兔皮膠原蛋白的提取及其結(jié)構(gòu)鑒定

王雪蒙，于瑋，馬良,2，李洪軍,2，賀稚非,2，張宇昊,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶,400715) 2(西南大學 國家食品科學與工程實驗教學中心，重慶,400715)

?

兔皮膠原蛋白的提取及其結(jié)構(gòu)鑒定

王雪蒙，于瑋1，馬良1,2，李洪軍1,2，賀稚非1,2，張宇昊1,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶,400715) 2(西南大學 國家食品科學與工程實驗教學中心，重慶,400715)

摘要為增加兔產(chǎn)業(yè)產(chǎn)品附加值，開發(fā)新型原料膠原蛋白產(chǎn)品，以兔皮為原料，采用酶法提取膠原蛋白。以膠原蛋白提取率為指標，研究胃蛋白酶用量、酶解液pH和酶解時間3個因素對膠原蛋白提取工藝的影響，確定膠原蛋白較優(yōu)提取條件。單因素試驗和正交試驗結(jié)果表明，較優(yōu)條件為酶解液pH值為1.9，酶解時間為4 h，胃蛋白酶用量為1%(w/w)，在此條件下，膠原蛋白的提取率為(94.17±0.57)%，純度為(86.12±0.15)%。聚丙烯酰氨凝膠電泳結(jié)果表明，兔皮膠原蛋白主要由α，β和γ3種亞基組分組成，為Ⅰ型膠原蛋白；差示量熱掃描結(jié)果表明該膠原蛋白的熱變性溫度為44.59 ℃，熱焓值為1.386 8 J/g，具有較高熱穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞兔皮；膠原蛋白；酶法；工藝優(yōu)化；結(jié)構(gòu)鑒定

膠原蛋白是一種天然高分子化合物，廣泛存在于動物的皮、骨、軟骨、肌腱等結(jié)締組織中，支持和保護身體各器官，是哺乳動物體內(nèi)含量最多、分布最廣的一種蛋白質(zhì)，約占蛋白質(zhì)總量的30%[1]。膠原蛋白具有一定的乳化性，吸水保濕性和生物相容性，已廣泛應用于食品[2]、化妝品[3]、醫(yī)藥[4]等多個領域。

本研究擬從兔皮中提取膠原蛋白，優(yōu)化膠原蛋白提取工藝，并對膠原蛋白結(jié)構(gòu)和熱力學特性進行了研究。

1材料和方法

1.1原料與主要試劑

新鮮伊拉兔皮，購于重慶市北碚區(qū)西南大學屠宰場。

冰醋酸、NaOH、NaCl、H2SO4、Na2S、Ca(OH)2、氯胺T、對二甲氨基苯甲醛、高氯酸、正丙醇、異丙醇、甲醇和KI均為分析純，購于成都市科龍化工試劑廠；羥脯氨酸為分析純，購于上?？笊锛夹g(shù)有限公司；Tris、考馬斯亮藍R-250為優(yōu)級純，購于BIO BASIC公司；質(zhì)量分數(shù)為30%丙烯酰胺為優(yōu)級純，購于北京索萊寶科技有限公司；甘氨酸(Glycine)、溴酚藍(BPB)為分析純，購于生工生物工程(上海)有限公司；胃蛋白酶(1∶10 000)為分析純，購于北京Solarbio公司)；標準蛋白為(分子質(zhì)量10～200 kDa)，購于加拿大Fermentas公司。

