在石家莊跟世界一流較勁，韓春雨“一鳴驚人”

令人吃驚的是，河北科技大學(xué)副教授韓春雨團(tuán)隊(duì)的研究?jī)?yōu)于麻省理工、哈佛、斯坦福等名校的同行

2016年5月2日，韓春雨與合作者的文章終于發(fā)表了—先被《科學(xué)》（Science）審稿小半年后拒稿，后歷時(shí)9個(gè)月終被《自然生物技術(shù)》（Nature Biotechnology）接收。

接下來的幾天里，他每天都會(huì)收到幾十上百封來自同行的郵件，但并非每封都能及時(shí)回復(fù)。

“實(shí)驗(yàn)室人手有限，處理不過來那么多郵件，還望同行海涵?！表n春雨在電話里說，滿是歉意。他和合作者發(fā)明的新的基因編輯技術(shù)，正引起國內(nèi)同行的熱切關(guān)注。他們紛紛追問：“誰是韓春雨？”

更精確，效率更高

42歲的韓春雨是河北科技大學(xué)副教授，因?yàn)樾掳l(fā)表的工作“一鳴驚人”。

簡(jiǎn)單地說，韓春雨團(tuán)隊(duì)發(fā)明了一種新的基因編輯技術(shù)（NgAgo-gDNA），適合在人類細(xì)胞中基因組編輯，不同于已有最時(shí)興的技術(shù)（CRISPR-Cas9）。后者通過RNA尋找替換序列，而新技術(shù)通過DNA作為介導(dǎo)尋找替換目標(biāo)。

NgAgo是短語Natronobacterium gregoryi Argonaute的簡(jiǎn)稱。韓春雨團(tuán)隊(duì)就是利用格氏嗜鹽堿桿菌（Natronobacterium gregoryi）的Argonaute實(shí)現(xiàn)了DNA引導(dǎo)的基因組編輯，并發(fā)現(xiàn)NgAgo作為一種DNA介導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶，適合在人體細(xì)胞中進(jìn)行基因組編輯。

Argonaute作為一個(gè)核酸內(nèi)切酶家族，最早由荷蘭瓦赫寧恩大學(xué)的約翰-范德歐斯特研究組證明這一家族的同源蛋白酶活，可以有效地利用單鏈脫氧核糖核酸作為短介質(zhì)，去相對(duì)精準(zhǔn)地切割基因組靶點(diǎn)。

范德歐斯特的這一發(fā)現(xiàn)開啟了基因組工程的新篇章，因?yàn)橹暗拇蠖鄶?shù)基因組工程研究是基于RNA的（CRISPR-Cas9、TALEN等，鋅指蛋白是基于DNA的但是沒有實(shí)現(xiàn)可編碼的優(yōu)勢(shì)），哈佛大學(xué)分子與細(xì)胞生物系副研究員段昕認(rèn)為，“這一進(jìn)展給大家引入了一個(gè)新的思路去進(jìn)一步改造”。

韓春雨對(duì)自己的工作很有自信

目前世界各個(gè)實(shí)驗(yàn)室最為流行的基因編輯工具是CRISPR-Cas9。從原理上來說，早期的DNA編輯技術(shù)是通過蛋白（如鋅指蛋白）來尋找需要替換的序列，Cas9則是通過RNA（引導(dǎo)RNA，即gRNA）來尋找替換的序列，由于比操作蛋白質(zhì)簡(jiǎn)單得多，Cas9技術(shù)迅速被廣泛使用。

但是，Cas9需要19個(gè)配對(duì)的堿基，并且要求在需要編輯的基因組上這19個(gè)堿基后面必須緊鄰一個(gè)符合一定特征的三堿基序列（PAM序列），這在一定程度上限制了gRNA的設(shè)計(jì)，而NgAgo–gDNA系統(tǒng)不需要PAM序列，拓寬了其設(shè)計(jì)范圍。

