多成分藥物序貫代謝方法用于川芎水煎液多成分不同階段吸收代謝研究

劉洋　羅志強　呂貝然　趙海譽　董玲

[摘要]中藥作為多成分藥物，其代謝與吸收相關(guān)性問題，可以通過序貫代謝方法開展，并為生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)中決定吸收的腸滲透性成分選擇提供遴選依據(jù)。該研究以川芎為研究載體，采用在體封閉腸環(huán)的實驗方法，并且結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對川芎水煎液中的多成分口服給藥吸收和序貫代謝過程進行了研究。結(jié)果在川芎水煎液中鑒別了14個主要成分，其中阿魏酸，洋川芎內(nèi)酯F，G，I，J，3羥基丁基苯肽6個成分以原型吸收入血，可作為中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)中首選腸滲透性評價成分。正丁基苯酞，E藁本內(nèi)酯，Z藁本內(nèi)酯，新蛇床內(nèi)酯，洋川芎內(nèi)酯A，Q，在所有樣品中均不存在，說明這6個成分不吸收或者在進入肝門靜脈血前已經(jīng)被代謝；洋川芎內(nèi)酯H會被肝代謝；洋川芎內(nèi)酯M會被腸道菌和肝代謝。通過這一研究，川芎水煎液多成分口服給藥吸收代謝變化得以清晰展示出來，從而將靜態(tài)的吸收入血成分轉(zhuǎn)變?yōu)閯討B(tài)地、連續(xù)地、整體地多成分吸收代謝過程。

[關(guān)鍵詞]多成分藥物；藥物代謝；序貫代謝；整體吸收；液質(zhì)聯(lián)用

[Abstract]The multiple components in Chinese herbal medicines （CHMS） will experience complex absorption and metabolism before entering the blood system Previous studies often lay emphasis on the components in blood However， the dynamic and sequential absorption and metabolism process following multicomponent oral administration has not been studied In this study， the in situ closedloop method combined with LCMS techniques were employed to study the sequential process of Chuanxiong Rhizoma decoction （RCD）. A total of 14 major components were identified in RCD Among them， ferulic acid， senkyunolide J， senkyunolide I， senkyunolide F， senkyunolide G， and butylidenephthalide were detected in all of the samples， indicating that the six components could be absorbed into blood in prototype Butylphthalide， Eligustilide， Zligustilide， cnidilide， senkyunolide A and senkyunolide Q were not detected in all the samples， suggesting that the six components may not be absorbed or metabolized before entering the hepatic portal vein Senkyunolide H could be metabolized by the liver， while senkyunolide M could be metabolized by both liver and intestinal flora This study clearly demonstrated the changes in the absorption and metabolism process following multicomponent oral administration of RCD， so as to convert the static multicomponent absorption process into a comprehensive dynamic and continuous absorption and metabolism process

[Key words]multicomponent drug； drug metabolism； sequential metablism； integral absorption； LCMS

doi：10.4268/cjcmm20160703

多成分藥物代謝[12]由序貫代謝、并發(fā)代謝和多重代謝3部分組成。其中，序貫代謝是中藥類多成分藥物代謝研究的首要研究內(nèi)容。中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)[3]的構(gòu)建堅持以多成分為整體，并注重每種成分受其他成分的影響，在發(fā)展過程中逐漸加大成分代謝對吸收的影響研究，生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)中的腸滲透性評價量化指標是終點性評價，但中藥的多成分在吸收前，需先面對消化液、消化酶、腸內(nèi)細菌酶、內(nèi)源性酶及自由基反應(yīng)等引起的生物轉(zhuǎn)化，在透過胃腸道生物膜時，也有被上皮細胞中的藥物代謝酶生物轉(zhuǎn)化的可能[4]，這些原因中哪個因素主導(dǎo)引起腸滲透性變化是闡述中藥生物藥劑學(xué)分類屬性變化機制的重要方面。因此本研究采用多成分藥物代謝序貫代謝研究方法進行，力爭為中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)中的腸滲透性評價提供代謝原因闡述。

