豆醬中產(chǎn)細(xì)菌素屎腸球菌的篩選及特性分析

王曉蕊，鄒婷婷，郭志富，張春紅，陶冬冰 ，王寅剛，烏日娜,2*

1(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)，110866) 2(江南大學(xué) 食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122) 3(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)，110866)

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豆醬中產(chǎn)細(xì)菌素屎腸球菌的篩選及特性分析

王曉蕊1，鄒婷婷1，郭志富3，張春紅1，陶冬冰1，王寅剛3，烏日娜1,2*

1(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)，110866) 2(江南大學(xué) 食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122) 3(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)，110866)

摘要從農(nóng)家傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中分離出164株疑似乳酸菌，其中有84株球菌。試驗(yàn)篩選到1株產(chǎn)細(xì)菌素的屎腸球菌R1并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行研究。該細(xì)菌素對(duì)金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、大腸桿菌等具有較好的抑制作用，對(duì)酸和熱穩(wěn)定。經(jīng)鑒定該細(xì)菌素種類(lèi)為腸球菌素P。菌株R1在pH3.0模擬胃液中3 h存活率達(dá)86.35%，在模擬腸液中6 h存活率達(dá)87.72%，對(duì)人工消化液耐受性良好。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株R1對(duì)青霉素、氨芐西林、環(huán)丙沙星、氯霉素和慶大霉素敏感，對(duì)諾氟沙星和紅霉素不敏感，未檢測(cè)出毒力因子，具有潛在安全性。

關(guān)鍵詞屎腸球菌；細(xì)菌素；豆醬；特性

乳酸菌細(xì)菌素，是由乳酸菌通過(guò)核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的一類(lèi)具有抗菌活性的蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)[1]，可作為天然防腐劑，對(duì)病原菌和腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖具有抑制作用[2]。乳酸菌本身對(duì)其產(chǎn)生的細(xì)菌素具有免疫性[3]。細(xì)菌素具有安全、無(wú)毒，可被人體降解等諸多優(yōu)點(diǎn)，因此在開(kāi)發(fā)天然防腐劑領(lǐng)域引起廣泛關(guān)注[4]。

屎腸球菌(Enterococcusfaecium)是乳酸菌的一種，能夠產(chǎn)生細(xì)菌素的屎腸球菌廣泛存在于大豆發(fā)酵制品中[5]。該菌對(duì)于高溫、高鹽、酸堿和氧氣具有較好抗逆性，也具有較好的免疫性和腸道黏附能力[6-7]，在高溫和低pH值條件下的穩(wěn)定性對(duì)提高細(xì)菌素的產(chǎn)量有著積極的作用[8]。屎腸球菌產(chǎn)生的類(lèi)細(xì)菌素具有分子質(zhì)量小、熱穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景[9]。

傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中微生物種類(lèi)繁多，并含有異黃酮類(lèi)、多酚類(lèi)、大豆皂苷、類(lèi)黑精等多種對(duì)人體有益的生理活性物質(zhì)，具有很好的保健功能[10]。本研究以金黃色葡萄球菌為指示菌，從農(nóng)家傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中篩選出產(chǎn)細(xì)菌素的屎腸球菌，并對(duì)細(xì)菌素相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行分析，希望用天然細(xì)菌素代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗生素，為天然食品防腐劑和飼料添加劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1分離材料

遼寧省(沈陽(yáng)、康平、錦州、營(yíng)口、撫順和丹東)傳統(tǒng)農(nóng)家發(fā)酵豆醬。

1.1.2主要試劑及培養(yǎng)基

胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K，上海福芮生物科技有限公司；牛膽鹽，上海研生實(shí)業(yè)有限公司；藥敏紙片，杭州長(zhǎng)城機(jī)電市場(chǎng)；LB培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基。

1.1.3指示菌

金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusAS1.2465)、大腸桿菌O157:H7(EscherichiacoliO157:H7 882364)、單核細(xì)胞增生李斯特菌(ListeriamonocytogenesC53-3)、弗氏志賀氏菌(ShigellaflexneriCMCC51592)和鼠傷寒沙門(mén)氏菌(SalmonellatyphimuriumS50333)由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)保存；植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)由本實(shí)驗(yàn)室分離得到。

1.2儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠；生物潔凈工作臺(tái),蘇州市華宇凈化設(shè)備有限公司；DNP-9080型生化培養(yǎng)箱,上海精宏試驗(yàn)儀器有限公司；牛津杯,上海江星儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1乳酸菌的分離與純化

