NEK2對前列腺癌細(xì)胞增殖的影響

何廣寧　吳永定　陳果　蔡志煅　曾彥茹　江福能

523059東莞，南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞人民醫(yī)院腫瘤外科(何廣寧)；510180 廣州，廣州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院(吳永定)；510180 廣州，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院泌尿外科 廣東省臨床分子醫(yī)學(xué)及分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(陳果，曾彥茹，江福能)；510515 廣州，南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院 廣東省腎臟病研究所(蔡志煅)

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NEK2對前列腺癌細(xì)胞增殖的影響

何廣寧吳永定陳果蔡志煅曾彥茹江福能

523059東莞，南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞人民醫(yī)院腫瘤外科(何廣寧)；510180 廣州，廣州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院(吳永定)；510180 廣州，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院泌尿外科 廣東省臨床分子醫(yī)學(xué)及分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(陳果，曾彥茹，江福能)；510515 廣州，南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院 廣東省腎臟病研究所(蔡志煅)

【摘要】目的探討中心體相關(guān)激酶2(NEK2)在良性前列腺上皮細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)差異，及NEK2對前列腺癌細(xì)胞增殖的影響。方法運(yùn)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測NEK2在良性前列腺上皮細(xì)胞PrEC和前列腺癌細(xì)胞PC3、LNCaP和DU145中的表達(dá)情況，通過短發(fā)夾RNAs(shRNA)抑制LNCaP細(xì)胞株中內(nèi)源性NEK2的表達(dá)，再利用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及裸鼠腫瘤種植檢測LNCaP增殖情況。結(jié)果前列腺癌細(xì)胞PC3、LNCaP和DU145中的NEK2表達(dá)水平均比良性前列腺上皮細(xì)胞PrEC增加(P均<0.01)。shRNA技術(shù)構(gòu)建的NEK2表達(dá)在LNCaP細(xì)胞中下調(diào)， NEK2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均下降(P均<0.01)。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示，培養(yǎng)至72 h時(shí)shNEK2的細(xì)胞增殖率明顯低于注射無關(guān)序列的LNCaP(Scrambled)細(xì)胞。體內(nèi)試驗(yàn)顯示，shNEK2組的移植瘤體積明顯小于Scrambled細(xì)胞，shNEK2組移植瘤的NEK2蛋白表達(dá)比Scrambled組下調(diào)(P<0.01)。結(jié)論NEK2的過度表達(dá)能促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖，NEK2有望作為前列腺癌治療的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。

【關(guān)鍵詞】前列腺癌；中心體相關(guān)激酶2；細(xì)胞增殖

前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展是環(huán)境的刺激和眾多基因的變異共同作用的結(jié)果[1]。正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變成癌細(xì)胞的過程和抑癌基因的失活、原癌基因的激活和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因、DNA修復(fù)相關(guān)基因及生長因子基因的突變及細(xì)胞周期的控制有關(guān)。中心體相關(guān)激酶2(NEK2) 是細(xì)胞周期調(diào)控蛋白激酶家族成員之一[2]。NEK2除了分離中心體，在有絲分裂的啟動(dòng)階段具有調(diào)節(jié)中心體中微管構(gòu)成的作用[3-4]。NEK2能加快中心體蛋白(NIP)的移位。另外，NEK2也可能加速了有絲分裂中微管核化所必需的蛋白的補(bǔ)充[5]。因此，NEK2不僅是分裂間期中心體的一個(gè)關(guān)鍵組件，而且還是中心體自身裝配及檢修所必需的[6]。我們迫切需要深入研究和探索介導(dǎo)促進(jìn)前列腺腫瘤細(xì)胞增殖的分子生物學(xué)機(jī)制，找到潛在的治療靶標(biāo)，為前列腺癌的分子靶向治療提供理論依據(jù)。本課題組在前期研究miR-195的表達(dá)譜芯片時(shí)，篩選了一批下調(diào)基因，結(jié)合Taylor數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)NEK2與miR-195臨床表達(dá)呈高度負(fù)相關(guān)，本研究觀察了NEK2在良性前列腺上皮細(xì)胞及前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)水平的差異，旨在探討NEK2對前列腺癌細(xì)胞增殖的影響。

