龍葵中產(chǎn)皂苷類內(nèi)生真菌的分離與篩選

劉浪浪，張　云，李端琢，吳　偉

(湖北理工學院 醫(yī)學院，湖北 黃石 435003)

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龍葵中產(chǎn)皂苷類內(nèi)生真菌的分離與篩選

劉浪浪，張云，李端琢，吳偉*

(湖北理工學院 醫(yī)學院，湖北 黃石 435003)

摘要：以傳統(tǒng)藥用植物龍葵為實驗材料，分離篩選能產(chǎn)生皂苷類活性成分的內(nèi)生真菌。通過組織分離法，從龍葵的組織中分離得到24株內(nèi)生菌。發(fā)酵實驗結(jié)果表明，產(chǎn)皂苷類活性物質(zhì)的菌株數(shù)共有8株，通過物理化學方法驗證皂苷類物質(zhì)主要存在于內(nèi)生真菌的發(fā)酵液中。

關(guān)鍵詞：龍葵；皂苷；內(nèi)生真菌；分離

植物內(nèi)生菌是指從外觀上無任何明顯病態(tài)的植物組織中分離得到的微生物，包括互惠或中性的內(nèi)共生微生物，也包括在健康植物體內(nèi)的某些潛伏的或在一定條件下致病的植物病原微生物[1]。植物內(nèi)生菌種類繁多，包括細菌、真菌以及放線菌，進入21世紀后研究人員在水稻、玉米等喬本科農(nóng)作物植物中發(fā)現(xiàn)多種具有固氮功能的內(nèi)生真菌，引起了研究人員的高度重視?，F(xiàn)階段，研究學者關(guān)注最多的也是植物中存在的內(nèi)生真菌，對內(nèi)生真菌的植物主要有紅豆杉、長春花、桃兒七和南海紅樹等[2-5]。

龍葵草是茄科一年生草本植物，在全國各地均有分布，且種植方便，便于利用。龍葵草中含有多種藥用成分，例如甾體皂苷類化合物、黃酮類化合物等，尤其甾體皂苷類化合物，在防治疾病方面具有重要價值，如抗腫瘤、防治心腦血管疾病、降壓、消炎、解熱、鎮(zhèn)痛等[6]，具有極高的藥用價值以及開發(fā)潛力。目前關(guān)于龍葵草中內(nèi)生微生物的相關(guān)報道僅限于內(nèi)生細菌和放線菌[7]，而對龍葵草內(nèi)生真菌的生物多樣性及藥用價值方面研究較少，因此對龍葵草內(nèi)生真菌的分離方法及次生代謝產(chǎn)物的研究具有較大的研究空間和使用價值[8]。本研究嘗試從成熟龍葵草中分離篩選內(nèi)生真菌，并進行發(fā)酵實驗，對發(fā)酵產(chǎn)物甾體皂苷的產(chǎn)量進行比較和討論，為利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)龍葵草藥用成分、擴大龍葵草的藥用價值奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

龍葵草，采自湖北理工學院植物園。取樣后放入密封袋中，24 h內(nèi)洗凈根、莖、葉，用于內(nèi)生真菌的富集培養(yǎng)及分離。

1.2儀器與設(shè)備

RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵：上海亞榮生化儀器廠；THZ-D恒溫培養(yǎng)箱：太倉市實驗設(shè)備廠；ZWY-Z40恒溫振搖培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；752SP型紫外-可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；HWS26水浴鍋：上海一恒科技有限公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海姚氏儀器設(shè)備廠；SW-CJ-ZD無菌操作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3培養(yǎng)基的配置

1)LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，瓊脂5 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌25 min，液體培養(yǎng)基不加瓊脂。

2)查氏培養(yǎng)基：磷酸氫二鈉1 g，硝酸鈉3 g，四水合硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5g，硫酸亞鐵0.01 g，瓊脂30 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌25 min，液體培養(yǎng)基不加瓊脂[9]。

