(fā)生腸壁代謝成分直接測定，而對腸壁代謝成分的腸吸收性評價則需要探索更合適的實驗方法。

[關(guān)鍵詞]生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)；腸S9；多成分

[Abstract]The information of drug deposition in the intestine is required in the study for the drug absorption in biopharmaceutics classification system （BCS） To illustrate the impacts of gut wall metabolism on the absorption， metabolism of multiple components in Chuanxiong Rhizoma in gut wall was tested by rat S9 incubation in vitro The chemical fingerprint technology was used in this study to simultaneously detect multiple components in Chuanxiong， and peak areas before and after S9 incubation were compared The results showed that senkyunolide I and several constituents were metabolized by gut wall， and one new metabolite was founded However， ferulic acid and other compounds remained unchanged after incubation Therefore， the subsequent intestinal permeability of multiple components in Chuanxiong that were not metabolized in the intestine was suggested to be detected directly by in situ singlepass intestinal perfusion （SPIP）Nonetheless， the intestinal permeability of the constituents that were metabolized in the intestine shall be explored by appropriate approaches

[Key words]biopharmaceutics classification system； S9； multiple components

doi：10.4268/cjcmm20160705

生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)（biopharmaceutics classification system，BCS）于1995年被Gordon L Amidon教授等[1]首次提出，滲透性是其中的重要指標(biāo)之一。研究藥物滲透性的方法有外翻腸囊法、在體單向腸灌流法、腸灌流并行采血法等[2]。文獻(xiàn)[3]報道，由于腸壁代謝的影響，對藥物的滲透系數(shù)測定時需要根據(jù)待測藥物的腸壁代謝情況選用合適的實驗方法。中藥成分眾多且復(fù)雜，為堅持中藥多成分整體性研究的原則，充分利用化學(xué)指紋圖譜技術(shù)的特點，開展多成分腸壁代謝同時研究是可行的。腸壁代謝實驗方法有很多，通過前期實驗方法的研究，腸S9代謝研究法因腸S9制備相對簡單，方法成熟[45]，反應(yīng)時間短，可直接、快速反映腸壁代謝行為的優(yōu)點而被選中。川芎為傘形科藁本屬植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort的干燥根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。目前對川芎的研究多集中在單一成分的代謝[68]，對其整體多成分的代謝也有報道[9]，但是采用體外法研究川芎中多成分的腸壁代謝卻未見文獻(xiàn)報道。

因此，本研究對川芎水提物進(jìn)行研究，應(yīng)用大鼠腸S9代謝研究法，結(jié)合多成分指紋圖譜分析，探索腸S9對川芎中多成分的代謝情況，從而為下一步川芎中多成分腸滲透性定性和定量分析提供基礎(chǔ)支撐和指導(dǎo)。

1材料

WATERS 600液相色譜系統(tǒng)（Milford，MA，USA），由Delta600四元泵和2487雙波長紫外檢測器組成，工作站為Millennium 32。115PK離心機(jī)（德國Sigma 公司）。

川芎飲片購買于北京同仁堂藥店，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)王晶娟副教授鑒定其來源為傘形科藁本屬植物川芎L Chuanxiong的干燥根莖；阿魏酸對照品（Aladdin，純度99%，批號F1110835g）；洋川芎內(nèi)酯I（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，純度≥98%，批號141027）；甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；純凈水（娃哈哈）；其他試劑均為分析純。

SD大鼠，雄性，體重280～320 g，北京斯貝福實驗動物科技有限公司提供，許可證號SCXK（京）20110004，動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物部標(biāo)準(zhǔn)屏障環(huán)境內(nèi)，自由飲食，明暗節(jié)律12 h/12 h。

2方法

21溶液配制

211川芎水提液制備取川芎飲片10051 g，加1 L去離子水回流提取15 h，趁熱過濾，濾渣加1 L去離子水再次提取，趁熱過濾。合并濾液并濃縮，定容到100 mL量瓶中，備用，試驗時稀釋到所需濃度。

212對照品溶液配制分別精密稱取阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I對照品于10 mL量瓶中，甲醇溶解稀釋為質(zhì)量濃度約為02 g·L-1的對照品溶液。

213KCl溶液配制準(zhǔn)確稱取154 mmol·L-1KCl，加去離子水100 mL溶解制成115%的KCl溶液，放置備用。

21420 mmol·L-1HEPES緩沖液配制取20 mmol·L-1 HEPES，154 mmol·L-1KCl置100 mL量瓶中，加蒸餾水至刻度線附近，再用1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)pH至741，即得。