采用常規(guī)平板稀釋法[11]和平板劃線分離法[12]對(duì)豆醬中乳酸菌進(jìn)行分離純化，之后進(jìn)行革蘭氏染色和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)。

1.3.2產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的初篩

采用牛津杯法[13]，將乳酸菌發(fā)酵液于10 000 r/min離心10 min取上清液備用。調(diào)指示菌濃度為107CFU/mL，取100 μL均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基上，4 ℃靜置1 h后，等距放置3個(gè)牛津杯，分別加入100 μL無(wú)菌發(fā)酵上清液，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。

1.3.3產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的復(fù)篩

1.3.3.1有機(jī)酸的排除[2]

乳酸菌發(fā)酵上清液用1 mol/L的NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)pH至5.0，同時(shí)測(cè)定pH5.0的乙酸和乳酸的抑菌活性，重復(fù)3次取均值。

1.3.3.2過(guò)氧化氫的排除[14]

將乳酸菌發(fā)酵上清液于80 ℃水浴加熱10 min，測(cè)抑菌活性，重復(fù)3次取均值。

1.3.3.3蛋白酶類(lèi)抑菌物質(zhì)的確定[1]

將胰蛋白酶溶解到50 mmol/L的磷酸緩沖液(pH7.6)中，再加入到乳酸菌發(fā)酵上清液，使其終濃度為1 mg/mL，調(diào)節(jié)pH至7.6，37 ℃水浴1 h后，調(diào)回初始pH，檢測(cè)抑菌活性，重復(fù)3次取均值。

1.3.4產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌菌株的鑒定

1.3.4.1生理生化鑒定

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[15、16]對(duì)菌株進(jìn)行生理生化鑒定。

1.3.4.216S rRNA基因序列同源性分析鑒定

優(yōu)化的CTAB法提取菌株DNA[17]。采用通用引物[18]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將片段長(zhǎng)度約為1 500 bp的陽(yáng)性產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。在NCBI上使用BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)，并用MEGA軟件包以neighbour-joining (NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[19]。

1.3.5抑菌譜的測(cè)定

選取單核細(xì)胞增生李斯特菌、沙門(mén)氏菌、地衣芽孢桿菌等多種菌株作為指示菌，采用牛津杯法測(cè)定產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的抑菌譜。

1.3.6細(xì)菌素穩(wěn)定性研究[20]

1.3.6.1細(xì)菌素的酸堿穩(wěn)定性

用1 mol/L的NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)乳酸菌發(fā)酵上清液pH至2～10，37 ℃保溫2 h后，測(cè)抑菌活性，重復(fù)3次取均值。

1.3.6.2細(xì)菌素的熱穩(wěn)定性

用1 mol/L的NaOH溶液將乳酸菌發(fā)酵上清液pH調(diào)至5.0，分別在60、80、100 ℃處理30 min，121 ℃處理15 min，以相同pH值的未經(jīng)加熱處理的發(fā)酵上清液作為空白對(duì)照，檢測(cè)抑菌活性，重復(fù)3次取均值。

1.3.6.3細(xì)菌素對(duì)蛋白酶的敏感性

方法同“1.3.3.3”所述，采用胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶k。

1.3.7細(xì)菌素種類(lèi)的確定

1.3.7.1腸球菌素基因PCR檢測(cè)

參考文獻(xiàn)按[20-21]設(shè)計(jì)引物，引物由天根生化科技有限公司合成(表1)。以基因組DNA為模板擴(kuò)增細(xì)菌素基因序列，所得PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)[22]。[27]合成腸球菌毒力基因相關(guān)引物，見(jiàn)表2。以基因組DNA為模板，對(duì)目的毒力因子基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1　菌株R1細(xì)菌素相關(guān)基因PCR擴(kuò)增引物