NgAgo結(jié)合24個(gè)堿基的gDNA，比Cas9的gRNA（19個(gè)堿基）要長(zhǎng)5個(gè)堿基，理論上其精確性要提高1024（4的5次方）倍。DNA編輯相當(dāng)于在一本書中的某個(gè)位置找到一個(gè)單詞將它替換成另一個(gè)單詞，并且要保證書中其它地方的單詞不被替換。顯而易見，如果替換的是the這樣的簡(jiǎn)單單詞，那么可能從書中找到多個(gè)地方，而找pneumonoultramicroscopicsilicovolcanoconiosi這樣的單詞則不太可能找錯(cuò)。

韓春雨團(tuán)隊(duì)的研究還發(fā)現(xiàn)，NgAgo–gDNA系統(tǒng)對(duì)向?qū)蛄?靶序列錯(cuò)配容忍度很低。gDNA上任何一個(gè)堿基的變換都會(huì)降低NgAgo的切割效率，如有三個(gè)錯(cuò)配則使其完全失活。這在另外一個(gè)機(jī)制上提高了NgAgo使用的精確性，特別是一些富含GC序列的地方，NgAgo系統(tǒng)比Cas9系統(tǒng)效率更高。

韓春雨團(tuán)隊(duì)在論文中還介紹，與Cas9相似，Argonautes在基因表達(dá)抑制及抵御外源核酸中起關(guān)鍵作用。但是，Argonautes在許多方面不同于Cas9。比如，Cas9只存在于原核生物中，而Argonautes在進(jìn)化過程中保守，存在于幾乎所有生物體中;盡管大多數(shù)的Argonautes結(jié)合單鏈（ss）RNAs，在RNA沉默中起重要作用，一些Argonautes卻可以結(jié)合ssDNAs并切割靶DNA;正確的Cas9結(jié)合要求向?qū)NA必須有一個(gè)3′RNA-RNA雜化結(jié)構(gòu)，Argonaute結(jié)合則不要求特異的一致的向?qū)NA二級(jí)結(jié)構(gòu);Cas9只可以切割PAM上游的靶序列，而Argonaute不要求靶序列上存在特異的序列。當(dāng)Argonaute與向?qū)蛄薪Y(jié)合時(shí)，它們可以影響彼此的生物化學(xué)特性，并作為一個(gè)整體起作用。

“因此，從理論上說，NgAgo的脫靶率更低”，韓春雨說。

荷蘭瓦赫寧恩大學(xué)約翰-范德歐斯特研究團(tuán)隊(duì)

“幸好NgAgo足夠給力”

韓春雨是石家莊人，本科畢業(yè)于石家莊的河北師范大學(xué)，他父母也在該校任教。

1995年，韓春雨來到北京，先在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院攻讀碩士學(xué)位，后在中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院）接受博士研究生訓(xùn)練，2003年獲得博士學(xué)位。此后，他并沒有尋找教職，在協(xié)和的實(shí)驗(yàn)室繼續(xù)一項(xiàng)關(guān)于“人類Bex2與LMO2相互作用、調(diào)節(jié)新型DNA結(jié)合復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄活性”的研究，2005年該結(jié)果發(fā)表在《核酸研究》（Nucleic Acids Research），韓春雨為第一作者，這篇文章也成為他科研生涯中具有標(biāo)志性的成果。

2006年，32歲的韓春雨離開北京，到河北科技大學(xué)擔(dān)任教職。十年后，他發(fā)表了獨(dú)立研究生涯以來最為重要的工作。

韓春雨的研究方向是真核基因表達(dá)調(diào)控，特別是和腫瘤相關(guān)的基因，以及表觀遺傳相關(guān)蛋白，RNA的功能研究，例如，長(zhǎng)非編碼RNA的功能及其他。近些年基因編輯技術(shù)，尤其是CRISPR-Cas9的不斷完善，深刻地影響到整個(gè)生命科學(xué)領(lǐng)域，韓春雨的實(shí)驗(yàn)室也用上了CRISPR-Cas9這一工具，他本人也一直在關(guān)注基因編輯領(lǐng)域的進(jìn)展，有過一些想法，但并沒有下決心動(dòng)手。