22腸S9制備

大鼠禁食過夜（自由飲水），水合氯醛麻醉后，打開腹腔，用冰冷（0～4 ℃）的115%KCl沖洗至無內(nèi)容物流出，取小腸，剪成小段，放入冰冷的115%KCl溶液中。剪開小腸，將小腸置于冰冷的玻璃板上，用玻璃片刮取小腸黏膜，加入冰冷的3倍量含有115%KCl的HEPES緩沖液（pH 74），冰浴中勻漿。勻漿于4 ℃，9 000×g離心20 min，得上清液為S9。分裝于離心管中，Bradford法測蛋白含量，-80 ℃保存。

23蛋白沉淀劑選擇

為了選取適當(dāng)?shù)牡鞍壮恋碓噭?，對常用的沉淀蛋白的試劑甲醇、乙腈、高氯酸進(jìn)行比較分析，擇優(yōu)選取蛋白沉淀試。

24溫孵條件

241對照組取05 mL 經(jīng)高溫滅活的S9于37 ℃水浴中預(yù)熱，再精密吸取05 g·mL-1的川芎提取液05 mL，37 ℃溫孵30 min，加入02 mL高氯酸終止反應(yīng)，于4 ℃，1 500 ×g離心5 min，取上清液20 μL進(jìn)行HPLC分析（n=3）。

242實驗組取05 mL S9于37 ℃水浴中預(yù)熱，再精密吸取05 g·mL-1的川芎提取液05 mL，37 ℃溫孵30 min，加入02 mL高氯酸終止反應(yīng)，于4 ℃，1 500×g離心5 min，取上清液20 μL進(jìn)行HPLC分析（n=3）。

25色譜條件[9]

采用Hypersil ODS2色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm），檢測波長280 nm，流速1 mL·min-1，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，流動相01% 三氟乙酸水溶液（A）乙腈（B），梯度洗脫（0～30 min，2%～34% B；30～35 min，34%～65%B；35～50 min，65%～100%B）。

3結(jié)果

31Bradford法測蛋白含量

Bradford法測蛋白時以吸光度A為縱坐標(biāo)，待測樣品中的蛋白含量為橫坐標(biāo)，測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0005 5X-0007 9，相關(guān)系數(shù)R2=0996 3。測得制備的腸S9樣品中蛋白質(zhì)量濃度為22 g·L-1。

32沉淀蛋白試劑考察

對常用的沉淀蛋白的試劑甲醇、乙腈、高氯酸進(jìn)行比較分析，研究其對川芎水提液的影響，見圖1。分析圖1中色譜峰的個數(shù)可知，沉淀劑對提取液影響最小的是高氯酸，其次是甲醇，最后是乙腈。

為了進(jìn)一步考察加入腸S9之后制備樣品時沉淀劑對樣品的影響，參考上述結(jié)果，選取甲醇和高氯酸，分別考察其對樣品的沉淀效果，見圖2。當(dāng)針對樣品時，兩者都會對樣品前10 min中的峰造成干擾，甲醇沉淀時主要表現(xiàn)為樣品峰形變差，高氯酸表現(xiàn)為雜峰多。綜合比較，選取高氯酸為蛋白沉淀劑。

33腸S9對川芎中多成分的代謝情況

以原藥指紋圖譜中表征的19個峰為分析對象，不同處理組的結(jié)果見圖3。其中峰13，16經(jīng)對照品指認(rèn)分別為阿魏酸和洋川芎內(nèi)酯I。各處理組樣品的峰面積見表1。為評價酶對成分代謝的影響效果，引入抑制率的概念和計算公式，代謝率=（對照組峰面積-實驗組峰面積）/對照組峰面積×100%，負(fù)值表示溫孵后峰面積增加，正值表示溫孵后峰面積減少。采用統(tǒng)計軟件SPSS Statistics 17 0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行獨立樣本t檢驗，P<005為有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果顯示，與實驗組相比，峰1～6，9～14，16，17與對照組有顯著性差異（P<001），說明溫孵前后其峰面積有明顯增加或者減少。結(jié)合代謝率數(shù)值分析可知，峰1，2，9，11，14，16，17溫孵后峰面積明顯減少，說明其能被腸S9代謝，而峰3～6，10，12溫孵后峰面積顯著增加，說明腸S9溫孵時，有成分間的相互轉(zhuǎn)化。另外，實驗組在2921 min時出現(xiàn)了1個新峰N1，表明其為川芎中多成分經(jīng)過腸S9代謝后生成的產(chǎn)物，具體物質(zhì)仍需試驗檢測。

4結(jié)論

對單一成分的腸滲透性評估時，大鼠在體單向腸灌流法是目前應(yīng)用廣泛，且與體內(nèi)實際情況最為相符的考察藥物吸收的方法，其實驗的條件與口服給藥后的腸道生理環(huán)境接近，與人體的相關(guān)性良好。夏敬勝等[10]也采用此方法研究葛根和川芎藥對的

