495例血小板相關(guān)免疫球蛋白檢測(cè)結(jié)果的臨床資料分析

甘慧泉,歐陽(yáng)維富,劉惠蘭,林　婷,羅燕飛,冼璐樺,周茂華

(廣東省人民醫(yī)院、廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 病理醫(yī)學(xué)部 檢驗(yàn)科，廣東 廣州510000)

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495例血小板相關(guān)免疫球蛋白檢測(cè)結(jié)果的臨床資料分析

甘慧泉,歐陽(yáng)維富,劉惠蘭,林婷,羅燕飛,冼璐樺,周茂華*

(廣東省人民醫(yī)院、廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 病理醫(yī)學(xué)部 檢驗(yàn)科，廣東 廣州510000)

血小板自身抗體可導(dǎo)致血小板破壞增加或生成障礙，導(dǎo)致患者發(fā)生出血性疾病。血小板自身抗體可分為特異性糖蛋白自身抗體、藥物相關(guān)自身抗體、抗同種血小板抗體和血小板相關(guān)免疫球蛋白(platelet associated immunoglobulin，PAIg)等。PAIg包括PAIgG、PAIgM、PAIgA[1]。流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)PAIg具有快速、靈敏、 重復(fù)性好的特點(diǎn)。本文就495例用FCM檢測(cè)的PAIg結(jié)果的相關(guān)資料進(jìn)行分析。

1對(duì)象與方法

1.1對(duì)象2012年1月至2013年9月來(lái)廣東省人民醫(yī)院就診，行PAIg檢測(cè)的門診及住院病人495例，其中男245例，女250例。年齡0-85歲，平均年齡37±29歲。

1.2儀器與試劑

1.2.1主要儀器FACScalibur 流式細(xì)胞儀(購(gòu)自美國(guó)BD公司)。

1.2.2主要試劑PE-CD41(購(gòu)自美國(guó)BECKMAN COULTER公司)；Goat F(ab，)2 IgG-FITC、 Goat F(ab，)2 Anti-human IgG-FITC、 Goat F(ab，)2 Anti-human IgM-FITC鼠IgG、Goat F(ab，)2 Anti-human IgA-FITC(均為美國(guó)Southern Biotech 公司產(chǎn)品)。

1.3方法

1.3.1樣本制備留取清晨空腹靜脈血3 mL于乙二胺四乙酸( EDTA-K2 )抗凝管中,用150 g 離心力離心5 min,分離富含血小板血漿(PRP),取PRP 50-200 μL(根據(jù)血小板多少取適量，調(diào)整細(xì)胞濃度為106/mL)，置于管A中，加入2 mL 含小牛血清磷酸鹽緩沖液(PBS-BSA)2 100 g離心5 min，洗3次。去上清液后，加 400 μL PBS-BSA重懸。在管 A 中加入20 μL CD41-PE，充分混勻。另取4支試管，分別加入Goat F(ab，)2 IgG-FITC、Goat F(ab，)2 Anti-human IgG-FITC、Goat F(ab，)2 Anti-human IgM-FITC鼠IgG、Goat F(ab，)2 Anti-human IgA-FITC 4 種單抗試劑 10 μL，再在各試管中分別加入管A中的血小板懸液 100 μL，室溫避光孵育15 min。再加入 PBS-BSA 2 mL，2100g 離心5 min洗滌1次，去上清后加0.5 mL固定液(4%甲醛溶液)。

1.3.2流式分析根據(jù) CD41/SSC 設(shè)置血小板門，以同型對(duì)照管調(diào)整電壓及熒光補(bǔ)償，檢測(cè)標(biāo)本 PAIgG、PAIgM、PAIgA 陽(yáng)性百分率。PAIgG>2.0%，PAIgA>2.0%，PAIgM>3.5%，該項(xiàng)結(jié)果即判為陽(yáng)性。

1.4統(tǒng)計(jì)與分析采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料用率表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05 表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2結(jié)果

PAIg檢測(cè)，PAIgG、PAIgM、PAIgA三項(xiàng)中只要有一項(xiàng)結(jié)果陽(yáng)性，則計(jì)PAIg結(jié)果為陽(yáng)性。

2.1性別495例PAIg檢測(cè)，男女檢測(cè)結(jié)果見表1。Pearson Chi-Square檢驗(yàn)，χ2=0.41，P=0.52。PAIg陽(yáng)性率在性別上沒有差異。