多成分藥物發(fā)揮藥效是多種成分面對多個靶點的綜合作用[5]，這些成分到達靶點的代謝過程決定了它們產(chǎn)生療效的可能性，因此天然多成分藥物的多種成分代謝動態(tài)過程研究已經(jīng)發(fā)展成為一個熱點科研方向[6]。目前單一成分代謝研究比較成熟[7]，2種成分之間的代謝性相互作用也闡述清晰[8]，但是將2種以上多成分作為整體研究代謝輪廓的方法還較少見，所以本研究堅持多成分同時測定的原則，按照口服多成分藥物的消化道歷程，開展多成分總體代謝輪廓研究，采用對照比較法依次進行。①消化液及消化酶代謝：分別在人工胃液、人工腸液的酸堿物理環(huán)境及消化酶作用下多成分是否發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化。②腸道菌群代謝：對比在有無腸道菌情況下多成分代謝情況。③腸壁代謝：對比在有無腸壁細胞內(nèi)代謝酶抑制劑情況下多成分代謝情況。④肝代謝研究：對比肝門靜脈血和腹主動脈血的多成分差異，闡述在肝內(nèi)代謝情況。因4個過程在空間和時間上保持連續(xù)性，因此命名為“序貫代謝”。

川芎是高頻使用的傳統(tǒng)常用中藥[9]，課題組前期已經(jīng)運用高效液相色譜法對川芎多成分序貫過程進行了研究[10]，該研究中表明以色譜峰為代表的川芎多成分中，原型吸收種類較多，代謝轉(zhuǎn)化種類相對較少。本論文在前期研究基礎(chǔ)上，運用在體封閉腸環(huán)法結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，定性分析成分類型，系統(tǒng)闡述川芎多成分的腸道菌群代謝、腸壁代謝和肝代謝的序貫過程，并遴選出以原型吸收為主的成分作為下一步中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)中腸滲透性評價的首選成分。

1材料

Thermo 液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（美國賽默飛世爾科技），包括ultimate 3000高效液相色譜儀，自動進樣器，DAD檢測器，柱溫箱，二元泵和LTQ Orbitrap質(zhì)譜；Xcalibur， Metworks和 Mass Frontier 70用于數(shù)據(jù)采集和處理；電子分析天平（BT25S，北京賽多利斯儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（DZKW4，北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；超聲波清洗器（KQ500DE，昆山超聲儀器有限公司）；115PK離心機（德國Sigma 公司）；蠕動泵（BT1001F，保定蘭格恒流泵有限公司）；QL901漩渦混和機（其林貝爾儀器制造公司）。

川芎飲片（購買于北京同仁堂藥店）經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)張貴君教授鑒定為傘形科藁本屬植物川芎Ligusticum chuanxiong的干燥根莖；對照品阿魏酸（Aladdin，純度99%，批號F1110835g）、藁本內(nèi)酯（中檢院，純度≥98%，批號ZJ0724BB13），對照品洋川芎內(nèi)酯A（純度≥98%，批號140914）、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ（純度≥98%，批號141027）和正丁基苯酞（純度≥98%，批號130907）購于成都普菲德生物技術(shù)有限公司；甲醇、乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司），1氨基苯并三唑（北京百靈威有限公司），娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。其余試劑均為分析純。

SD大鼠，雄性，體重280～330 g，斯貝福（北京）實驗技術(shù)有限公司提供，許可證號SYXK（京）20110024，動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物部標準屏障環(huán)境內(nèi)，自由飲食，明暗節(jié)律12 h/12 h。實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠1周以上，自由飲水和進食。

2方法

21溶液配制

211KrebsRinger′s營養(yǎng)液（KR液）配制稱取NaCl 780 g，KCl 035 g，CaCl2 037 g，NaHCO3 137 g，NaH2PO4 032 g，MgCl2 002 g，葡萄糖140 g；加蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH到739～741，放置備用。

212川芎水煎液的制備取川芎飲片100 g，精密稱定，置具有冷凝回流裝置的圓底燒瓶中，加1 000 mL去離子水，浸泡1 h后回流提取15 h，趁熱過濾出提取液。再向燒瓶中加入1 000 mL去離子水，回流提取1 h，趁熱過濾出提取液。合并提取液。濾液經(jīng)過水浴濃縮，并用KR液定容至100 mL，制成含生藥1 g·mL-1的溶液，作為灌腸藥液。取適量水提液加蒸餾水制成相當于藥材質(zhì)量濃度為10 g·L-1溶液，用022 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液進行液質(zhì)分析。