材料與方法

一、細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3種前列腺癌細(xì)胞株(PC3、DU145、LNCaP)為2012年從美國馬納薩斯學(xué)院(Manassas, VA, USA)的美國模式培養(yǎng)物集存庫 (ATCC)購買所得，而良性前列腺上皮細(xì)胞系PrEC是從瑞士Lonza 公司購買，從公司購買的細(xì)胞株均由公司負(fù)責(zé)鑒定和包裝，并在細(xì)胞復(fù)蘇3個(gè)月內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室。所有細(xì)胞株均在10% 胎牛血清、5%CO2、37℃的條件下培養(yǎng)。裸鼠購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于廣州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，所有操作均符合動(dòng)物倫理要求。

二、主要試劑

細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑全部購于美國Gibco公司，核酸蛋白提取試劑盒、SYBR GreenⅠPCR試劑盒以及蛋白免疫印跡所用試劑全部購于日本Takara公司，F(xiàn)uGENE轉(zhuǎn)染試劑購于美國Promega公司，全部引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)-8購于碧云天生物技術(shù)研究所， NEK2抗體 (bs-5732R)購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

三、 方法

1. 細(xì)胞RNA提取和質(zhì)控

采用Trizol法，將樣本按照說明書要求提取PC3、DU145、LNCaP 、PrEC的RNA，所得RNA經(jīng)美國安捷倫2100生物分析儀及配套試劑RNA6000 Nano檢測電泳鑒定，將RNA條帶清晰、RNA完整性計(jì)數(shù)≥6.0并且 28S/18S>0.7的樣本保存?zhèn)溆谩?/p>

2. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)，使用PC3、DU145、LNCaP及PREC mRNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，分別擴(kuò)增目的基因，檢測并驗(yàn)證NEK2 mRNA在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，所有數(shù)據(jù)分析采用美國Bio-Rad 公司的Opticon Monitor software 3.1版。

3. 細(xì)胞株構(gòu)建與驗(yàn)證

按照試劑盒說明書用短發(fā)夾RNA(shRNA)轉(zhuǎn)染LNCaP(shNEK2)。使用蛋白免疫印跡法驗(yàn)證NEK2蛋白表達(dá)強(qiáng)度：轉(zhuǎn)染48 h后提取蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，然后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至膜上，封閉，加入抗體孵育后與發(fā)光液充分反應(yīng)，曝光并將結(jié)果掃描后用圖像分析系統(tǒng)處理，β-actin 用作內(nèi)參對照。設(shè)PrEC為陰性對照、未轉(zhuǎn)染的LNCaP為陽性對照、轉(zhuǎn)染無關(guān)序列的LNCaP(Scrambled)為陰性對照。通過RT-PCR驗(yàn)證shNEK2及Scrambled的NEK2 mRNA表達(dá)水平。引物序列：NEK2上游5’- GCTTAGGTAGCCCTTTTCATTTACA-3’、下游5’-GCCTCAGGTCTATGAACCCAG-3’，長度1 155 bp；GA-PDH上游5’-CATGGGTGTGAACCATGAGAAGT-3’、下游5’-ACAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3’。

4. LNCaP增殖情況檢測

按照CCK-8試劑盒說明書把細(xì)胞接種到96孔板，按步驟加入試劑后使用ELISA法測定各孔光密度。

5. 裸鼠腫瘤模型構(gòu)建及檢測

在裸鼠的左右兩側(cè)分別注射sh-NEK2(sh-NEK2組)與Scambled(Scrambled組)各2×106個(gè)。植入細(xì)胞43 d后，收集腫瘤組織使用卡尺測量腫瘤進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、NEK2 mRNA在PrEC、LNCaP、DU145和PC3中的表達(dá)情況