2.2年齡年齡分組檢測(cè)結(jié)果見表2。Pearson Chi-Square檢驗(yàn)，χ2=6.99，P=0.07。PAIg陽(yáng)性率在不同年齡分組之間沒有差異。

表1495例患者PAIg檢測(cè)結(jié)果

性別PAIg陽(yáng)性PAIg陰性例數(shù)男101144245女96154250共計(jì)197298495

表2495例不同年齡組患者PAIg檢測(cè)結(jié)果

年齡(歲)PAIg陽(yáng)性PAIg陰性例數(shù)0-16(少年組)688014817-30(青年組)28639131-59(中年組)536912260歲-85(老年組)4886134共計(jì)197298495

2.3不同抗體197例PAIg陽(yáng)性標(biāo)本中，有178例次PAIgM陽(yáng)性(90.36%)、89例次PAIgG陽(yáng)性(45.18%)，19例次PAIgA陽(yáng)性(9.64%)。PAIgM的檢出率明顯高于另外兩種抗體。

2.4其他相關(guān)資料495例患者檢測(cè)PAIg的同時(shí)，還有部分病例進(jìn)行了血清降鈣素原(PCT)、直接/間接抗人球蛋白(coombs-D/coombs-I)和幽門螺旋桿菌(HP)的檢測(cè)，結(jié)果整理如下。2.4.1PCT183例患者同時(shí)檢測(cè)PAIg和PCT，結(jié)果見表3。PCT>0.05 ng/ml為陽(yáng)性界值。Pearson Chi-Square檢驗(yàn)，χ2=11.38，P=0.00。PAIg陽(yáng)性率在不同的PCT結(jié)果之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表3183例同時(shí)檢測(cè)PAIg和PCT患者的結(jié)果

PCT>0.05ng/mlPCT≤0.05ng/mlPAIg陽(yáng)性5925PAIg陰性4554共計(jì)10479

2.4.2Coombs-D 198例患者同時(shí)檢測(cè)PAIg和coombs-D，結(jié)果見表4。Pearson Chi-Square檢驗(yàn)，χ2=8.41，P=0.00。PAIg陽(yáng)性率在不同的coombs-D結(jié)果之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表4198例同時(shí)檢測(cè)PAIg和coombs-D患者的結(jié)果

coombs-D陽(yáng)性coombs-D陰性PAIg陽(yáng)性4145PAIg陰性3181共計(jì)72126

2.4.3Coombs-I 196例患者同時(shí)檢測(cè)PAIg和coombs-I，結(jié)果見表5。Pearson Chi-Square檢驗(yàn)，χ2=0.11，P=0.74。PAIg陽(yáng)性率在不同的coombs-I結(jié)果之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表5196例同時(shí)檢測(cè)PAIg和coombs-I患者的結(jié)果

coombs-I陽(yáng)性coombs-I陰性PAIg陽(yáng)性482PAIg陰性3107共計(jì)7189

2.4.4HP47例患者同時(shí)檢測(cè)PAIg和HP，結(jié)果見表6。Pearson Chi-Square檢驗(yàn)，χ2=1.40，P=0.24。PAIg陽(yáng)性率在不同的 HP結(jié)果之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表647例同時(shí)檢測(cè)PAIg和HP患者的結(jié)果

HP+HP-PAIg陽(yáng)性1011PAIg陰性818共計(jì)1829

3討論

PAIg可能來(lái)源于機(jī)體免疫系統(tǒng)針對(duì)血小板骨架蛋白或膜糖蛋白產(chǎn)生的自身抗體而結(jié)合在血小板膜上，也可能是血清中抗體分子或抗原抗體復(fù)合物在血小板表面的粘附或覆蓋。此外，血小板激活時(shí)，α顆?？舍尫臝gG分子至血小板表面。因此PAIg測(cè)定的特異性并不高，但具有較高的靈敏度[2]。

本文就FCM檢測(cè)PAIg的結(jié)果，結(jié)合相關(guān)的其他臨床資料分析顯示，年齡、性別與PAIg陽(yáng)性結(jié)果沒有相關(guān)性。

