遠(yuǎn)東擬沙丁魚酶解產(chǎn)物的降血壓效果評價及其ACE抑制肽的分離純化與鑒定

王晶晶，吉薇，吉宏武,2,3,4*，蘇偉明,2,3,4，李亞會，劉書成,2,3,4

1(廣東海洋大學(xué)，食品科技學(xué)院，廣東 湛江，524088)　2(廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東 湛江，524088) 3(水產(chǎn)品深加工廣東普通高校重點實驗室，廣東 湛江，524088)　4(廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江，524088 )

?

遠(yuǎn)東擬沙丁魚酶解產(chǎn)物的降血壓效果評價及其ACE抑制肽的分離純化與鑒定

王晶晶1，吉薇1，吉宏武1,2,3,4*，蘇偉明1,2,3,4，李亞會1，劉書成1,2,3,4

1(廣東海洋大學(xué)，食品科技學(xué)院，廣東 湛江，524088)2(廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東 湛江，524088) 3(水產(chǎn)品深加工廣東普通高校重點實驗室，廣東 湛江，524088)4(廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江，524088 )

摘要以遠(yuǎn)東擬沙丁魚肌肉為原料，采用動物蛋白水解酶和風(fēng)味蛋白酶聯(lián)合水解制備其酶解產(chǎn)物(簡稱為SMMH)，SMMH通過截留分子量分別為10 kDa和3 kDa超濾膜進(jìn)行分離，獲得3個組分，分別稱為A(MW>10 kDa)、B(3 kDa

關(guān)鍵詞遠(yuǎn)東擬沙丁魚;酶解產(chǎn)物;血管緊張素轉(zhuǎn)移酶(ACE)抑制肽;原發(fā)性高血壓大鼠;分離純化

高血壓是一個主要公共健康問題，它幾乎影響了將近全世界1億的人口[1]。研究表明,血壓水平和患一些心血管疾病(如動脈硬化、中風(fēng)和心肌梗塞)的風(fēng)險有直接關(guān)系[2]。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAS)是調(diào)節(jié)機體血壓正常、體液平衡主要的激素系統(tǒng)，而其中血管緊張素轉(zhuǎn)移酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)在這個系統(tǒng)中扮演一個重要的角色。ACE是一種位于細(xì)胞膜上的Zn2+依賴型羧二肽酶，它不僅使血管緊張素I轉(zhuǎn)變成血管緊張素II，而且還抑制了一種血管擴張肽(緩激肽)的活性，這導(dǎo)致高血壓[3]。因此，抑制ACE活性是一種很好治療高血壓的方式之一。目前，許多人工合成的ACE抑制劑能夠有效的治療高血壓(如卡托普利、賴諾普利、福辛普利、西拉普利)，雖然這些合成的ACE抑制劑能夠有效降低血壓，但它們同時也帶來一些負(fù)面影響(如頭痛、咳嗽、眩暈、疲勞和腹瀉)[4-5]。由于這些負(fù)面影響，近年來人們越來越青睞于食源性的ACE抑制肽。

自從，F(xiàn)ERREIRA[6]首次從巴西蝮蛇蛇毒分離出ACE抑制肽后，緊接著人們從許多食物蛋白中分離出抗血壓組分，如明膠[7]、牛奶[8]、玉米[9]等。近年來，由于海洋蛋白對促進(jìn)健康、減少疾病風(fēng)險的影響以及其豐富的氨基酸結(jié)構(gòu)，越來越多的人們關(guān)注來源于海洋蛋白中的ACE抑制肽[10-13]。