1.2儀器與設備

JA3003B電子天平，上海精天電子儀器有限公司；FYL-C020E料理機，九陽股份有限公司；PHS-25型數(shù)顯酸度計，杭州雷磁分析儀器廠；99-1大功率磁力攪拌器，金壇市科析儀器有限公司；5810型臺式高速離心機，德國Eppendorf公司；QL 901 Vortex旋渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；8002型溫控水浴鍋，北京永光明醫(yī)療儀器廠；752紫外可見分光光度計，上海箐華科技有限公司；FD-1-50真空冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；日立L-8800型全自動氨基酸分析儀，日本Hitachi公司；Pyris4000差示量熱掃描儀，美國PerkinElmer公司；Spectrun100紅外光譜儀，美國PerkinElmer公司；Power PacTM基礎電泳儀，美國Bio-Rad公司；G:BOX EF型凝膠成像系統(tǒng)，英國Syngene公司。

1.3實驗方法

1.3.1兔皮基本成分的測定

水分含量：直接干燥法[5]；灰分含量：高溫灼燒法[6]；脂肪含量：索氏抽提法[7]；蛋白質(zhì)含量：凱氏定氮法[8]。

1.3.2兔皮膠原蛋白提取工藝流程

本試驗采用胃蛋白酶法從兔皮中提取膠原蛋白，具體工藝流程如下：

兔皮→前處理(清洗、脫毛、剪碎)→除雜蛋白→清洗→酸浸泡→打漿→酶解→鹽析→純化→凍干→膠原蛋白

(1)前處理：將新鮮兔皮清洗，浸入質(zhì)量分數(shù)10%的NaCl溶液12 h，除去皮下脂肪后，將脫毛劑(向5%的Na2S添加Ca(OH)2至糊狀)于室溫涂在皮上，4 h后脫毛[9]。充分水洗并切成約3 mm×3 mm的小塊，再浸入5倍體積質(zhì)量濃度為10 g/L的NaCl溶液浸泡以去除雜蛋白(浸泡攪拌6 h，每2 h換1次液)，用蒸餾水洗滌3～4次，真空包裝凍藏備用。

(2)酸浸泡、打漿：取一定量皮塊，按1∶15(g∶mL)比例加入pH 2.2的醋酸溶液，在4 ℃下浸泡8～10 h，待皮塊膨脹均勻后打成漿狀。

(3)酶解：向打碎的兔皮中繼續(xù)添加一定量的醋酸溶液，使溶液總體積為兔皮質(zhì)量的30倍，攪拌成均勻的漿液，控制漿液pH。向兔皮漿液中加入一定量的胃蛋白酶，于4 ℃下酶解。

(4)中和、鹽析：將酶解液過濾，向濾液中緩慢滴加濃NaOH(約10 mol/L)，調(diào)節(jié)pH值至7～8，再邊攪拌邊緩慢加入一定量NaCl(使NaCl最終濃度為4～5 mol/L)，鹽析12 h。

(5)純化、凍干：將鹽析物離心，取沉淀物，再次水洗離心3次(5 000 r/min,10 min)，沉淀即為膠原蛋白粗提物。將膠原蛋白粗提物用pH 2.7的醋酸溶解，離心(5 000 r/min,10 min)除去雜質(zhì)后灌入透析袋(分子截留質(zhì)量Mw8 000～14 000 )中，以pH 3.0的醋酸溶液為透析液透析4 d，再以純水為透析液透析2 d，最后凍干得到純化的膠原蛋白樣品。

1.3.3兔皮膠原蛋白的提取率、純度的測定和計算

(1)膠原蛋白提取率[公式(1)]：

膠原蛋白提取率/%=

(1)

式中:膠原蛋白含量=羥脯氨酸含量×7.1(7.1為陸生動物系數(shù))[10]。

羥脯氨酸含量測定參照GB/T 9695.23—2008/ ISO3496:1994[11]方法進行，以羥脯氨酸為標準液，繪制標準曲線(R2=0.999 8)，如圖1所示，再測定各樣品的吸光度，計算出羥脯氨酸含量。

圖1　羥脯氨酸標準曲線Fig.1　The standard curve of hydroxyproline

(2)膠原蛋白樣品純度：按照上述(1)的方法先測定樣品中羥脯氨酸含量，再轉(zhuǎn)換為膠原蛋白含量，按公式(2)計算膠原蛋白的純度。

(2)