1.4實驗方法

1.4.1龍葵草的預(yù)處理

將采集到的新鮮龍葵草洗凈，選取健康組織，洗凈，剪成2 cm左右小段，置于錐形瓶中備用。

1.4.2龍葵草表面消毒劑的選擇

按5點取樣法選取葉片中沒有蟲斑、病斑的健康葉片，剪取2 cm2小葉片，共40片，分為2組，按以下方式做不同處理后培養(yǎng)觀察。

1)A組：70%酒精浸泡60 s，3.5%次氯酸鈉(有效氯)浸泡3 min，再用70%酒精浸泡30 s，之后用無菌水沖洗3次，每次5 min。

2)B組：70%酒精浸泡60 s，0.1%升汞浸泡1 min，再用70%酒精浸泡30 s，之后用無菌水沖洗3次，每次5 min。

1.4.3龍葵草表面消毒時間的選擇

按5點取樣法選取葉片中沒有蟲斑、病斑的健康葉片，剪取2 cm2小葉片，分為6組。首先70%酒精浸泡60 s，然后3.5%次氯酸鈉(有效氯)浸泡，再用70%酒精浸泡30 s，最后用無菌水清洗3次，每次5 min。各組實驗在3.5%(有效氯)次氯酸鈉浸泡時間分別為1，2，3，4，5，6 min。使用移液槍將最后一次沖洗液100 μL置于LB培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～7 d，觀察菌落生長情況。

1.4.4內(nèi)生真菌的分離篩選

龍葵草中內(nèi)生真菌的篩選過程包括龍葵草根、莖、葉的消化，消化液的培養(yǎng)及內(nèi)生真菌的純化與發(fā)酵3個階段。

1.4.4.1龍葵草根、莖、葉的消化

將已表面消毒的龍葵草根、莖、葉置于錐形瓶，再加入含有1%纖維素酶、1%SDS及PBS緩沖溶液，振搖均勻，30 ℃，120 r/min恒溫振搖箱中處理1 h。

1.4.4.2消化液的培養(yǎng)

將錐形瓶取出，使用移液槍吸取消化液，分別向查氏培養(yǎng)基中加入100 μL原液、10倍稀釋液、100倍稀釋液，涂布均勻，并做好空白對照組培養(yǎng)基，將所有培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～14 d。

1.4.4.3內(nèi)生真菌的純化與發(fā)酵

將已篩選出的龍葵草內(nèi)生真菌劃線培養(yǎng)至純培養(yǎng)，將純培養(yǎng)轉(zhuǎn)入查氏液體培養(yǎng)基中，每100 mL中約菌餅20塊，將錐形瓶移入30 ℃，120 r/min恒溫振搖培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～14 d。

1.4.5內(nèi)生真菌發(fā)酵液中皂苷類活性物質(zhì)的檢測

1.4.5.1液體培養(yǎng)基及菌絲的處理

將培養(yǎng)7 d的液體培養(yǎng)基離心、抽濾，收集濾液和菌絲。菌絲置于50 ℃干燥，研磨后用正丁醇浸泡3次，每次24 h，然后50 ℃下減壓濃縮，并定容至10 mL。濾液使用正丁醇萃取3次，每次萃取24 h，然后50 ℃下減壓濃縮，并定容至10 mL。

1.4.5.2液體培養(yǎng)基中皂苷類活性物質(zhì)的初步鑒定

1)物理發(fā)泡法：取1 mL菌液，加入10 mL水，煮沸10 min，振搖后產(chǎn)生泡沫放置15 min后觀察形態(tài)，另取帶塞試管2只各加發(fā)酵液1 mL，一管加5% NaOH 2 mL，另一管加5% HCl溶液2 mL，密塞，振搖1 min，產(chǎn)生大量蜂窩狀泡沫，比較加堿管是否比加酸管高2倍以上。

2)化學方法：菌液稀釋后加入濃硫酸1滴，觀察是否產(chǎn)生色階變化[7]。

1.4.5.3薯蕷皂苷標準曲線的制備。

精密稱取薯蕷皂苷標準品9.985 0 mg，使用甲醇定容于10 mL容量瓶，制成0.999 9 mg/mL薯蕷皂苷-甲醇標準液備用。精密吸取60，120，180，240，300，360 μL置于10 mL容量瓶中，水浴蒸干甲醇溶劑，冷卻后加入5%甲醇-冰醋酸溶液0.4 mL，振搖溶解后加入高氯酸1.6 mL，搖勻后放入70 ℃水浴15 min，然后流水冷卻，冰醋酸溶液定容，搖勻后放置10 min；相同條件下不加標準品溶液制備空白溶液，用紫外分光光度計于545 nm處測吸光度，制備標準曲線，回歸方程為A= 0.0055C+0.0094，R2=0.9947。

1.4.5.4發(fā)酵液中皂苷類活性物質(zhì)的含量測定

將已培養(yǎng)7 d的液體培養(yǎng)基抽濾，分離出菌絲與濾液，作不同處理，處理方法見1.4.5.1。將處理液使用紫外分光光度儀測定吸光度，利用標準曲線計算皂苷類活性物質(zhì)的含量。