我國東南沿海擁有豐富的遠(yuǎn)東擬沙丁魚，其生長快、繁殖力強、價值低,食用后具有疏通血管、控制血壓升高、免患血栓病等功效，但由于魚的肉質(zhì)嫩、脂肪含量高、酶活性強，容易腐敗變質(zhì)，難以保鮮。目前，遠(yuǎn)東擬沙丁魚大多被加工成飼料、肥料，少部分制成罐頭，資源附加值低[14]。為了提高遠(yuǎn)東擬沙丁魚的附加值，本研究采用酶解方法對其肌肉進(jìn)行水解，評價其酶解產(chǎn)物降血壓效果，分離純化ACE抑制肽，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，以期為遠(yuǎn)東擬沙丁魚開發(fā)降血壓肽保健食品提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和技術(shù)支撐。

1材料和方法

1.1材料與試劑

遠(yuǎn)東擬沙丁魚(Sardinops sagax)，購買于湛江市東風(fēng)市場；9周齡雄性 SHR 大鼠(購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，體重220～240 g,收縮壓≥180 mmHg)；動物蛋白水解酶、風(fēng)味蛋白酶由南寧龐博試劑公司提供；ACE 、馬尿酰 - 組氨酰 - 亮氨酸 (N-Hippuryl-His-Leu，HHL)購買于美國 Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品 ；丙烯葡聚糖凝膠(Sephacryl S-100 High resolution)、快流速Q(mào)瓊脂糖凝膠(Q-Sepharose Fast Flow)，美國GE公司；乙腈(色譜純)，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

冷凍干燥機(CCA-1111)，東京理化； 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(FDU-1100)，東京理化；BP-98A無創(chuàng)血壓計，日本Softron； LTQ Orbitrap Elite質(zhì)譜儀，美國Thermo Fisher公司。

1.3遠(yuǎn)東擬沙丁魚肌肉酶解產(chǎn)物的制備

工藝流程：遠(yuǎn)東擬沙丁魚→前處理→酶解→滅酶→離心→脫色、苦味(珍珠巖)→脫油→過陶瓷膜(50 nm)→超濾→反滲透→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→冷凍干燥→遠(yuǎn)東擬沙丁魚低聚肽。

將新鮮的遠(yuǎn)東擬沙丁魚去頭、內(nèi)臟、骨頭，然后用蒸餾水清洗、打漿。在適宜的酶解條件下反應(yīng)3 h(動物蛋白水解酶0.5%、風(fēng)味酶0.1%，溫度50 ℃ ，自然pH),之后在90 ℃下滅酶15 min，4 000 r/min離心，同時加入珍珠巖脫色、脫苦味。取上清液于管式離心機中脫油，然后通過陶瓷膜(50 nm)微濾，滲透液通過10 kDa和3 kDa的超濾膜將獲得3個組分，分別為A (MW>10kDa)、B(3kDa

1.4ACE抑制活性的測定

ACE抑制活性測定方法參考文獻(xiàn)[15]的方法。HPLC色譜條件：SymmetryC18分析型色譜柱 (5μm,4.6mm×250mm)；檢測波長:228nm；流速：1mL/min；流動相A：水(含0.05% 三氟乙酸 )；流動相B：乙腈(含0.05% 三氟乙酸 )；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：25 ℃；洗脫條件：V(B)∶V(A)=25∶75。ACE抑制率根據(jù)公式(1)計算：

(1)

式中：A1為未加入樣品組中馬尿酸的峰面積，mAU·s；A2為加入樣品組中馬尿酸的峰面積，mAU·s。

IC50的定義為在一定條件下抑制ACE酶活性一半時所需要的抑制劑濃度。由于抑制率與制劑濃度之間不是一個線性的關(guān)系，因此必須首先繪制抑制劑濃度與抑制率關(guān)系的曲線，再從曲線上查出IC50。所有的結(jié)果都進(jìn)行了3次重復(fù)測量。