促使韓春雨真正動(dòng)手的是2014年年初的兩篇文獻(xiàn)，其中一篇是范德歐斯特研究組發(fā)表在《自然》（Nature）雜志的。段昕介紹，范德歐斯特工作的局限性在于他們實(shí)驗(yàn)所需要的溫度在65-75攝氏度，這使得很多實(shí)驗(yàn)不能在生理?xiàng)l件（哺乳動(dòng)物在37攝氏度左右）下完成。

當(dāng)時(shí)，北京大學(xué)一位研究員得知范德歐斯特的研究后非常興奮。他判斷，TtAgo可以發(fā)展為一個(gè)更簡(jiǎn)單的基因編輯工具，并產(chǎn)生了一個(gè)想法：哺乳動(dòng)物中是否在特定時(shí)期或特定細(xì)胞中存在類似現(xiàn)象，比如決定細(xì)胞分化或抗體形成的過程。不過，他的實(shí)驗(yàn)室在合成了人源密碼子優(yōu)化的TtAGO 后，嘗試了幾次切GFP序列，卻以失敗告終。

幾乎在同一時(shí)間，韓春雨的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)展則十分順利，“大概是兩個(gè)月就有結(jié)果出來了”。

段昕介紹，韓春雨團(tuán)隊(duì)做的，就是進(jìn)一步搜尋Argonaute的同源蛋白。幸運(yùn)的是，大量的已知大型測(cè)序數(shù)據(jù)給了他們很多有效的幫助，找到并進(jìn)一步證明了來自不同菌株格氏嗜鹽堿桿菌的Argonaute同源蛋白可以在生理?xiàng)l件下實(shí)現(xiàn)類似的功能?！绊n的工作把系統(tǒng)進(jìn)一步優(yōu)化，而且使得短介導(dǎo)DNA的準(zhǔn)確性和識(shí)別長(zhǎng)度有了重大突破?！倍侮空f。

北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究員魏文勝課題組也想嘗試DNA介導(dǎo)的Argonaute，但TtAGO的特點(diǎn)是工作溫度比較高。“這篇文章比較聰明，還是走對(duì)了路，沒有研究如何使高溫才能工作的酶通過構(gòu)象改變達(dá)到降溫，而是找到這樣一株可以在37度工作的Argonaute?！?魏文勝說。

之后，韓春雨一邊向《科學(xué)》雜志投稿，一邊和實(shí)驗(yàn)室的幾個(gè)學(xué)生一起完善結(jié)果。當(dāng)時(shí)文章最主要的結(jié)果是NgAgo確實(shí)可以做基因編輯工具，但“審稿人要求的比較完美”，來回審了小半年之后，“最后被拒了”。

2014年秋天，韓春雨跟沈嘯提起自己正在做的NgAgo的工作，提出了幾個(gè)候選的工具?！斑@么好的課題和想法，我當(dāng)然全力支持并加入了。”沈嘯回憶道。他是浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系研究員，在中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士畢業(yè)前一年，與韓春雨合作了發(fā)表在《核酸研究》的論文。2003年博士畢業(yè)以后，沈嘯曾在美國一所大學(xué)從事博士后研究，2015年入選浙江大學(xué)“百人計(jì)劃”。

在被《科學(xué)》拒稿后，韓春雨和實(shí)驗(yàn)室的學(xué)生繼續(xù)補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)，而沈嘯在項(xiàng)目和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上提供建議，他們發(fā)現(xiàn)了更多關(guān)于NgAgo的特性。

“幸好NgAgo也比較給力，發(fā)現(xiàn)它是one-guide faithful的?！表n春雨笑著說。

2015年6月3日，這篇僅有五人署名的文章的被投往《自然生物技術(shù)》，9個(gè)月之后，文章被接收，2016年5月2日在線發(fā)表。

“文章發(fā)出來是好事，也是壞事”