NEK2在前列腺癌細(xì)胞DU145、 LNCap、PC3中的表達(dá)水平分別為0.76±0.08、0.96±0.02、0.84±0.05，均高于前列腺上皮細(xì)胞PrEC中的0.35±0.04(t分別為12.965、38.580、21.645，P均<0.001)。前列腺癌細(xì)胞中，LNCaP的NEK2表達(dá)水平分別高于DU145及PC3 (t分別為6.860、6.303，P均<0.001)，見圖1。

圖1　NEK2在人類前列腺癌和前列腺增生

與PrEC比較，**P<0.01

二、NEK2在PrEC、LNCaP、Scramble和shNEK2中的表達(dá)

shRNA-LNCaP中NEK2蛋白表達(dá)強(qiáng)度均低于PrEC、LNcap、Scrambled細(xì)胞，其mRNA表達(dá)水平為1.01±0.01，亦低于Scrambled細(xì)胞的0.12±0.02(t=11.258，P<0.001)，提示實(shí)驗(yàn)組LNCaP的NEK2表達(dá)被成功抑制，見圖2。

三、NEK2對LNCaP增殖的影響

1. 體外試驗(yàn)

培養(yǎng)至72 h時(shí)，shNEK2的細(xì)胞增殖(18.1±5.3)%，低于Scrembled組的(41.2±1.7)% (t=3.951，P<0.001) 。

2. 接種shNEK2和Scrambled的裸鼠移植瘤比較

裸鼠分別皮下注射Scrambled和shNEK2細(xì)胞43 d后，shNEK2組的移植瘤體積小于Scrambled組，見圖3。shNEK2組移植瘤的NEK2蛋白表達(dá)比Scrambled組下調(diào)(4.82±0.06vs. 1.37±0.02，t=94.482，P<0.001)，見圖4。

圖2　NEK2在PrEC、LNCaP、Scrambled和shNEK2中的表達(dá)

A：蛋白免疫印跡結(jié)果；B：RT-PCR結(jié)果；**P<0.01

圖3　Scrambled組和shNEK2組的移植瘤體積比較

A：Scrambled組;B：shNEK2組

討論

異常中心體幾乎存在于所有的人類腫瘤中。有學(xué)者認(rèn)為，中心體異常可能引起染色體不穩(wěn)定性的發(fā)生，由此增加了野生型抑癌基因丟失和原癌基因突變的幾率[7]。因此，染色體有絲分裂的操縱失控是多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。目前公認(rèn)的中心體相關(guān)激酶家族包括Polo樣激酶家族、Aurora蛋白激酶家族及NIMA相關(guān)激酶家族[8]。有研究顯示，NEK2在細(xì)胞周期調(diào)控尤其在中心體周期調(diào)控方面起著重要作用[9]，NEK2不僅是分裂間期中心體的一個(gè)關(guān)鍵組件，而且還是中心體自身裝配及檢修所必需的酶[6]。已有研究指出，有活性的NEK2可能使不成熟中心體的分離，導(dǎo)致2代中心粒間的內(nèi)聚力喪失[10]。無活性的NEK2會導(dǎo)致單極紡錘體、異常中心體及非整倍體的形成[11]。上述研究顯示，NEK2可影響腫瘤的發(fā)生過程。

目前已發(fā)現(xiàn)，在包括腎癌、 膽管癌、 睪丸癌、乳腺癌、卵巢癌等各種腫瘤中均存在著 NEK2 過度表達(dá)[12-14]。更重要的是，NEK2的表達(dá)上調(diào)已經(jīng)被證實(shí)與直腸癌、乳腺癌和黑色素瘤的臨床進(jìn)展和不良預(yù)后存在重要的聯(lián)系[15-16]。但是，目前筆者尚未見對NEK2在前列腺癌中的作用機(jī)制以及與前列腺癌進(jìn)展預(yù)后關(guān)系的研究。