1.5組分C(MW<3000Da)對原發(fā)性高血壓大鼠的降壓效果

實驗共分5組，每組原發(fā)性高血壓大鼠6只，分別關(guān)在5個不同的籠子里，并放置于室溫24 ℃的SPF動物房內(nèi)(廣東省海洋大學(xué)SPF級實驗動物房,No:SYXK2014-0053)，采用標(biāo)準(zhǔn)實驗飼料和飲水喂養(yǎng)1周后開始實驗,空白對照組只灌胃蒸餾水；陽性對照組灌胃卡托普利，劑量是5mg/kg(b.w)；高、中、低劑量組灌胃組分C，劑量分別為500、1000 和 1500mg/kg(b.w)。短效實驗測定灌喂后0、2、4、6、8和10hSHRs大鼠的收縮壓(SBP)，長效實驗測定0、3、6、9、12、15、18、21、24、27dSHRs大鼠的收縮壓(SBP)，利用BP-98A無創(chuàng)血壓計測量老鼠收縮壓(SBP)。

1.6ACE抑制肽的分離純化

首先將組分C通過丙烯葡聚糖凝膠柱(1.6cm×34cm)分離，分離條件：質(zhì)量濃度5mg/mL；緩沖液為蒸餾水；流速為1mL/min；上樣體積2mL；波長214nm。然后將活性最高的組分通過快流速Q(mào)瓊脂糖凝膠柱(2.6cm×12cm)進(jìn)一步分離,分離條件：質(zhì)量濃度1.5mg/mL；50mmol/Ltris緩沖液(pH=9.5)；流速為5mL/min；上樣體積10mL；波長214nm。最后將活性最高的組分在通過反向高效液相進(jìn)一步分離，色譜條件：色譜柱YMC-PackODS-AQC18柱(5μm)；流動相A乙腈、B超純水；5%～20%B梯度洗脫20min；進(jìn)樣流速1mL/min，進(jìn)樣量20μL；檢測波長：214nm。將各級分離收集的樣品旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凍干燥并測定每個組分的ACE抑制率。

1.7ACE抑制肽的鑒定

采用美國ThermoFisher公司的LTQOrbitrapElite質(zhì)譜儀對RP-HPLC分離得到的兩個ACE抑制率較高的級份進(jìn)行氨基酸序列鑒定。質(zhì)譜條件：離子方式為ESI+、噴霧電壓：+ 3.0kV、源加熱溫度：200 ℃、毛細(xì)管溫度：300 ℃、鞘氣流速：30arb、輔助氣流速：5arb。

2結(jié)果與分析

2.1遠(yuǎn)東擬沙丁魚酶解產(chǎn)物不同超濾組分的體外ACE抑制活性

遠(yuǎn)東擬沙丁魚酶解產(chǎn)物與3個超濾組分的ACE抑制活性如圖1所示。從圖1可以看出，在質(zhì)量濃度為2mg/mL時，組分B和C都比原酶解液的ACE抑制率高，而組分A比原酶解液的ACE抑制率低，其中組分C顯示最強的ACE抑制率為71.4%。這主要是因為ACE抑制肽一般由2～12個氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量大多低于1.5kDa[16]。這一結(jié)果和LeiDu研究可口囊星蟲水溶性蛋白通過超濾分ACE抑制活性相一致[17]。因此，組分C將進(jìn)一步研究。

圖1　遠(yuǎn)東擬沙丁魚酶解產(chǎn)物與3個超濾組分的ACE抑制活性Fig.1　The ACE inhibitory activity of 3 ultrafiltered fractions and Sardinops melanosticta muscl hydrolysate

2.2遠(yuǎn)東擬沙丁魚超濾組分C(MW<3 000 Da)對原發(fā)性高血壓大鼠的降壓效果

組分C的降壓效果通過測定SHRs大鼠收縮壓的改變來評估。在一次灌胃SHRs大鼠之后，SHRs大鼠在10 h之內(nèi)收縮壓的變化如圖2-A所示。

圖2　SHRs大鼠在灌胃超濾組分C之后收縮壓(SBP)的變化。Fig.2　Change of systolicblood pressure (SBP) after oral administration of the fraction C from SMMH (顯著性差異在P<0.05)