1.3.4兔皮膠原蛋白提取工藝優(yōu)化

選取工藝中酶解液pH、酶解時間和胃蛋白酶用量3個因素進行參數(shù)優(yōu)化。

1.3.4.1兔皮膠原蛋白提取工藝優(yōu)化的單因素試驗

兔皮膠原蛋白提取工藝優(yōu)化的單因素試驗基本條件為酶解液pH 2.2、酶解時間4 h、酶用量為1%(w/w，以兔皮質(zhì)量計)。改變其中一個條件，固定其他條件以分析pH、酶解時間、酶用量對膠原蛋白提取率的影響。各因素水平分別為溶液pH值：1.7、1.8、2.0、2.2、2.4；酶解時間：2、4、6、9、12 h；酶用量：0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%。

1.3.4.2兔皮膠原蛋白提取工藝優(yōu)化的正交試驗及膠原蛋白純度的測定

通過單因素試驗確定酶解液pH、酶解時間和酶用量3個因素的水平范圍(見表1)，以膠原蛋白提取率為評價指標進行正交試驗，對最優(yōu)工藝條件下提取的膠原蛋白粗提物先后進行透析、凍干處理得到純化的膠原蛋白樣品，并計算膠原蛋白的純度。

表1　正交試驗的因素水平設計

1.3.5兔皮膠原蛋白結(jié)構(gòu)鑒定

通過聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)和差示量熱掃描(DSC)分析手段對純化后的膠原蛋白樣品進行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.3.5.1膠原蛋白的亞基組成

采用SDS-PAGE垂直電泳分析膠原蛋白的亞基組成，相關(guān)溶液配制及具體操作參照陳麗清[12]的方法進行。以0.25 mol/L的Tris-HCl為溶劑，配制1.0 mg/mL的膠原蛋白溶液，按體積比4∶1添加5×樣品緩沖液，沸水浴5 min，冷卻后上樣，上樣量為15 μL(Marker上樣量為10 μL)，分離膠為質(zhì)量分數(shù)6%，濃縮膠質(zhì)量分數(shù)為5%。電流初始設置為15 mA，待溴酚藍跑到分離膠中后，電流調(diào)至25 mA，電泳時間約1 h。考馬斯亮藍染色2 h后用脫色液脫色，直至背景藍色被脫凈，然后用凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳圖譜并分析樣品的亞基組成。

1.3.5.2膠原蛋白的熱穩(wěn)定分析

用0.05 mol/L醋酸溶液溶解樣品，配制0.5 mg/mL的膠原蛋白溶液，吸取20 μL于液體DSC鋁盒盤，封存，放入DSC儀，在氮氣氣氛下，以1 ℃/min的速率從20 ℃升溫至50 ℃，記錄吸熱曲線[13]。

1.3.6數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用Microsoft excel 2010和SPSS17.0軟件分析，每次試驗設置3個平行實驗，數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差表示。

2試驗結(jié)果分析

2.1兔皮基本成分測定結(jié)果

由表2可知，兔皮中蛋白含量為14.56%，其中膠原蛋白約占粗蛋白的75%。可見兔皮是一種很好的膠原蛋白提取來源。

表2　兔皮中基本成分

2.2單因素試驗

2.2.1酶解液pH對兔皮膠原蛋白提取率的影響

酶解液pH對兔皮膠原蛋白提取率的影響如圖2所示。隨酶解液pH值的升高，膠原蛋白提取率先升高后下降，在pH 1.8時提取率達最大值(78.93±0.81)%。說明對于兔皮膠原的提取，胃蛋白酶較適作用pH為1.8，高于或低于此pH都不利于胃蛋白酶促進膠原蛋白的釋放。此外，當酶解液pH低于1.8時，酸對膠原內(nèi)部三螺旋結(jié)構(gòu)的降解作用可能增強，導致膠原降解，膠原提取率降低。