在整個(gè)生物界唯強(qiáng)大的CRISPR-Cas9馬首是瞻的時(shí)代，韓春雨的這一發(fā)現(xiàn)引發(fā)了諸多媒體和同行的熱情關(guān)注。

有評(píng)論認(rèn)為，“（如果）未來中國任何一所普通的科研院校都能出現(xiàn)這種激動(dòng)人心的科研成果，那么中國的科研實(shí)力才是真正的達(dá)到世界領(lǐng)先水平”。

國內(nèi)關(guān)注生物行業(yè)的媒體評(píng)價(jià)說，“該成果核心為一項(xiàng)替代目前通用的Cas9的基因組編輯新技術(shù)，這一成果打破了國際基因編輯技術(shù)的壟斷”。

韓春雨對(duì)此評(píng)價(jià)不敢茍同，他認(rèn)為，NgAgo–gDNA系統(tǒng)和Cas9都為基因編輯應(yīng)用提供了更好的工具和多樣化的選擇，各有各的用處。

沈嘯則對(duì)NgAgo可以取代Cas9 的評(píng)價(jià)持謹(jǐn)慎態(tài)度，“最客觀的說法是找到了新的基因編輯工具”。他認(rèn)為，Cas9基因編輯系統(tǒng)有點(diǎn)復(fù)雜，每當(dāng)把它某一個(gè)劣勢(shì)用某種技巧修正后，使之特性更高、更有效，就會(huì)是一篇很好的論文，每進(jìn)行一個(gè)改良，就是一篇CNS的論文?！按蟛糠秩税ㄒ恍┛茖W(xué)家可能自然而然受一種權(quán)威的影響，Cas9太強(qiáng)大了，大家都把目光集中在Cas9上，想怎么磨這把刀，把它做得更好更漂亮。”

正是因?yàn)镃as9太熱，很多人就忽視了去尋找更好的甚至先天就可以規(guī)避這些問題的工具。前述的北京大學(xué)研究員透露，他們2014年也在做TtAGO的實(shí)驗(yàn)，但部分因?yàn)橐蕾嘋as9而放棄繼續(xù)研究Argonaute 。“學(xué)生覺得不太靠譜，而實(shí)驗(yàn)室里其他人Cas9 用得十分熟練，都覺得沒有必要再換了，我也沒有堅(jiān)持?！彼粺o遺憾地說。

韓春雨團(tuán)隊(duì)的工作已經(jīng)證實(shí)了一個(gè)新的、有自己特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)的基因編輯工具，但是如何利用它，找到它更多的特性，還有很多工作要做。

“我和韓春雨現(xiàn)在是非常非常急迫的心理，文章發(fā)出來是好事也是壞事，好事是這項(xiàng)工作讓大家知道了，壞事是大范圍的競(jìng)爭(zhēng)，我們的工作是不是能趕上趟，繼續(xù)做下去，是不是我們中國的科學(xué)家還能繼續(xù)報(bào)道它?！鄙驀[說，國外的很多實(shí)驗(yàn)室設(shè)備條件非常強(qiáng)，“我們沒法比，他們一上來做的話，很多東西會(huì)很快出結(jié)果?！?h3>石家莊的四人實(shí)驗(yàn)室

無論是在微信圈還是海外華人的論壇，人們不約而同地將韓春雨和麻省理工學(xué)院博德研究所的核心研究員張鋒聯(lián)系起來。1981年出生的張鋒同樣來自石家莊，以在基因編輯領(lǐng)域的諸多貢獻(xiàn)而被人們所熟知，包括首次報(bào)告了CRISPR-Cas9在哺乳動(dòng)物體基因組編輯中的應(yīng)用，找到更小的Cpf1蛋白來替代Cas9酶。