由圖2可知,與空白對照組相比，灌胃不同劑量組分C前6 h之內(nèi)SHRs大鼠的收縮壓都有顯著降低(P<0.05)，其中灌胃劑量為1 500 mg/kg (b.w)能夠最大幅度的降低SHRs大鼠的收縮壓，并且在第6 h能夠降低最大值為13 mmHg ，然而，在10 h后降低收縮壓的現(xiàn)象幾乎消失。組分C的短期降血壓的規(guī)律和文獻(xiàn)報道的相一致[18]。為了進(jìn)一步探索組分C的降壓效果，連續(xù)灌胃28 d(每天灌胃1次)SHRs大鼠，各組SHRs大鼠的收縮壓變化如(圖2-B)所示，與空白對照組相比，灌胃組分C后對SHRs大鼠收縮壓具有顯著降低作用(P<0.05)，并且隨著灌胃劑量的增加，SHRs大鼠收縮壓降低值越大，這表明組分C有較強的降血壓效果。與陽性對照組相比，灌胃組分C對SHRs大鼠收縮壓的降低作用不如其顯著(P<0.05)，這可能是因為組分C是一種混合物，含有一些非降血壓成分，而Captopril是一種人工合成的降血壓藥物。這一結(jié)果與王茵等評價了紫菜酶解產(chǎn)物對SHRs大鼠的長期降血壓效果相一致[19]。雖然組分C的降血壓作用不如Captopril效果明顯，但它具有天然、安全、無毒副作用等優(yōu)點，可作為抗高血壓保健品的基本原料。

2.3ACE抑制肽的分離純化

圖3顯示了不同分離步驟的色譜圖與各級份的體外ACE抑制率。從圖3-A-a可以看出，組分C經(jīng)丙烯葡聚糖凝膠柱分為3個級份，分別稱為p1、p2、p3,各級份的ACE抑制率如圖3-A-b所示,其中 p2的ACE抑制率最高為76.1%，并且測定它的IC50值是0.758 mg/mL。p2通過快流速Q(mào)瓊脂糖凝膠柱進(jìn)一步分離,又分成了3個級份(圖3-B-a), 分別稱為p2-1、p2-2、p2-3，各級份的ACE抑制率如圖3-B-b所示，其中p2-2顯示最強的ACE抑制率為36.2%，并測定其IC50值是0.153 mg/mL。級份p2-2通過反向高效液相 C18分析柱進(jìn)一步分離得到5個主要的級份(圖3-C-a),分別為p2-2-1、p2-2-2、p2-2-3、p2-2-4、p2-2-5，其中，級份p2-2-2和p2-2-4顯示最強，它們的ACE抑制率分別為34.1%和41.6%，IC50值分別是8.3和6.9 μg/mL。

2.4ACE抑制肽的鑒定

圖4顯示了級份p2-2-2(圖4-A)和級份p2-2-4(圖4-C)的ESI/MS的一級質(zhì)譜圖，由圖可知，級份p2-2-2和p2-2-4主要成分分子離子峰的質(zhì)量分別為679.6 Da和301.3 Da，然后選取這兩種分子離子峰通過MS/MS二級質(zhì)譜分析其氨基酸序列(圖4-B，圖4-C)。由于b系列和y系列離子在二級質(zhì)譜中的峰強相對較高，根據(jù)這些離子片段質(zhì)譜信息，手工推斷p2-2-2和p2-2-4的氨基酸序列分別為Lys-Val-Glu-Pro-Leu-Pro和Pro-Ala-Leu。