指標(biāo)成分的腸吸收。但是，由于腸壁對藥物的代謝，相對在體單向灌流是基于腸腔內(nèi)藥物的減少量來計算吸收的量，腸灌流并行采血法更能真實的反應(yīng)藥物的吸收情況。本課題組前期在對葛根素進(jìn)行BCS分類時也證實了這一現(xiàn)象，并建議對此類成分可采用腸灌流并行采血法模型評估其滲透性，然后根據(jù)其他的BCS如BDDCS（biopharmaceutics drug disposition classification system）[11]進(jìn)行分類。

基于中藥的多成分特點，本課題組提出了中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)[12]（biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica，CMMBCS）的科學(xué)框架。如果要將BCS引入中藥多成分體系中，對能被腸壁代謝的成分也不可避免的要對滲透性進(jìn)行測定，而多成分復(fù)雜且微量的特點不可能對每一個成分進(jìn)行體內(nèi)外實驗。而腸S9是一種用于研究腸對藥物代謝的有效可行的方法[13]，其制備相對簡單，成本低，方便快捷，適合用于初步探索復(fù)雜多成分的腸代謝過程。同時本研究的結(jié)果與采用體內(nèi)法研究腸道對川芎多成分的處置結(jié)果是一致的[9]，證實了實驗方法的可靠性。因此利用體外腸S9代謝研究法，將藥材中多成分進(jìn)行篩選分類，其中不被腸壁代謝的成分可采用在體單向腸灌流法測定其滲透性，然后進(jìn)行BCS歸屬；而對能被腸壁代謝的成分，借鑒BDDCS，探索適合評估其滲透性的實驗方法，對其進(jìn)行BCS歸屬確定，這為下一步川芎中多成分腸滲透性定性和定量分析提供了基礎(chǔ)支撐和指導(dǎo)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Amidon G L， Lennerns H， Shah V P， et al. A theoretical basis for a biopharmaceutic drug classification：the correlation of in vitro drug product dissolution and in vivo bioavailability[J]. Pharm Res， 1995， 12（3）：413.

[2]Li H， Dong L， Liu Y， et al. Comparison of two approaches of intestinal absorption by puerarin[J]. J Pharmacol Toxicol Methods， 2014， 70（1）：6.

[3]Li H， Dong L， Liu Y， et al. Biopharmaceutics classification of puerarin and comparison of perfusion approaches in rats[J]. Int J Pharm， 2014， 466（1）：133.

[4]Nakamura M， Kawakita Y， Yasuhara A， et al. In vitro and in vivo evaluation of the metabolism and bioavailability of ester prodrugs of MGS0039 （3（3， 4dichlorobenzyloxy）2amino6fluorobicyclo [3. 1. 0] hexane2， 6dicarboxylic Acid）， a potent metabotropic glutamate receptor antagonist[J]. Drug Metab Dispos， 2006， 34（3）：369.

[5]Masaki K， Hashimoto M， Imai T. Intestinal firstpass metabolism via carboxylesterase in rat jejunum and ileum[J]. Drug Metab Dispos， 2007， 35（7）：1089.

[6]Li W， Guo J， Tang Y， et al. Pharmacokinetic comparison of ferulic acid in normal and blood deficiency rats after oral administration of Angelica sinensis， Ligusticum chuanxiong and their combination[J]. Int J Mol Sci， 2012， 13（3）：3583.

[7]Yan R， Ko N L， Li S L， et al. Pharmacokinetics and metabolism of ligustilide， a major bioactive component in Rhizoma Chuanxiong， in the rat[J]. Drug Metab Dispos， 2008， 36（2）：400.

[8]Yan R， Lin G， Ko N L， et al. Low oral bioavailability and pharmacokinetics of senkyunolide A， a major bioactive component in Rhizoma Chuanxiong， in the rat[J]. Ther Drug Monit， 2007， 29（1）：49.

[9]劉洋， 石任兵， 劉斌， 等. 口服川芎飲片煎液大鼠體液化學(xué)成分變化研究[J]. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報， 2008， 31（5）：334.

[10]夏敬勝， 蔡瑜. 葛根川芎藥對中葛根素和阿魏酸的大鼠在體腸吸收機(jī)制[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報， 2015， 34（2）：173.

[11]Wu C Y， Benet L Z. Predicting drug disposition via application of BCS：transport/absorption/elimination interplay and development of a biopharmaceutics drug disposition classification system[J]. Pharm Res， 2005， 22（1）：11.

[12]劉洋， 隗麗， 董玲， 等. 多成分體系下中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)的構(gòu)建分析[J]. 中國中藥雜志， 2014， 39（23）：4479.

[13]Kajbaf M， Ricci R， Zambon S， et al. Contribution of rat intestinal metabolism to the xenobiotics clearance[J]. Eur J Drug Metab Pharmacokinet， 2013， 38（1）：33.

[責(zé)任編輯孔晶晶]