1.3.7.2細(xì)菌素基因片段的克隆

采用膠回收試劑盒(Sangon Biotech SK8132)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，按載體說(shuō)明，將純化后的PCR產(chǎn)物與pEASY-T1載體相連接，連接產(chǎn)物于-20 ℃保存。向50 μL大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中加入5 μL連接產(chǎn)物，混勻，冰浴靜置30 min。于42 ℃水浴60～90 s，迅速放于冰上5 min。加入500 μL LB液體培養(yǎng)基，混勻，于37 ℃，150 r/m搖床培養(yǎng)1 h。取150 μL菌體均勻涂布于含有氨芐的LB固體平板，37 ℃培養(yǎng)12～16 h。挑取平板上的白斑接種于10 μL RNase-Free Water中，混勻，以該混合物為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，將有條帶的樣品轉(zhuǎn)移到10 mL含有氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，150 r/m搖床培養(yǎng)12～16 h。將培養(yǎng)好的新鮮菌液送至上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.8產(chǎn)細(xì)菌素菌株的益生性

1.3.8.1模擬胃液耐受性

參照國(guó)家藥典[23]配制模擬胃液，取活化好的菌液于6 000 r/min離心2 min，向菌體中加入與培養(yǎng)基等量的模擬胃液，37 ℃培養(yǎng)3 h，采用傾注培養(yǎng)法對(duì)0、3 h的培養(yǎng)液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)[24]，計(jì)算存活率。

1.3.8.2模擬腸液耐受性

參照國(guó)家藥典[23]配制模擬腸液，取活化好的菌液于6 000 r/min離心2 min，向菌體中加入與培養(yǎng)基等量的模擬腸液，37 ℃培養(yǎng)6 h，采用傾注培養(yǎng)法對(duì)0、2、4、6 h的培養(yǎng)液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率。

1.3.8.3膽鹽耐受性

將菌株發(fā)酵液以3%接種量接種到含有0.3%膽鹽濃度的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)6 h后，采用傾注培養(yǎng)法對(duì)0、2、4、6 h的培養(yǎng)液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率。

1.3.9產(chǎn)細(xì)菌素菌株的安全性

1.3.9.1菌株的耐藥性

采用藥敏紙片法[6,25]測(cè)定菌株耐藥性，參照紙片法抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定[26]，重復(fù)3次取均值。

1.3.9.2毒力基因檢測(cè)

2結(jié)果與分析

2.1乳酸菌的分離

從遼寧省6個(gè)地區(qū)的13份豆醬樣品中，共分離出164株革蘭氏染色為陽(yáng)性，過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)為陰性的疑似乳酸菌菌株，包括84株球菌。

表2　毒力因子基因PCR擴(kuò)增引物

2.2產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選

從84株球狀疑似乳酸菌中，初篩得到24株具有較好抑菌特性的菌株，再進(jìn)行復(fù)篩。

酸排除試驗(yàn)后，菌株FSI-4、FSI-3和R1的抑菌性分別下降27.45%、19.83%和12.26%；H2O2排除試驗(yàn)后，抑菌性分別下降16.26%、3.79%和2.59%，鑒于菌株R1受酸和H2O2的影響最小，且其抑菌活性相對(duì)于其他菌種最好，所以后續(xù)試驗(yàn)均采用R1為目的菌株。具體結(jié)果見(jiàn)表3和圖1。

表3　產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌復(fù)篩結(jié)果

注：“-”沒(méi)有抑菌效果，包含牛津杯直徑為8 mm。

R1的發(fā)酵上清液用胰蛋白酶處理后不產(chǎn)生抑菌圈，抑菌活性下降100%?？梢酝茰y(cè)該抑菌物質(zhì)對(duì)蛋白酶敏感，屬于蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)，可初步確定為細(xì)菌素。

2.3產(chǎn)細(xì)菌素菌株的鑒定

2.3.1生理生化試驗(yàn)

如表4，根據(jù)菌株形態(tài)特征并參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第八版)》[15]和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[16]，菌株R1屬于腸球菌屬(Enterococcussp.)。

A-發(fā)酵上清原液抑菌情況；B-pH5.0的發(fā)酵上清液抑菌情況；C-排除H2O2后抑菌情況；D-胰蛋白酶處理后抑菌情況圖1　菌株R1的復(fù)篩結(jié)果Fig.1　Further screening of bacteriocin producing R1

試驗(yàn)項(xiàng)目葡萄糖阿拉伯糖乳糖蔗糖半乳糖麥芽糖甘露糖山梨醇果糖淀粉水解明膠液化纖維二糖檸檬酸鹽丙酮酸鹽0.02%疊化鈉0.04%碲酸鹽過(guò)氧化氫酶40%膽鹽精氨酸雙水解酶10℃和45℃6.5%NaClpH9.6結(jié)果+++++++﹣+﹣﹣+﹣﹣+﹣﹣+++++