PCT是近年研究較多的用于監(jiān)測(cè)感染的指標(biāo)，尤其對(duì)診斷細(xì)菌性感染有著較高的特異性及敏感性。正常人PCT在血清中含量<0.05 ng/ml(熒光定量法)，而當(dāng)機(jī)體受到細(xì)菌感染后PCT含量明顯升高，在感染得到控制后，PCT可迅速降至正常。而在病毒感染，自身免疫性疾病及腫瘤等疾病時(shí)PCT水平可輕微升高或維持正常[3，4]。本文資料統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，PCT陽(yáng)性與否和PAIg陽(yáng)性結(jié)果之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。即細(xì)菌感染患者更易PAIg陽(yáng)性。推測(cè)其機(jī)制可能是：某些菌體成分與血小板抗原成分交叉，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生抗血小板抗體；細(xì)菌產(chǎn)生的毒素直接或間接激活了免疫系統(tǒng)，打破了機(jī)體的免疫平衡狀態(tài)。細(xì)菌感染誘導(dǎo)血小板表面某些抗原改變，被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別，產(chǎn)生相關(guān)抗體等。這也提示，在診斷患者血小板減少的病因時(shí)，應(yīng)該排除細(xì)菌感染的影響。

Coombs-I是檢查血清中游離的不完全抗體。本室采用的FCM法檢測(cè)PAIg時(shí)，中間有3次洗滌PRP的步驟，即使標(biāo)本coombs-I陽(yáng)性，血漿中游離的不完全抗體也被洗掉了。所以理論上Coombs-I結(jié)果不會(huì)影響PAIg，本文資料統(tǒng)計(jì)的結(jié)果也印證了這一點(diǎn)。Coombs-D是檢查被檢紅細(xì)胞上有無(wú)不完全抗體。其結(jié)果陽(yáng)性是由于患者自身紅細(xì)胞被致敏或有異常蛋白附著所致。本文統(tǒng)計(jì)資料結(jié)果顯示，coombs-D陽(yáng)性結(jié)果與PAIg結(jié)果之間有相關(guān)性，說(shuō)明致敏紅細(xì)胞的不完全抗體或異常蛋白也可能會(huì)粘附或覆蓋在血小板表面。紅細(xì)胞致敏的患者主要見于：自身免疫性貧血；輸血史；藥物誘發(fā)的免疫性溶血性貧血；自身免疫性疾病等。提示臨床，治療coombs-D陽(yáng)性患者血小板減少時(shí)，治本還是關(guān)鍵。

特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)主要是由于抗血小板自身抗體引起的血小板減少，并導(dǎo)致出血傾向的一種自身免疫性疾病。Gasbarrini等[5]于1998年提出，幽門螺桿菌(HP)感染與ITP的發(fā)病有關(guān)。國(guó)內(nèi)饒燕飛等[6]，李霞等[7]的報(bào)道也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。目前，國(guó)內(nèi)外多數(shù)研究表明，根除HP后部分ITP患者的血小板計(jì)數(shù)明顯增多，并伴隨血清血小板相關(guān)抗體水平的下降，提示HP可能是部分ITP的致病因子之一。但也有報(bào)道認(rèn)為HP感染與ITP發(fā)病的關(guān)系仍有爭(zhēng)論[8，9]。本文結(jié)果顯示，HP感染與否與PAIg之間沒有關(guān)聯(lián)?？紤]原因有兩點(diǎn)：①統(tǒng)計(jì)例數(shù)少，本文僅47例患者做HP檢測(cè)；②感染HP的毒力亞株不同。臨床HP菌株分為高毒力株(表達(dá)CagA蛋白)和低毒力株(不表達(dá)CagA蛋白)。Takahashi等[10]認(rèn)為，HP的CagA蛋白具有和人類血小板抗原相同或相似的抗原表位，感染HP后機(jī)體免疫應(yīng)答通過(guò)分子模擬產(chǎn)生抗血小板自身抗體從而引發(fā)ITP。提示由于HP菌株的毒力亞株不同結(jié)果相異的可能性。

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(收稿日期：2014-12-10)

作者簡(jiǎn)介：甘慧泉(1978-)，女，湖北黃石人，主管技師，碩士，主要從事流式細(xì)胞術(shù)在臨床血液病方面的診斷工作。

*通訊作者

文章編號(hào)：1007-4287(2016)04-0662-03