與韓春雨一直在國內(nèi)接受科學(xué)訓(xùn)練、從事研究不同，張鋒有海外學(xué)習(xí)的背景，更有在知名實(shí)驗(yàn)室研究的經(jīng)歷。11歲那年，張鋒隨母親到美國愛荷華州的得梅因定居，高中時(shí)就在一個(gè)基因治療實(shí)驗(yàn)室實(shí)習(xí)，全獎(jiǎng)進(jìn)入哈佛大學(xué)學(xué)習(xí)化學(xué)和物理學(xué)，期間跟隨知名華人科學(xué)家莊小威做過研究，后來到光遺傳學(xué)主要發(fā)明人之一卡爾·戴瑟羅特（Karl Deisseroth）在斯坦福大學(xué)的實(shí)驗(yàn)室，參與到光遺傳學(xué)發(fā)明的部分工作。在哈佛大學(xué)短暫地停留之后，張鋒受聘于博德研究所，一個(gè)科研經(jīng)費(fèi)和研究人員都可以在美國排到前列的研究機(jī)構(gòu)。

而在河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院的實(shí)驗(yàn)室，“離心機(jī)是‘飛鴿牌，與國內(nèi)自行車品牌相同，從0加速到12000轉(zhuǎn)大概需要1分鐘的時(shí)間，”韓春雨不無幽默地說。

直到今天，韓春雨所在的的生物科學(xué)與工程學(xué)院還沒有博士點(diǎn)，韓春雨實(shí)驗(yàn)室的學(xué)生都是碩士研究生。理論上，韓春雨每年可以招五六個(gè)碩士研究生，但是真正能夠跟他一起專注科研的，也只有一兩個(gè)人。

包括《自然生物技術(shù)》的這篇論文，跟韓春雨一起做實(shí)驗(yàn)的一共三個(gè)人，其中第一作者高峰兩年前就從河北科技大學(xué)碩士畢業(yè)，那時(shí)NgAgo的主要結(jié)果剛剛做出來，高峰沒去找工作，也沒有申請(qǐng)博士，而是留在導(dǎo)師韓春雨的實(shí)驗(yàn)室繼續(xù)工作，為了省錢，甚至睡覺都在實(shí)驗(yàn)室。這一情景與韓春雨當(dāng)年博士畢業(yè)后留在協(xié)和繼續(xù)未完成的科研工作有著驚人的相似。

“韓實(shí)驗(yàn)室的工作是很了不起的?！北本┐髮W(xué)生命科學(xué)學(xué)院饒毅實(shí)驗(yàn)室研究生張翼評(píng)論說，“他們唯一的生物信息學(xué)工具可能是NCBI-psiBLAST，他們的Argonaute都是從菌種庫買來的菌里面克隆出來，根本沒有花錢合成基因。”即使是在這么艱難的工作環(huán)境下，他們不僅找到了NBT文章中報(bào)道的NgAgo，還找到了（他們專利里報(bào)道的）一大堆別的Ago，都具有在低溫（10-50攝氏度）下結(jié)合5p-ssDNA，造成靶DNA雙鏈斷裂的能力。

很多人對(duì)韓春雨能夠在如此簡(jiǎn)陋的環(huán)境下取得開創(chuàng)性的工作感到驚訝，但在他的大學(xué)同學(xué)、河北師范大學(xué)特聘教授徐小冬眼里，她對(duì)韓春雨能夠做出現(xiàn)在的工作一點(diǎn)也不感到奇怪，雖然韓春雨沒有海外留學(xué)經(jīng)歷，但是也受到了很好的專業(yè)科學(xué)訓(xùn)練。她認(rèn)為，對(duì)一個(gè)受過專業(yè)科學(xué)訓(xùn)練的科研工作者來說，占用資源的多少并不會(huì)決定他是否能夠做出很好的工作。

“他這個(gè)人蠻有個(gè)性，從來不是那種循規(guī)蹈矩的人，他能夠堅(jiān)持一些東西，守著自己的一畝三分地，也敢于表達(dá)自己，挑戰(zhàn)威權(quán)……投稿能夠較這么長(zhǎng)時(shí)間的勁，說明對(duì)自己的工作很有自信。”徐小冬說。