213對照品的配制分別精密稱取適量阿魏酸、藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯I、正丁基苯酞對照品于10 mL量瓶，甲醇溶解稀釋為質(zhì)量濃度約為10 mg·L-1的對照品溶液進行液質(zhì)分析。

22實驗動物手術(shù)方法

221腸道菌代謝研究15只SD大鼠禁食12 h，自由飲水，分為2組，12只為供血組，3只為實驗組，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，實驗組腹主動脈取血，血液放于肝素化離心管置于37 ℃水浴鍋中保溫。在實驗組大鼠頸靜脈插管輸血，保證實驗過程的血液損失得到補充，腸系膜靜脈插管收集血液。沿其腹中線打開腹腔約3～4 cm選取結(jié)腸，在腸段首末端事先系上絲線，用注射器將藥液注入腸腔。當藥液到達腸段末端，用絲線結(jié)扎，然后取下注射器并結(jié)扎腸段前段。通過蠕動泵從頸靜脈給實驗鼠供血。在蠕動泵另一端開始收集血液，同時結(jié)扎門靜脈，待實驗完成后，收集腸道內(nèi)藥液。

無腸道菌實驗手術(shù)方法與有腸道菌實驗相同，不同之處在于藥液被注入小腸前，于小腸末端切一橫向口，用溫熱的生理鹽水洗凈腸內(nèi)容物后再進行后續(xù)操作。實驗持續(xù)15 h，收集的血液放入肝素化的離心管中，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液加入3倍量甲醇，渦旋2 min，1萬 r·min-1離心10 min，取上清液過045 μm濾膜，進行液相分析。

222腸壁酶代謝研究采用無腸菌實驗的手術(shù)方法。唯一不同的是在多成分藥液注入腸道循環(huán)前，非特異性CYP450酶抑制劑1氨基苯并三唑需要加入到?jīng)_洗液和藥液中。1 h后腸系膜靜脈收集18 mL血樣，處理方法同腸道菌實驗。

223肝代謝研究肝代謝后多成分進入血液系統(tǒng)，此實驗也是采用封閉腸環(huán)法，將川芎藥液封閉在結(jié)腸，不需要供血，不結(jié)扎門靜脈，在1 h后腹主動脈采血約10 mL，樣品處理同腸道菌實驗。

23液相和質(zhì)譜條件

色譜條件：采用Thermo Bos Hypersil C18色譜柱（21 mm ×150 mm， 24 μm），流動相003%甲酸水（A）甲醇（B），梯度洗脫（0～3 min，20%～25% B；3～7 min，25%～58% B；7～10 min，58%～60% B；10～15 min，60%～65% B；15～20 min，65%～80%B；20～24 min，80%～80% B），流速035 μL·min-1，柱溫30 ℃，檢測波長280 nm，進樣量2 μL。

質(zhì)譜條件：ESI源，正離子模式檢測，噴霧氣壓34474 kPa，干燥氣（N2）流速 50 L·min-1，干燥氣體溫度 330 ℃，氣化室溫度為 350 ℃，毛細管電壓+4 000 V，電暈放電電流正離子模式為40 μA，破碎電壓（Fragmentor）為100 V；掃描范圍100～1 000。

3結(jié)果

31川芎水煎液中主要成分液質(zhì)聯(lián)用分析

采用23下的色譜條件能夠?qū)Υㄜ核逡旱某煞謱崿F(xiàn)較好的分離，見圖1，對色譜圖進行分析，結(jié)果表明川芎中主要成分為內(nèi)酯類成分或酚酸類成分。對各色譜峰進行了串聯(lián)質(zhì)譜分析，結(jié)果見表1。

化合物1一級質(zhì)譜準分子離子峰為m/z 195[M+H]+，二級質(zhì)譜中有m/z 177為[M+H-H2O]+的碎片離子峰，與阿魏酸對照品數(shù)據(jù)一致，故化合物1為阿魏酸。