注：“+”陽(yáng)性；“-”陰性。

2.3.216S rDNA 序列同源性分析鑒定

電泳圖顯示，在約1 500 bp處出現(xiàn)熒光條帶，擴(kuò)增成功。將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定該菌株為屎腸球菌(Enterococcusfaeciums)。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖2。

圖2　R1的16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2　Phylogenetic tree of strain R1 based on 16S rDNA gene sequence

2.4抑菌譜的測(cè)定

如表5所示，R1所產(chǎn)細(xì)菌素對(duì)多數(shù)指示菌有一定程度的抑制作用，尤其是對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌顯示出較強(qiáng)的抑制能力，抑菌范圍較廣。

表5　細(xì)菌素的抑菌譜

注：“-”無(wú)抑菌性；“+”抑菌圈直徑<10 mm；“++”抑菌圈直徑10～15 mm；“+++”抑菌圈直徑>15 mm。

2.5細(xì)菌素穩(wěn)定性的研究

鑒于R1對(duì)李斯特菌的抑制能力最強(qiáng)，以下試驗(yàn)均選取李斯特菌為指示菌。

2.5.1細(xì)菌素酸堿穩(wěn)定性

R1所產(chǎn)細(xì)菌素在pH 2～6時(shí)均具有抑菌活性，隨pH升高抑菌活性逐漸下降，pH 7～10已無(wú)抑菌活性，可見(jiàn)該細(xì)菌素在酸性環(huán)境下具有較好的抑菌效果，說(shuō)明酸有助于其發(fā)揮抑菌作用。見(jiàn)表6。

表6　細(xì)菌素的酸堿穩(wěn)定性

注：“-”沒(méi)有抑菌效果。

2.5.2細(xì)菌素?zé)岱€(wěn)定性

細(xì)菌素殘余活性隨溫度升高而下降，在121 ℃條件下處理15 min后，抑菌活性仍然保留78%，說(shuō)明其具有一定的熱穩(wěn)定性。見(jiàn)表7。

表7　細(xì)菌素的熱穩(wěn)定性

2.5.3細(xì)菌素對(duì)蛋白酶的敏感性

R1所產(chǎn)細(xì)菌素易被胰蛋白酶和蛋白酶k降解，抑菌活性下降100%，胃蛋白酶處理后抑菌活性亦顯著下降，可以確定該物質(zhì)對(duì)蛋白酶敏感，確為蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)。見(jiàn)表8。

表8　細(xì)菌素對(duì)蛋白酶敏感性

注：“-”沒(méi)有抑菌效果。

2.6細(xì)菌素種類(lèi)的確定

只有以EntP-F/R為引物的PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期片段長(zhǎng)度相同，該產(chǎn)物經(jīng)純化克隆后，由上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序，將所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，證實(shí)菌株R1所產(chǎn)細(xì)菌素的種類(lèi)為EntP。

2.7產(chǎn)細(xì)菌素菌株的益生性

由于飲食結(jié)構(gòu)不同胃液pH通常在1.5～4.5之間波動(dòng)，一般為3.0[24]。經(jīng)3 h培養(yǎng)，菌株R1在pH2.5和pH3.0的模擬胃液中存活率分別達(dá)44.10%和86.35%，可見(jiàn)，該菌株對(duì)模擬胃液具有很好的耐受性。見(jiàn)表9。

表9　屎腸球菌R1對(duì)模擬胃液的耐受性

正常人體小腸中膽汁鹽質(zhì)量濃度在0.3～3.0 g/L之間[28]。R1在模擬腸液中培養(yǎng)6 h后，存活率為87.72%，在含0.3%膽鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h后，存活率為32.21%(見(jiàn)表10)，可見(jiàn)，該菌株對(duì)模擬腸液和膽鹽也有一定程度的耐受性，該菌株具有潛在的益生特性。

表10　屎腸球菌R1對(duì)模擬腸液和膽鹽的耐受性

2.8產(chǎn)細(xì)菌素菌株的安全性

參照紙片法抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)抗菌藥物對(duì)試驗(yàn)菌株產(chǎn)生的抑菌圈大小或最小抑菌濃度(MIC)的不同，將評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)分為敏感(Susceptible)、中介(Intermediate)和耐藥(Resistant)。R1對(duì)所選抗生素均無(wú)抗性(見(jiàn)表11、圖3)。毒力基因PCR擴(kuò)增后的電泳圖譜并沒(méi)有和預(yù)期片段大小相同的條帶出現(xiàn)，可初步確定R1不含這6種毒力基因，具有潛在安全性。