CHANG-BUM[16]報道了ACE抑制肽一般是由2～12氨基酸殘基組成，級份p2-2-2和p2-2-4分別是由3肽和6肽組成，這與該文獻(xiàn)報道的具有一致性。ACE抑制肽的構(gòu)效關(guān)系研究頗多，但尚無一致結(jié)論。CHEUNG[20]報道，當(dāng)ACE抑制肽的C末端是 Pro或芳香族氨基酸殘基(Tyr、Phe、Trp) 及N末端是Pro或疏水性氨基酸殘基(Val、 Leu、Ile)時，其具有顯著的ACE抑制活性，而C末端殘基在結(jié)合ACE活性位點時占主導(dǎo)地位。本研究獲得的級份p2-2-2的C末端是Pro，級份p2-2-4的N末端是Pro，符合上述規(guī)律。

圖3　組分C經(jīng)丙烯葡聚糖凝膠(S-100)柱、快流速Q(mào)瓊脂糖凝膠(QFF)陰離子交換柱和反向高效液相C18柱分離色譜圖及各組分的ACE抑制率Fig.3　The purification step for the fraction C on a Sephacryl 100 gel filtration column, Q-Sepharose Fast Flow anion-exchange column and rereverse phase HPLC . The ACE inhibitory activity of separated fractions were measured(b)

3結(jié)論

遠(yuǎn)東擬沙丁魚是南海大宗低值魚類，其酶解產(chǎn)物均具有一定的ACE抑制活性，分子質(zhì)量越低，ACE抑制率越大。小于3 000 Da的酶解產(chǎn)物對SHRs大鼠的壓具有明顯的降低功效其降血壓的主要成分為2種ACE抑制肽，它們的氨基酸序列分別為 Lys-Val-Glu-Pro-Leu-Pro(IC50=22.9 μmol/L)和 Pro-Ala-Leu(IC50=12.2 μmol/L)。這一研究結(jié)果暗示，遠(yuǎn)東擬沙丁魚酶解產(chǎn)物可以作為降血壓保健食品的功效性基料。

參考文獻(xiàn)

[1]WOLF-MAIER K,COOPER R,BANEGAS J,et al. Hypertension prevalence and blood pressure levels in 6 European countries,Canada,and the United States[J]. JAMA ,2003;289(5):2 363-2 369.

圖4　級份p2-2-2 和 p2-2-4的一級質(zhì)譜、二級質(zhì)譜Fig.4　ESI-MS/MS spectrogram of the fraction p2-2-2 and p2-2-4

[2]TURNBULL F, NEAL B, NINOMIYA T, et al. Effects of different regimens to lower blood pressure on major cardiovascular events in older and younger adults: meta-analysis of randomized trials[J].BMJ, 2008;336(1):1 121-1 123.

[3]CUSHMAN D W,CHEUNG H S,SABO E F,et al. Development and design of specific inhibitors of angiotensin-converting enzyme[J]. Am J Cardiol,1982,49(3):1 390-1 394.

[4]GHASSEM M,ARIHARA K,BABJI A S,et al. Purification and identification of ACE inhibitory peptides from Haruan (Channa striatus) myofibrillar protein hydrolysate using HPLC-ESI-TOF MS/MS[J]. Food Chem,2011,129(15):1 770-1 777.

[5]BOSCHIN G,SCIGLIUOLO G M,RESTA D,et al. ACE-inhibitory activity of enzymatic protein hydrolysates from lupin and other legumes[J]. Food Chem ,2014,145(9):34-40.

[6]FERREIRA S.A bradykinin‐potentiating factor (BPF) present in the venom of Bothrops jararaca[J]. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy,1965,24(1): 163-169.

[7]OSHIMA G,SHIMABUKURO H,NAGASAWA K.Peptide inhibitors of angiotensin I-converting enzyme in digests of gelatin by bacterial collagenase[J].Biochim Biophys Acta,1979,566(7):128-137.

[8]MULLALLY M,MEISEL H,FITZGERALD R J.Identification of a novel angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptide corresponding to a tryptic fragment of bovine betalactoglobulin[J].FEBS Lett,1997,402(2):99-101.