圖4　Scrambled組和shNEK2組異種移植物的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

A、B：Scramble組；C、D：shNEK2組；棕色：NEK2陽性表達(dá)；藍(lán)色：細(xì)胞核染色

本研究首先檢測NEK2在良性的前列腺上皮細(xì)胞株P(guān)rEC和前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3、DU145、LNCaP中的表達(dá)差異，并發(fā)現(xiàn)NEK2的過度表達(dá)可能促進(jìn)了前列腺癌細(xì)胞的增殖，初步證明NEK2參與腫瘤的發(fā)病進(jìn)程，可能起著促癌基因的作用。有學(xué)者認(rèn)為，NEK2 及其同系物過度表達(dá)可聚集中心體，加快推進(jìn)有絲分裂進(jìn)程，甚至直接導(dǎo)致染色質(zhì)的分裂[17]。也有認(rèn)為變異的 NEK2 表達(dá)影響染色體著絲點(diǎn)蛋白，導(dǎo)致異倍體形成[18]。還有研究表明，NEK2的過度表達(dá)可以引發(fā)額外中心體的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖[10]。結(jié)合本研究，NEK2可能通過細(xì)胞周期調(diào)控細(xì)胞增殖影響前列腺腫瘤的發(fā)展。

腫瘤的發(fā)生是個(gè)復(fù)雜的過程，還需要做大量的工作才能更好地理解NEK家族的成員在腫瘤的發(fā)生中所起的作用。本研究在細(xì)胞水平和動(dòng)物層面證實(shí)NEK2影響腫瘤細(xì)胞增殖方面的作用，可能為前列腺癌的診斷與治療帶來新方向。

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(本文編輯：林燕薇)

Effect of NEK2 on prostate cancer cell proliferation

HeGuangning,WuYongding,ChenGuo,CaiZhiduan,ZengYanru,JiangFuneng.

DepartmentofSurgicalOncology,DongguanMunicipalPeople’sHospital,SouthernMedicalUniversity,Dongguan523059,China

【Abstract】ObjectiveTo compare the expression levels of NEK2 between the benign prostate epithelial cells and prostate cancer cells, and evaluate the effect of NEK2 upon prostate cancer cell proliferation. MethodsThe expression levels of NEK2 in benign prostate cancer PrEC cell line and prostate cancer PC3, LNCaP and DU145 cell lines were measured by qRT-PCR. The expression of endogenous NEK2 in the LNCaP cell line was inhibited with shRNA. CCK8 assay and subcutaneous implantation of xenografts were utilized to assess the proliferation of LNCaP cells. ResultsThe expression levels of NEK2 in the PC3, LNCaP and DU145 were significantly higher compared with that in the PrEC (all P<0.01). By using shRNA, the expression of NEK2 was down-regulated in the LNCaP cells at both mRNA and protein levels (both P<0.01). Cell proliferation assayshowed that the LNCaP cells treated with NEK2 shRNA yielded lower proliferation rate compared with those LNCaP cell treated with non-sense sequence(P<0.01). In vivo experiment revealed smaller grafted tumors and lower expression of NEK2 protein in mice injected with shNEK2 LNCaP cell compared with those injected with scrambled LNCaP cell. ConclusionsOverexpression of NEK2 can promote the proliferation of prostate cancer cells. NEK2 has the potential to serve as a biomarker for prostate cancer therapy.

【Key words】Prostate cancer; NEK2; Cell proliferation

(收稿日期：2015-10-24)

Corresponding author, Jiang Funeng, E-mail:jiangfuneng@qq.com

通訊作者，江福能，E-mail：jiangfuneng@qq.com

基金項(xiàng)目：廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014A030310088)；廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目(20141A011007)；廣東省臨床分子醫(yī)學(xué)及分子診斷實(shí)驗(yàn)室重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2016.04.005

·基礎(chǔ)研究論著·