圖2　酶解液pH對膠原蛋白提取率的影響Fig.2　Effect of pH on yield of collagen

2.2.2酶解時間對兔皮膠原蛋白提取率的影響

圖3　酶解時間對膠原蛋白提取率的影響Fig.3　Effect of enzymolysis time on yield of collagen

酶解時間對兔皮膠原蛋白提取率的影響如圖3所示。隨著酶解時間的增加，膠原蛋白提取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在酶解時間為4 h時兔皮膠原蛋白提取率最高達(72.52±0.25)%。與大鯢皮[10]、豬皮[14]膠原蛋白酶解時間相比，兔皮膠原酶解時間大大縮短，這可能與兔皮結(jié)構(gòu)有關(guān)，兔皮膠原提取效率遠遠高于其他種類膠原蛋白，酶解時間4 h時，在酸和酶的作用下斷裂膠原蛋白非螺旋區(qū)端肽，膠原蛋白得到充分釋放。綜上所述，確定兔皮膠原較適酶解時間為4 h。2.2.3酶用量對兔皮膠原蛋白提取率的影響

酶用量對兔皮膠原蛋白提取率的影響如圖4所示。酶用量為0.1%時，酶量過低，胃蛋白酶不能充分降解膠原的非螺旋區(qū)，使膠原蛋白充分釋放；胃蛋白酶由0.1%增加到1%，膠原蛋白提取率持續(xù)升高，用量達到1%時得率達到(72.52±0.25)%；當酶用量從1%增加到2%，膠原蛋白提取率逐漸下降，這可能是由于酶用量過大，對膠原非螺旋結(jié)晶區(qū)的破壞更快，從而導致酸對膠原結(jié)構(gòu)的過度降解。綜上所述，胃蛋白酶的較適添加量為兔皮質(zhì)量的1%。

圖4　酶用量對膠原蛋白提取率的影響Fig.4　Effect of quantity of enzyme on yield of collagen

2.2.4兔皮膠原蛋白提取工藝參數(shù)的優(yōu)化

在單因素試驗結(jié)果的基礎上，進行溶液pH、酶解時間和酶用量的3因素3水平正交試驗，結(jié)果見表3。

表3　正交試驗結(jié)果

由表3知，各因素對膠原蛋白提取率的影響次序為C>B>A。酶解液pH對膠原蛋白提取率的影響最為顯著，酶用量次之，酶解時間最小。最優(yōu)提取方案為酶解液pH 1.9、酶用量1%和酶解時間4 h，即A2B2C2，補加驗證試驗，得此條件下，膠原蛋白的提取率最高，達(94.17±0.57)%。因此確定膠原蛋白提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為：pH 1.9、酶用量1%、酶解時間4 h。

以上最優(yōu)工藝條件提取出的膠原蛋白粗提物經(jīng)過透析、凍干處理后得到純化的白色海綿狀膠原蛋白樣品。經(jīng)測定樣品中膠原蛋白純度為(86.12±0.15)%。

2.3兔皮膠原蛋白的結(jié)構(gòu)鑒定

2.3.1膠原蛋白的亞基組成

采用SDS-PAGE電泳檢測優(yōu)化工藝下提取的膠原蛋白的亞基組成，結(jié)果如圖5所示。

1-標準蛋白； 2-2 mg/mL膠原蛋白溶液； 3-1 mg/mL膠原蛋白溶液圖5　兔皮膠原蛋白的SDS電泳圖譜Fig.5　SDS-PAGE patterns of rabbit-skin collagen