[9]YANO S,SUZUKI K,FUNATSU G.Isolation from alpha-zein of thermolysin peptides with angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity[J]. Biosci Biotechnol Biochem,1996,60(3):661-663.

[10]KOHAMA Y,MATSUMOTO S,OKA H,et al. Isolation of angiotensin-converting enzyme inhibitor from tuna muscle[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,1988,155(6):332-337.

[11]WANG J P,HU J E,CUI J Z,et al. Purification and identification of a ACE inhibitory peptide from oyster proteins hydrolysate and the anti hypertensive effect of hydrolysate in spontaneously hypertensive rats[J]. Food Chem,2008,111(8):302-308.

[12]TSAI J S,CHEN J L,PAN B S.ACE-inhibitory peptides identified from the muscle protein hydrolysate of hard clam (Meretrixlusoria)[J]. Process Biochem,2008,43(12):743-747.

[13]KAWAMURA Y,TAKANE T, SATAKE M.et al. Physiologically active peptide motif in proteins - peptide inhibitors of ACE from the hydrolysates of Antarctic krill muscle protein[J]. Jpn Agric Res,1996,26(5):210-213.

[14]李銘五.遠(yuǎn)東擬沙丁魚資源分布與利用[J].水產(chǎn)科學(xué),1986(4):43-45.

[15]CUSHMAN D W,CHEUNG H S.Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin I-converting enzyme of rabbit lung[J]. Biochem Pharmacol,1971,20(3):1 637-1 648.

[16]NATESH R,SCHWAGER S L U,STURROCK E D,et al. Crystal structure of the human angiotensin-converting enzyme-lisinopril complex[J]. Nature,2003(24):421-551.

[17]LEI D,MING F,HONGXI W. A novel angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide from Phascolosoma esculenta water-soluble protein hydrolysate[J].Journal of Functional Foods,2013(14): 475-483.

[18]AKIO Y,TAKUMA S,DAISUKE O.Novel angiotensin I-converting enzymey inhibitory peptide derived from bovine casein[J].Food Chemistry, 2013,141(6):3 781-3 789.

[19]王茵.紫菜降血壓肽酶法制備及降壓效果的研究[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué),2009:70-71.

[20]CHEUNG H S, WANG F L, ONDETTI M A, et al. Binding of peptide substrates and inhibitors of angiontensin-converting enzyme[J]. J Bio Chem,1980，255(3): 401-407.

Antihypertensive effect of enzymatic hydrolysate fromSardinopsmelanosticta

muscle on spontaneously hypertensive rats and identification of its angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitory peptide

WANG Jing-jing1， JI Wei1， JI Hong-wu1,2,3,4*， SU Wei-ming1,2,3,4，LI Ya-hui1， LIU Shu-cheng1,2,3,4

1(College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China) 2(Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety, Zhanjiang 524088, China) 3(Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution,Zhanjiang 524008,China) 4(Guangdong Engineering Research Center of Seafood, Zhanjiang 524088, China)

ABSTRACTSardinops melanosticta muscle was hydrolyzed using a combination of animal protein hydrolysis enzyme and flavor enzyme to obtain its hydrolysate abbreviated as SMMH. SMMH was then ultrafiltered with 10 kDa and 3 kDa cut-off membranes to yield 3 fractions named as A (MW>10 kDa), B(3 kDa

Key wordsSardinops melanosticta； hydrolysate； angiotensin-converting enzyme (ACE)； SHRs； isolation and purification

收稿日期：2015-11-09，改回日期：2015-12-04

基金項目：廣東省高等院校學(xué)科建設(shè)項目(編號：2013CXZDA020)；廣東省產(chǎn)學(xué)研合作項目(編號：2013B090600155)；廣東海洋大學(xué)創(chuàng)新強校項目(編號：GDOU2013050314, GDOU2014050203)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201604012

第一作者：碩士研究生(吉宏武教授為通訊作者，E-mail：jihw62318@163.com)。