化合物2一級質(zhì)譜準分子離子峰為m/z 227[M+H]+，推測相對分子質(zhì)量為226，最大吸收波長為279 nm，與文獻[11]報導(dǎo)的洋川芎內(nèi)酯J相符，證明該化合物為洋川芎內(nèi)酯J。

化合物3和4的質(zhì)譜圖相似，只是質(zhì)譜響應(yīng)豐度略有不同。在一級質(zhì)譜準分子離子峰為m/z 247[M + Na]+，證明該化合物的相對分子質(zhì)量為224。二級質(zhì)譜中均存在m/z 207[M+H-H2O]+，189[M+H-2H2O]+等特征碎片離子，其UV最大吸收波長為277 nm，保留時間、質(zhì)譜數(shù)據(jù)和紫外數(shù)據(jù)均分別與洋川芎內(nèi)酯I和H對照品一致，因此化合物3和4分別為洋川芎內(nèi)酯I和H。

化合物5一級質(zhì)譜準分子離子峰為m/z 229[M+Na]+，一級質(zhì)譜中未出現(xiàn)m/z 207[M+H]+，推測該化合物相對分子質(zhì)量為206，二級質(zhì)譜中存在m/z 189[M+H-H2O]+，161[M+H-H2O-CO]+等碎片離子，其最大吸收波長為327 nm，與文獻[11]報導(dǎo)的洋川芎內(nèi)酯F相符，推測該化合物為洋川芎內(nèi)酯F。

化合物6一級質(zhì)譜準分子離子峰為m/z 229[M+Na]+，207[M+H]+證明該化合物相對分子質(zhì)量為206，二級質(zhì)譜中存在m/z 189[M+H-H2O]+，161[M+H-H2O-CO]+等碎片離子，其質(zhì)譜數(shù)據(jù)與文獻[12]報導(dǎo)一致，推測該化合物為3羥基丁基苯酞。

化合物7一級質(zhì)譜準分子離子峰為m/z 209[M+H]+，231[M+Na]+，推測其相對分子質(zhì)量為208，在二級質(zhì)譜中存在m/z 191，173，163，145等類似于內(nèi)酯類的碎片離子，其UV最大吸收波長為279 nm，與文獻[9]報導(dǎo)的洋川芎內(nèi)酯G相符，因此化合物7推測為洋川芎內(nèi)酯G。

化合物8一級質(zhì)譜中準分子離子峰為m/z 193[M+H]+，同時還有m/z 215[M+Na]+，推測其相對分子質(zhì)量為192，其二級譜產(chǎn)生m/z 175[M+H-H2O]+，147[M+H-H2O-CO]+等碎片離子，其UV最大吸收波長為279 nm，質(zhì)譜數(shù)據(jù)和紫外數(shù)據(jù)均與洋川芎內(nèi)酯A對照品一致，因此化合物8為洋川芎內(nèi)酯A。

化合物9，10和12一級質(zhì)譜具有相同的準分子離子峰m/z 191[M+H]+，化合物9二級質(zhì)譜產(chǎn)生碎片峰m/z 173[M+H-H2O]+，145[M+H-H2O-CO]+，其UV最大吸收波長為275 nm，經(jīng)與對照品比對，化合物9確定為正丁基苯酞?；衔?0和12有相同的裂解碎片，所以推測是順反異構(gòu)體。其二級質(zhì)譜中除了有m/z 173，145外，還有m/z 163[M+H-CO]+，155[M+H-2H2O]+，149[M+H-C3H6]+，117[M+H-H2O-CO-C2H4]+等碎片峰，其UV最大吸收波長在278 nm，與文獻[89]報道藁苯內(nèi)酯一致。一般情況下，在C18柱中反式較順式先出峰，所以化合物10為E藁苯內(nèi)酯，化合物12為Z藁苯內(nèi)酯。