從兔皮中提取的膠原蛋白具有明顯的α、β和γ組分[15-16]。在相對分子質(zhì)量120 kDa附近的2個條帶分別為α1和α2鏈；200 kDa附近的條帶為β鏈(α鏈的二聚體)；200 kDa以上的為γ鏈(α鏈的三聚體)。在α2鏈以下未發(fā)現(xiàn)其他電泳條帶，說明在此提取過程中，膠原蛋白的基本結(jié)構(gòu)得以保存，沒有生成小分子水解膠原及多肽。SDS-PAGE圖譜和膠原蛋白亞基組成表明從兔皮中提取的膠原蛋白為Ⅰ型膠原蛋白。

2.3.2膠原蛋白的熱穩(wěn)定分析

采用差示量熱掃描(DSC)檢測優(yōu)化工藝下提取的膠原蛋白的熱變性溫度(Tm)及熱焓值(H)，結(jié)果如圖6所示。

圖6　兔皮膠原蛋白的DSC圖譜Fig.6　DSC patterns of rabbit-skin collagen

從圖6看出，兔皮膠原蛋白熱變性溫度Tm為44.59 ℃，熱焓值(H)為1.386 8 J/g。兔皮膠原蛋白的熱變性溫度高于豬皮膠原蛋白(37 ℃)[17]和魚皮膠原蛋白(16.1～30.4 ℃)[18]。研究表明[19]，熱穩(wěn)定性是由脯氨酸和羥脯氨酸構(gòu)成的吡咯環(huán)以及羥脯氨酸羥基之間的部分氫鍵決定的，且熱變性溫度與膠原蛋白亞氨基酸含量、身體溫度和生活環(huán)境溫度有關(guān)。綜上所述，本試驗優(yōu)化條件下提取的兔皮膠原蛋白的熱穩(wěn)定較高，維系膠原蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的分子間作用力較大，天然結(jié)構(gòu)保存較為完整。

3結(jié)論

(1)胃蛋白酶提取兔皮膠原蛋白最優(yōu)條件為：胃蛋白酶用量1%、酶解液pH為1.9、酶解時間為4 h，在此條件下，膠原蛋白提取率可達(94.17±0.57)%，冷凍干燥后的膠原蛋白呈白色海綿狀，其純度為(86.12±0.15)%。

(2)SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，膠原蛋白主要由α，β和γ3種亞基組分組成，為Ⅰ型膠原蛋白；差示量熱掃描(DSC)分析可知，膠原蛋白Tm為44.59 ℃、ΔH為1.386 8 J/g，具有較高的熱穩(wěn)定性。

參考文獻

[1]蔣挺大.膠原與膠原蛋白[M].北京:化學工業(yè)出版社,2006:3-45.

[2]李興武,章黎黎.膠原蛋白的改性研究及在食品工業(yè)中的應用[J].肉類研究,2009(11):80-84.

[3]王學川,任龍芳,強濤濤,等.膠原蛋白的研究進展及其在化妝品中的應用[J].日用化學工業(yè),2005，35(6):388-392.

[4]LEE C H,SINGLA A,LEE Y.Biomedical applications of collagen[J].International Journal of Pharmaceutics,2001,22(1):1-22.

[5]GB5009.3—2010.食品中水分的測定[S].

[6]GB/T 9695.18—2008/ISO 936:1998.肉與肉制品總灰分的測定[S].

[7]GB/T5009.6—2003.食品中脂肪的測定[S].

[8]GB 5009.5—2010.食品中蛋白質(zhì)的測定[S].

[9]馮文破,祁元明,湯克勇.兔皮Ⅰ型膠原的提取、改性與性能研究[J].北京理工大學學報,2010,30(10):1 231-1 234,1 239.

[10]李莉,顧賽麒,王錫昌,等.響應面法優(yōu)化酶法提取大鯢皮膠原蛋白工藝[J].中國水產(chǎn)科學,2013,20(7):876-883.

[11]GB/T 9695.23—2008/ ISO3496:1994.肉與肉制品羥脯氨酸含量測定[S].

[12]陳麗清,超高壓技術(shù)制備高品質(zhì)明膠及其機理研究[D].重慶:西南大學,2013.

