蒙藥梅花草乙醇提取物對肝癌細胞增殖作用的實驗研究△

紅 艷 達拉胡 辛 穎

(內(nèi)蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

蒙藥梅花草乙醇提取物對肝癌細胞增殖作用的實驗研究△

紅 艷 達拉胡 辛 穎*

(內(nèi)蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

目的：研究蒙藥梅花草的乙醇提取物對人肝癌細胞(HepG2細胞)的體外增殖抑制作用。方法:采用MTT法檢測梅花草乙醇提取物的不同劑量組對HepG2細胞增殖的抑制作用；ELISA檢測HepG2細胞內(nèi)Bax和Bcl-2蛋白的表達變化情況。結(jié)果:梅花草乙醇提取物處理HepG2細胞24h后，可以明顯抑制HepG2細胞的增殖。與對照組相比，梅花草的乙醇提取物可以明顯升高HepG2細胞的Bax蛋白水平，降低Bcl-2蛋白水平(P<0.05和P<0.05)。結(jié)論:蒙藥梅花草的乙醇提取物體外對HepG2細胞的增殖有抑制作用，其作用機制與誘導腫瘤細胞的凋亡有關(guān)。

梅花草乙醇提取物；HepG2細胞；細胞凋亡；Bax；Bcl-2

梅花草(Parnassis palustris L.)為虎耳草科梅花草屬植物突隔梅花草的全草或根，又稱白側(cè)草、馬蹄草等，是蒙古族歷代和民間常用的特色蒙藥，蒙古名為那木戛納、烏力地格和那木日因查干-其其格等。在現(xiàn)代蒙醫(yī)臨床應用是用于治療腫瘤及其相關(guān)疾病的常用蒙藥材之一。梅花草氣味甘、苦，無明顯毒性，具有清熱解毒、破痞、消腫排膿和抑希日等功效，臨床主要用于治療腑器熱性希日病和熱性痞癥，即治療肝、膽腫瘤及部分腸道腫瘤(如結(jié)腸腫瘤)等，也可以治療黃疸型肝炎、咽喉炎、腮腺炎、脈管炎和肺結(jié)核等[1，2]。

“破痞”屬于一種蒙藥功效，相當于現(xiàn)代醫(yī)學中的抗腫瘤作用。現(xiàn)代蒙藥藥理學[3]上認為具破痞功效的蒙藥具有抗腫瘤活性。蒙醫(yī)理論認為“痞癥”可發(fā)生于人體的各個器官，多屬于繼發(fā)于各種疾病的郁結(jié)性痼疾，其發(fā)病原因主要是由于維持人體生命的“三根”(赫依、希日、巴達干)因某種原因失去平衡，使“七素”(食物精華、血、肉、脂、骨、骨髓、精液)的轉(zhuǎn)化過程中因積聚凝結(jié)而成渾濁、惡血激增、黃水淤積，在赫依的促動作用下，在人體的某一部位形成痞塊。醫(yī)治痞病，不但要破痞瘤本身同時要判明其發(fā)病原因，對癥施治。長期以來，蒙醫(yī)藥學對于“痞癥”的治療方面已經(jīng)積累了非常豐富的治療方法和傳統(tǒng)用藥經(jīng)驗，臨床療效顯著，并且副作用小，資源豐富。但存在的挑戰(zhàn)在于如何利用現(xiàn)代醫(yī)藥學理念去解釋蒙醫(yī)藥“破痞”功效的根本原因和機制。

據(jù)文獻查閱，目前未見國內(nèi)外專家和學者關(guān)于蒙藥梅花草的“破痞”功效的活性化學成分和作用機制等方面的研究報道。從天然藥物的發(fā)展趨勢來看，應該將化學成分和藥效學研究結(jié)合起來進行研究，應該以天然藥物的有效部位為切入點，對其有效部位進行提取分離，了解其主要活性成分，再進一步尋找其作用機制。本研究沿著天然藥物研究的這一思路，首先擬用活性追蹤法對蒙藥梅花草乙醇提取物的抗腫瘤作用進行研究，旨在通過體外實驗初步評價梅花草的乙醇提取物對人肝癌細胞(HepG2細胞)的增殖是否具有抑制作用，進一步研究梅花草的抗腫瘤效果。

1 實驗材料

1.1 細胞：人肝癌細胞系(HepG2細胞)購自上海博谷生物科技有限公司。

1.2 儀器：TS100倒置相差顯微鏡(日本尼康)；SW-CJ-2F雙人雙面凈化工作臺(蘇州智凈有限公司)；DNM-9602酶標(北京普朗責任有限公司)；3110系列水套CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific)；GYJ1/2-40L-S超純水機(重慶華創(chuàng)責任有限公司)；YXQ-LS-100A立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊有限公司)；DHG-9203A鼓風干燥箱(上海精宏有限公司)；98-1B型電子調(diào)溫電熱套(天津市秦斯特儀器有限公司)；KQ-100型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph集團)；SHZ-DIII循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城儀器有限公司)；96孔培養(yǎng)板及培養(yǎng)瓶(美國Corning公司)。

1.3 試劑：DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；MTT(北京索萊寶科技有限公司)；胰酶(北京索萊寶科技有限公司)；人B細胞淋巴瘤因子-2(Bcl-2)ELISA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)；人Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)ELISA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)；生理鹽水、乙醇、二甲基亞砜(DMSO)等試劑均購自天津科密歐公司。