化合物11和14質(zhì)譜圖相似，裂解碎片均相同，推測為同分異構(gòu)體。一級質(zhì)譜中產(chǎn)生分子離子峰m/z 279[M+H]+，推測相對分子質(zhì)量為278。同時二級質(zhì)譜產(chǎn)生m/z 261[M+H-H2O]+和233[M+H-H2O-CO]+等類似于內(nèi)酯類的裂解碎片，根據(jù)元素組成分析該化合物分子式為C16H22O4，相對分子質(zhì)量實測值為279158 29，與理論值279159 09相差28，其UV最大吸收波長在278 nm，與文獻[9]報導(dǎo)洋川芎內(nèi)酯M和Q數(shù)據(jù)類似，故暫時推測化合物11和14分別為洋川芎內(nèi)酯M和Q。

化合物13一級質(zhì)譜中產(chǎn)生準分子離子峰m/z 195[M+H]+，二級裂解質(zhì)譜中產(chǎn)生m/z 177[M+H-H2O]+和149 [M+H-CO]+的碎片峰。根據(jù)元素組成分析該化合物分子式為C12H18O2，相對分子質(zhì)量實測值為195137 3，與理論值195137 9相差34 ppm，與文獻[9]報道的新蛇床內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)相同，故化合物13推測為新蛇床內(nèi)酯。

32川芎水煎液多成分吸收與序貫代謝研究

由于前期結(jié)果已經(jīng)表明川芎多成分在人工胃液和人工腸液中穩(wěn)定性良好[7]，因此繼續(xù)運用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對川芎多成分在腸壁、腸道菌群和肝臟3個部位序貫過程的吸收和代謝進行了研究，結(jié)果見表2。

由表中數(shù)據(jù)分析可知，阿魏酸，洋川芎內(nèi)酯J，I，F(xiàn)，G，3羥基丁基苯肽在所有樣品中均存在，說明這6個成分可以一直以原型的形式吸收入血；正丁基苯酞，E藁本內(nèi)酯，Z藁本內(nèi)酯，新蛇床內(nèi)酯，洋川芎內(nèi)酯A，Q，在所有樣品中均不存在，說明這6個成分不吸收或者在進入肝門靜脈血前已經(jīng)被代謝；洋川芎內(nèi)酯H在肝代謝的樣品中不存在，說明其會被肝代謝；洋川芎內(nèi)酯M在有菌樣品和肝代謝樣品中不存在，而在其他2個樣品中存在，說明其會被腸道菌和肝代謝。

4討論

由實驗結(jié)果可知，阿魏酸，洋川芎內(nèi)酯J，I，F(xiàn)，G，3羥基丁基苯肽這6個成分能以原型吸收入血，并在序貫代謝的各個階段均不代謝，可作為中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)中首選腸滲透性評價成分。正丁基苯酞，E藁本內(nèi)酯，Z藁本內(nèi)酯，新蛇床內(nèi)酯，洋川芎內(nèi)酯A，Q這6個成分因其難以在肝門靜脈中查見，所以不適于選擇作為腸滲透性評價成分。洋川芎內(nèi)酯M在腸道內(nèi)可被菌群代謝，其吸收情況受菌群影響不穩(wěn)定，難以找到包含腸道菌群影響因素的實驗手段，不適宜作為中藥生物藥劑學(xué)分類系中的腸滲透性評價成分。洋川芎內(nèi)酯H可以原型吸收后只在肝發(fā)生代謝，可用于作為腸滲透性評價的可選成分，但該成分肝代謝轉(zhuǎn)化效率及產(chǎn)物與原型化合物定量吸收回溯問題十分復(fù)雜，只能作為腸滲透性評價的備選方案。

通過川芎多成分序貫代謝過程動態(tài)追蹤研究，可全面地、完整地、系統(tǒng)地描述多成分吸收代謝輪廓。多成分吸收代謝一直是科學(xué)研究的難點，但作為中藥的用藥特點，又是不可回避的內(nèi)容。隨著近年來腸道首過代謝越來越受到研究人員的重視[13]，對于多成分藥物肝腸吸收代謝的差異性及連續(xù)性描述也變得越來越重要。因此，在研究中應(yīng)該堅持多成分同時測定的原則，并注重過程的序貫銜接的整體性，才能使多成分為支撐的中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)中腸滲透性評價成分選擇更具科學(xué)性。

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[責任編輯孔晶晶]