1.4.5.5龍葵草及發(fā)酵液中皂苷類活性物質(zhì)的TLC檢測。

1)龍葵草植株干燥粉碎后過80目篩，置于圓底燒瓶中，加去離子水適量于40 ℃恒溫箱中發(fā)酵24 h，取濃硫酸5 mL逐滴加入并不斷搖動，加熱回流4 h，再加氫氧化鈉調(diào)pH值至7左右，抽濾得濾渣，80 ℃干燥2 h，并用石油醚索氏提取至無色，旋轉(zhuǎn)揮發(fā)干石油醚并用氯仿溶解，得龍葵草皂苷類活性成分樣品溶液1。

2)發(fā)酵液使用同體積正丁醇萃取3次，每次24 h，合并萃取液，濃縮，取適量，揮干正丁醇，加入氯仿適量，得龍葵草內(nèi)生真菌發(fā)酵液樣品溶液2。

3)取薯蕷皂苷標準品，加入氯仿溶解，得薯蕷皂苷標準溶液。

4)將以上樣品溶液1、樣品溶液2以及標準品溶液點于已于150 ℃活化1 h硅膠薄層板中，揮去溶劑，轉(zhuǎn)入層析缸，層析液為氯仿-正丁醇-水(15∶5∶1)，顯色液為10%硫酸乙醇溶液，105 ℃烘3～5 min，至斑點清晰。

2結(jié)果與討論

2.1龍葵草表面消毒劑的選擇

消毒劑消毒效果不好易導(dǎo)致龍葵草表面消毒效果達不到要求，使消化液中混入雜菌；消毒劑消毒效果過強易導(dǎo)致消毒劑滲入植物組織內(nèi)部，殺死龍葵草內(nèi)生真菌，影響內(nèi)生真菌的多樣性，所以，消毒劑的選擇將直接影響龍葵草內(nèi)生真菌的篩選過程，實驗結(jié)果如表1所示。

表1　龍葵草表面用消毒劑的選擇

研究結(jié)果表明，采用次氯酸鈉作為表面消毒劑后其清洗液中雜菌檢出率小于使用升汞作為表面消毒劑；觀察培養(yǎng)皿中葉片的顏色發(fā)現(xiàn)，升汞處理后的葉片顏色明顯深于采用次氯酸鈉處理后的葉片顏色，升汞處理的邊緣有焦黃的顏色，提示采用升汞處理可能處理過量；另外，升汞具有劇毒，且目前還不能證明其在內(nèi)生真菌的生長過程中有什么作用，所以，綜合考慮實驗中采用次氯酸鈉作為表面消毒的消毒劑。

2.2龍葵草表面消毒時間的選擇

龍葵草表面消毒所用時間的選擇見表2。表面消毒的效果與消毒劑處理時間的長短有密切的關(guān)系，消毒劑處理時間越長，則消毒效果越好；但隨著消毒時間增加到一定程度時，表面消毒的效果不再增加，此時再增加消毒劑處理時間，將會增加消毒劑侵染龍葵草組織概率，導(dǎo)致消毒劑影響龍葵草內(nèi)生真菌的分離，所以，當使用次氯酸鈉作為表面消毒劑時，處理時間以5 min為宜。

表2龍葵草表面消毒所用時間的選擇

處理時間/min123456檢出的菌落數(shù)/株27198100

2.3龍葵草內(nèi)生真菌的篩選結(jié)果

經(jīng)表面消毒的龍葵草組織塊或其消化液在培養(yǎng)3～5 d后，逐漸可見有菌絲長出，其結(jié)果見表3。

表3龍葵草內(nèi)生真菌的篩選結(jié)果

植物組織原液10倍液100倍液殘渣根85210莖4316葉5418

由表3可看出，由龍葵根篩選出的內(nèi)生真菌數(shù)量明顯多于莖和葉中篩選出的內(nèi)生真菌的數(shù)量；殘渣中存在的內(nèi)生真菌多于消化液中篩選出的內(nèi)生真菌；消化液稀釋倍數(shù)越大，則篩選出的內(nèi)生真菌的數(shù)量越少。

2.4龍葵草內(nèi)生真菌發(fā)酵液中皂苷類活性成分的檢測

經(jīng)物理發(fā)泡法及化學方法鑒定篩選出的內(nèi)生真菌的發(fā)酵液，產(chǎn)生明顯現(xiàn)象的菌株共有8株，其培養(yǎng)特性見表4和圖1。