表11　屎腸球菌R1藥敏試驗(yàn)結(jié)果

圖3　屎腸球菌R1藥敏試驗(yàn)結(jié)果Fig.3　Profile of antibiotics susceptibility of E.faeciums R1

3結(jié)論

本試驗(yàn)從傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中分離得到1株產(chǎn)細(xì)菌素的屎腸球菌R1，所產(chǎn)細(xì)菌素種類(lèi)為腸球菌素P。菌株R1對(duì)人工消化液具有很好的耐受性，其產(chǎn)生的細(xì)菌素具有熱穩(wěn)定性好、pH范圍寬等特性，這與AHMADOVA[29]等從奶酪中分離出的屎腸球菌AQ71所產(chǎn)細(xì)菌素的性質(zhì)相似，與之相比，R1所產(chǎn)細(xì)菌素對(duì)于化學(xué)試劑的穩(wěn)定性值得進(jìn)一步探究。

該細(xì)菌素對(duì)多種指示菌都具有較好的抑菌效果，尤其是對(duì)李斯特菌效果顯著。MTIBAA[30]等對(duì)屎腸球菌所產(chǎn)細(xì)菌素的基因序列進(jìn)行分析，證實(shí)了羥脯氨酸殘基是其抑制單增李斯特菌細(xì)菌的作用方式。而從蛋白角度，GOMEZ[31]等將腸球菌素AS48作用于李斯特菌后，發(fā)現(xiàn)李斯特菌的多種應(yīng)激蛋白和細(xì)胞代謝蛋白發(fā)生變化，這為腸球菌素AS48抑菌機(jī)理的研究提供了方向。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于腸球菌素P研究甚少，其對(duì)李斯特菌抑制機(jī)理值得進(jìn)一步探索。

此外，菌株R1對(duì)青霉素、環(huán)丙沙星等多種抗生素敏感，并且未檢出毒力基因，具有潛在的安全性。

乳酸菌素作為天然的食品防腐劑和飼料添加劑具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。本試驗(yàn)篩選出的產(chǎn)細(xì)菌素的屎腸球菌R1，具有較好的穩(wěn)定性、益生性和潛在的安全性，可作為今后開(kāi)發(fā)利用的優(yōu)質(zhì)菌種資源。

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Characterization of bacteriocin produced byEnterococcusfaeciumisolated from soypaste

WANG Xiao-rui1, ZOU Ting-ting1, GUO Zhi-fu3, ZHANG Chun-hong1,TAO Dong-bing1, WANG Yin-gang3, WU Ri-na1,2﹡

1(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China) 2(State Key Laboratory of Food Science and Technology, College of Food Science, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 3(College of Biotechnology,Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

ABSTRACTTo provide strain for the development and application of natural food preservatives and feed additives, 164 suspected lactic acid bacteria strains including 84 coccus-shaped strains were isolated from naturally fermented soypaste. A strain of Enterococcus faecium R1 producing bacteriocin was selected. Its physical and chemical properties were studied. The bacteriocin had a strong inhibitory effect to Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli and other bacteria, and was not affected by high temperature and low pH. The bacteriocin was found to possess enterocin P. Results showed that the survival rate of strain R1 was 86.35% in pH3.0 simulated gastric fluid for 3 h and 87.72% in simulated intestinal fluid for 6 h. Strain R1 had good tolerance to artificially digested liquid. Strain R1 was sensitive to penicillin, ampicillin, ciprofloxacin, chloramphenicol and gentamicin, but was insensitive to norfloxacin and erythromycin. It was negative for the tested virulence factors. This revealed that strain R1 might be safe for further application.

Key wordsEnterococcus faecium; bacteriocin; soypaste; characterization

收稿日期：2015-11-25，改回日期：2016-01-05

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31471713)；中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目(2014M560395)；遼寧省農(nóng)業(yè)領(lǐng)域青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃(2014048)；遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(LR2015059)；江蘇省博士后科研資助計(jì)劃(1402071C)；沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)"天柱山英才支持計(jì)劃"項(xiàng)目

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201604017

第一作者：碩士研究生(烏日娜副教授為通訊作者,E-mail:wrn6956@163.com)。