[13]MATMAROH K,BENJAKUL S,PRODPRAN T,et al.Characteristics of acid soluble collagen and pepsin soluble collagen from scale of spotted golden goatfish (Parupeneus heptacanthus)[J].Food Chemistry,2011,129(3):1 179-1 186.

[14]于瑋,王雪蒙,馬良,等.豬皮膠原蛋白提取過程中酶解條件優(yōu)化及其結(jié)構(gòu)鑒定[J].西南大學學報：自然科學版,2015,37(4):106-113.

[15]WANG Lin,LIANG Qiu-fang,CHEN Ting-ting,et al.Characterization of collagen from the skin of Amur sturgeon (Acipencserschrenckii)[J].Food Hydrocolloids,2014,38:104-109.

[16]NALINANON S,BENJAKUL S,KISHIMURA H,et al.Type I collagen from the skin of ornate threadfin bream (Nemipterushexodon):Characteristics and effect of pepsin hydrolysis[J].Food Chemistry,2011,125(2):500-507.

[17]NAGAI T,SUZUKI N,NAGASHIMA T.Collagen from common minke whale (Balaenopteraacutorostrata) unesu[J].Food Chemistry,2008,111(2):296-301.

[18]JONGJAREONRAK A,BENJAKUL S,VISESSANGUAN W,et al.Isolation and characterisation of acid and pepsin-solubilised collagens from the skin of brownstripe red snapper (Lutjanusvitta)[J].Food Chemistry,2005,93(3):475-484.

[19]BENJAKUL S,THIANSILAKUL Y,VISESSANGUAN W,et al.Extraction and characterisation of pepsin solubilised collagens from the skin of bigeye snapper (PriacanthustayenusandPriacanthusmacracanthus)[J].Journal of the Science Food and Agriculture,2010,90(1):132-138.

Optimization of extraction process for rabbit-skin collagen and identification of its structure

WANG Xue-meng1, YU Wei1, MA Liang1,2,LI Hong-jun1,2, HE Zhi-fei1,2, ZHANG Yu-hao1,2*

1(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China) 2(National Food Science and Engineering Experimental Teaching Center, Southwest University, Chongqing 400715, China)

ABSTRACTIn order to increase rabbit industry value-added products and develop collagen products of new materials, collagen in rabbit skin was extracted with pepsin. With the collagen extraction rate as the evaluation indicator, the influence of enzyme solution pH、enzymolysis time and the dosage of pepsin to the extraction process of collagen were studied to determine the optimal extraction conditions. The single factor experiment and the orthogonal test results showed that the best processing combination was the enzyme solution pH 1.9, enzymolysis time 4h and pepsin dosage 1%. Under this condition, the extraction rate of collagen was 94.17%±0.57%, with the collagen purity of 86.12%±0.15%. The result of polyacrylamide gel electrophoresis showed that the subunits structure of collagen extracted from rabbit-skin was mainly of α、β and γ, which is type 1 collagen. The result of Scanning Differential Calorimeter analysis showed that the thermal denaturation temperature and enthalpy value of collagen was 44.59 ℃ and 1.386 8 J/g, which proves that the collagen has a higher thermal stability.

Key wordsrabbit skin; collagen; enzymes; process optimization; structure identification

收稿日期：2015-09-06，改回日期：2015-11-30

基金項目：國家自然科學基金項目(No.31301425)；中央高?；究蒲袠I(yè)務費重大項目(No.XDJK2015A015)；中央高?；究蒲袠I(yè)務費團隊項目(No.2362014xk11)中國博士后科學基金面上項目(No.2014M562267)；中國博士后科學基金特別資助項目(No.2015T80951)；第四批重慶市高等學校優(yōu)秀人才支持計劃

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201604038

第一作者：碩士研究生(張宇昊教授為通訊作者,E-mail:zhy1203@tom.com)。