2 實驗方法

2.1 藥物制備：取一定量的梅花草(500g)，用95%的乙醇浸泡后放于大圓底燒瓶中加熱浸煮，每次煮3h，提取3次，每次所得的煮液合并為提取液，減壓濃縮干燥后得浸膏，備用。經(jīng)計算得提取率為33.26%。用DMSO作為梅花草乙醇提取物的溶劑。

2.2 MTT實驗：HepG2細胞消化，調(diào)整細胞濃度為1×105/mL，接種于96孔板中，每孔100μL，培養(yǎng)24h，加入不同濃度的梅花草乙醇提取物，使終濃度為3.125、4.167、6.25、12.5mg/mL，置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h，棄培養(yǎng)液，每孔加MTT溶液(5mg/mL)50μL，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)MTT，每孔加100μLDMSO，振蕩2～3min，使結(jié)晶物充分融解。選擇490nm波長，在酶標儀上測定各孔OD值，記錄結(jié)果，計算抑制率。抑制率=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%，實驗重復3次，取平均值。

2.3 ELISA檢測Bax、Bcl-2蛋白表達：HepG2細胞加入梅花草的乙醇提取物處理24h后，用PBS洗滌2次，用ELISA方法測定細胞上清液中Bax和Bcl-2蛋白的含量。使用標準曲線法，按著試劑盒的說明方法進行操作，使用酶標儀檢測結(jié)果。

2.4 統(tǒng)計學方法：應用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，多組間均數(shù)差異性比較采用單因素方差分析，P<0.05或P<0.01為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 梅花草乙醇提取物對HepG2細胞的生長抑制作用：梅花草乙醇提取物在濃度為4.167、6.25、12.5mg/mL時對HepG2細胞均表現(xiàn)出抑制其增殖的作用，且隨著提取物濃度的增高而抑制作用逐漸增強。結(jié)果見表1。

表1 梅花草乙醇提取物對HepG2細胞增殖的作用

注：與對照組相比，＊P<0.05，＊＊P<0.01

3.2 梅花草乙醇提取物對HepG2細胞Bax、Bcl-2蛋白表達的影響：與對照組相比，梅花草乙醇提取物濃度為12.5mg/mL 時Bax蛋白表達顯著升高，Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.05和P<0.05)。梅花草乙醇提取物的其他濃度與對照組比較差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果見表2。

表2 梅花草乙醇提取物對HepG2細胞Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

注：與對照組相比，＊P<0.05

4 討論

中蒙藥既可以作為抗腫瘤的手術(shù)治療、放射性治療和化學藥物治療的輔助用藥，又可以獨立發(fā)揮直接的抗腫瘤作用。它防治腫瘤的作用機理一般是比較復雜的，常常涉及到多個靶點、多條途徑和多種環(huán)節(jié)的共同作用，包括抑制腫瘤自身血管的生長、調(diào)節(jié)機體自體免疫的功能、誘導促進腫瘤細胞的凋亡和分化、調(diào)節(jié)腫瘤細胞的信號傳導通路、逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的多重耐藥性和抑制端粒酶活性等[4]。此外，與化學合成藥物相比，中、蒙藥還具備很多實用性的特點利于其應用，比如其取材方便、價格低廉、毒副作用小等。所以中、蒙藥及其有效成分的抗腫瘤作用及其機理的研究已成為當今醫(yī)藥學領域研究的重點。

本實驗研究的結(jié)果顯示，梅花草乙醇提取物的不同劑量組對HepG2細胞可以表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，且呈現(xiàn)劑量反應關(guān)系。細胞凋亡是生命的基本現(xiàn)象，可以維持機體內(nèi)細胞數(shù)量的動態(tài)平衡，維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，具有十分重要的生物學意義。哺乳動物細胞凋亡受基因的嚴格調(diào)控，研究表明Bax和Bcl-2的表達高低與細胞凋亡有密切關(guān)系，其中Bax是細胞凋亡的促進基因，Bcl-2是細胞凋亡的抑制基因，Bcl-2與Bax比值的升高會導致肝癌細胞凋亡發(fā)生的機率增加[5]。實驗結(jié)果表明，梅花草乙醇提取物促進HepG2細胞中Bax蛋白的表達，抑制Bcl-2蛋白的表達，即梅花草乙醇提取物可以誘導HepG2細胞凋亡。

綜上所述，梅花草乙醇提取物在體外對HepG2細胞有抑制作用，且其作用機制與誘導腫瘤細胞的凋亡有關(guān)。

[1]羅布桑. 蒙藥學[M]. 北京：民族出版社，1989，459-460.

[2] 奧烏力吉，布和巴特爾. 傳統(tǒng)蒙藥與方劑[M]. 呼和浩特：內(nèi)蒙古科學技術(shù)出版社，2013，08.

[3] 王秀蘭，白玉霞，王歡，等. 蒙藥藥理學[M]. 呼和浩特：內(nèi)蒙古人民出版社，2006，82-87.

[4] 尹龍，徐亮，胡格，等. 抗腫瘤中藥及其有效成分的作用研究現(xiàn)狀[J]. 動物醫(yī)學進展，2006，27(1)：39-44.

[5] 龍冬梅. 細胞凋亡及凋亡相關(guān)基因在大鼠肝癌促癌過程中的作用研究[D]. 第三軍醫(yī)大學(重慶)，2001.

2016年6月29日收稿

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學基金資助(2016MS0817)；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學校科學研究項目(NJZZ16184)

紅艷，女，講師，從事蒙藥栽培與鑒定研究。

*通訊作者：辛穎，女，副教授，從事民族藥物研究，E-mail：xinying20081115@163.com

R291.2

A

1006-6810(2016)10-0063-03