表48株檢出產(chǎn)皂苷類活性物質(zhì)內(nèi)生真菌培養(yǎng)特性

菌株號培養(yǎng)特性1菌落為墨綠色,后轉(zhuǎn)為黑色,粉狀,基質(zhì)為黑色。2菌絲初為白色,后轉(zhuǎn)為紅色,最后變?yōu)辄S色,基質(zhì)顏色隨菌絲顏色變化而逐漸變?yōu)辄S色。3菌落為黃色小的顆粒,有極少、極細的氣狀菌絲,基質(zhì)為黃色。4菌絲為白色,逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楹稚?基質(zhì)為褐色。5白色菌絲,轉(zhuǎn)為褐色,絮狀,生長迅速,基質(zhì)為褐色。6菌絲為紅色絮狀,基質(zhì)為紫紅色。7菌絲生長塊,4d長滿培養(yǎng)皿,基質(zhì)顏色不變。8白色絮狀菌絲,有褐色菌核,質(zhì)硬,基質(zhì)顏色不變。

2.5產(chǎn)皂苷類內(nèi)生菌發(fā)酵液中皂苷類活性物質(zhì)的含量測定

將正丁醇萃取液濃縮，揮干正丁醇溶劑，按1.4.5.4操作步驟操作，于545 nm處測量吸光度，利用回歸方程計算皂苷類活性物質(zhì)的濃度，其結(jié)果見表5。

表5產(chǎn)皂苷類內(nèi)生真菌菌絲及發(fā)酵液中皂苷類物質(zhì)的含量μg/mL

菌株號菌絲發(fā)酵液10.042.7420.081.9730.105.4240.053.4850.174.8260.072.1870.186.1780.316.37

由表5可看出，龍葵草產(chǎn)皂苷類活性物質(zhì)的內(nèi)生真菌發(fā)酵液中皂苷類物質(zhì)的含量均高于菌絲中皂苷類物質(zhì)，說明皂苷類物質(zhì)是初篩菌株的胞外產(chǎn)物。

2.6TLC檢測結(jié)果

龍葵草及產(chǎn)皂苷類活性物質(zhì)的內(nèi)生真菌中皂苷類物質(zhì)的TLC檢測結(jié)果見圖2。

由圖2可看出，龍葵草中存在薯蕷皂苷類化合物，且篩選出的內(nèi)生真菌的發(fā)酵液中也存在薯蕷皂苷類化合物。

3結(jié)論

通過研究發(fā)現(xiàn)，采用3.5%的次氯酸鈉(有效氯)處理龍葵草表面5 min，表面消毒效果良好，且不會影響到內(nèi)生真菌的篩選過程。此次龍葵草內(nèi)生真菌的篩選中共篩選出內(nèi)生真菌24株，其中產(chǎn)皂苷類活性物質(zhì)的菌株數(shù)共有8株，通過物理化學方法對初篩菌株進行驗證，發(fā)酵實驗驗證皂苷類物質(zhì)主要存在于內(nèi)生真菌的發(fā)酵液中，菌絲中的含量較少。

參 考 文 獻

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(責任編輯吳鴻霞)

Preliminary Isolation and Screen of Endophytic Fungi Producing Saponins from Solanum Nigrum L

LiuLanglang,ZhangYun,LiDuanzhuo,WuWei*

(School of Medicine,Hubei Polytechnic University,Huangshi Hubei 435003)

Abstract：Solanum nigrum L was used as materials to screen endophytic fungi which can produce saponins.24 endophytic fungi were isolated from Solanum nigrum L by tissue surface-sterilized.The results indicated that 8 endophytic fungi can produce saponins, and they were mainly existing in the fermentation broth.

Key words：Solanum nigrum L;saponins;endophytic fungi;isolate

中圖分類號：Q932

文獻標識碼：A

文章編號：2095-4565(2016)02-0056-05

doi:10.3969/j.issn.2095-4565.2016.02.013

*通訊作者：吳偉，講師，博士，研究方向：生物技術(shù)制藥。

作者簡介：劉浪浪，本科。

基金項目：礦區(qū)環(huán)境污染控制與修復(fù)湖北省重點實驗室開放基金項目(項目編號：2012105)；湖北理工學院大學生科技創(chuàng)新項目(項目編號：13cx08)；湖北省教育廳指導(dǎo)性項目(項目編號：B2014023)。

收稿日期：2015-09-24