如今，面臨四面八方涌來的合作邀請(qǐng)，韓春雨統(tǒng)統(tǒng)交給沈嘯來處理?！八娮R(shí)廣，也是一個(gè)好的合作者……我主要在實(shí)驗(yàn)室干活，而且我也喜歡這樣的生活?！表n春雨說。

清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院

教授 魯白

在一所不太有名的大學(xué)，我們自己培養(yǎng)出的科研人員也能做出這樣的成果，能夠和美國的最新技術(shù)叫板，是一件了不起的事情。NgAgo-gDNA技術(shù)的知識(shí)產(chǎn)權(quán)掌握在韓春雨團(tuán)隊(duì)手中，目前還沒有看到有人與之競(jìng)爭(zhēng)，這又是一大優(yōu)勢(shì)。CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)明者中有美國麻省理工學(xué)院的華人科學(xué)家張鋒等人，也有美國加州大學(xué)的珍妮弗·杜德納等人，由于該技術(shù)在科學(xué)上和商業(yè)上的巨大前景，雙方團(tuán)隊(duì)正為這一技術(shù)的專利權(quán)歸屬打官司。我們自己掌握了知識(shí)產(chǎn)權(quán)，不僅有利于中國生命科學(xué)界使用這項(xiàng)技術(shù)，一些國外的大公司也可能會(huì)主動(dòng)來付費(fèi)要求得到技術(shù)授權(quán)。

現(xiàn)在一些科研評(píng)價(jià)體系往往是講名氣、擺資歷，不利于年輕人發(fā)揮創(chuàng)造性，希望能夠借韓春雨的事例，呼吁中國科學(xué)界做出體制上、文化上的突破，鼓勵(lì)年輕人冒頭創(chuàng)新，這也符合國家號(hào)召創(chuàng)新的政策。

哈佛大學(xué)分子與細(xì)胞生物系

副研究員 段昕

韓的工作把系統(tǒng)進(jìn)一步優(yōu)化，而且使得短介導(dǎo)DNA的準(zhǔn)確性和識(shí)別長(zhǎng)度有了重大突破。

我們希望看到的是更多的不同基因靶點(diǎn)，不同組織細(xì)胞亞型，不同的發(fā)育階段，不同的物種和不同的遞送手段（delivery method）的數(shù)據(jù)。以張鋒為代表的MIT-Broad Institute的同仁在過去五年間對(duì)于CRISPR-Cas9的改進(jìn)和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用方面做出了舉世矚目的貢獻(xiàn)。希望NgAgo的故事會(huì)是一樣的精彩激烈。這會(huì)是一場(chǎng)國際競(jìng)賽。祝中國韓好運(yùn)！

而這說明幾點(diǎn)：

第一，許多生物研究資源（比如NCBI包括pubmed，PDB，引物數(shù)據(jù)庫，測(cè)序，常用載體，蛋白純化方法）無論是MIT也好還是河北科大也好，都是可以獲取的，只要你有心有想法（當(dāng)然需要大型儀器和經(jīng)費(fèi)支撐的基因組學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)另說）;

第二， 踏實(shí)勤奮其實(shí)是好的科研必要條件，現(xiàn)行科研體制（美國是鼻祖，中國學(xué)自美國）有些浮夸和浮躁，更像商業(yè)運(yùn)營;

第三，也是我今天跟同學(xué)討論的，你所在的機(jī)構(gòu)越好（比如broad或者RU這種神級(jí)機(jī)構(gòu)），但作為年輕獨(dú)立PI你所付出的許多努力是在維持在這些院所的生存。我跟同學(xué)開玩笑說，你在哈佛醫(yī)學(xué)院能當(dāng)一個(gè)正教授所需具備的能力可以去一個(gè)小國家當(dāng)總統(tǒng)了，但你把這些努力用在別的地方，可能回報(bào)率更高，而不是只維系了一個(gè)在哈佛的教授頭銜。