黃酒釀造后酵工藝對氨基酸態(tài)氮生成的影響

潘慧青，曹　鈺*，石慧媛，陸　健，3，謝廣發(fā)（1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫11；.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫11；3.糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇無錫11；.中國紹興黃酒集團(tuán)有限公司國家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江紹興31000）

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黃酒釀造后酵工藝對氨基酸態(tài)氮生成的影響

潘慧青1，2，曹鈺*1，2，石慧媛2，陸健1，2，3，謝廣發(fā)4
（1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122；3.糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇無錫214122；4.中國紹興黃酒集團(tuán)有限公司國家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江紹興312000）

摘要：黃酒的氨基酸態(tài)氮是用來反映其中的氨基酸及小肽總體水平的重要指標(biāo)，其含量的高低直接影響黃酒的質(zhì)量等級和整體風(fēng)味。作者針對黃酒后酵階段工藝條件進(jìn)行研究，通過對發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)、氨基酸態(tài)氮、活酵母數(shù)的動態(tài)變化以及酒體的理化指標(biāo)和氨基酸組成分析，考察后酵時(shí)間和溫度對氨基酸態(tài)氮生成的影響。結(jié)果表明，氨基酸態(tài)氮主要產(chǎn)生在黃酒后酵階段，后發(fā)酵時(shí)間從14 d延長至17、20、23 d，氨基酸態(tài)氮的含量分別提高24.7%、31.7%和37.6%，酵母自溶過程對后酵末期氨基酸態(tài)氮的貢獻(xiàn)顯著。升高后酵溫度有利于氨基酸態(tài)氮的形成，后酵溫度對氨基酸態(tài)氮的形成同時(shí)受到蛋白質(zhì)降解酶活性和酵母自溶兩方面的綜合影響。研究結(jié)果顯示，氨基酸是氨基酸態(tài)氮的主要組成，其含氮量占氨基酸態(tài)氮60%以上。

關(guān)鍵詞：氨基酸態(tài)氮；后酵時(shí)間；后酵溫度；酵母自溶

黃酒是我國特有的且歷史最悠久的傳統(tǒng)酒種，是世界3大古酒之一。黃酒中氨基酸含量不僅是酒中之最，而且種類多達(dá)21種，其中含有8種人體必需氨基酸。氨基酸在黃酒釀造過程中不僅為微生物提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，也是很多風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)。此外氨基酸賦予黃酒豐富的味覺層次，使其具有鮮美醇和、濃香爽口的特征。氨基酸態(tài)氮可大致反應(yīng)氨基酸及小肽的總體水平，并且測定方法簡單、快速，因此多年來黃酒行業(yè)采用這一重要指標(biāo)評價(jià)黃酒質(zhì)量等級。國標(biāo)中規(guī)定了不同成品黃酒類型中氨基酸態(tài)氮的最低限量，若氨基酸態(tài)氮的含量未達(dá)標(biāo)，就會直接影響黃酒的質(zhì)量等級以及黃酒特有的口感，將會給黃酒企業(yè)帶來一定的損失。

目前對黃酒中氨基酸態(tài)氮的相關(guān)研究還比較少，只有少數(shù)文獻(xiàn)從經(jīng)驗(yàn)層面總結(jié)了影響氨基酸態(tài)氮的因素及提高含量的途徑[1-2]，但均未有相關(guān)的實(shí)驗(yàn)論證。此外在一些其他研究報(bào)道中提及到黃酒中氨基酸態(tài)氮的變化，如增加麥曲的用量或添加酸性蛋白酶都能提高氨基酸態(tài)氮的含量[3-6]。這可能由于黃酒釀造本身的復(fù)雜，集霉菌、酵母、細(xì)菌混合為一體的半固體發(fā)酵，所以尚未有針對黃酒中氨基酸態(tài)氮形成及影響機(jī)理的研究報(bào)道。

針對黃酒后酵階段工藝條件進(jìn)行研究，通過對發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)、氨基酸態(tài)氮、活酵母數(shù)的動態(tài)變化以及酒體的理化指標(biāo)和氨基酸組成分析，考察后酵時(shí)間和溫度對氨基酸態(tài)氮生成的影響，并嘗試分析其影響機(jī)理。研究工藝條件對黃酒中氨基酸態(tài)氮生成的影響，有助于促進(jìn)黃酒的優(yōu)質(zhì)化發(fā)展。

1.1材料與儀器

釀造酵母N85：浙江古越龍山紹興酒股份有限公司提供；糯米：無錫市華潤萬家超市；生、熟麥曲：由浙江古越龍山紹興酒股份有限公司提供；Tricine和蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（相對分子質(zhì)量4 100～66 000）：上海生工生物工程公司；乙腈、甲醇：色譜純；其他試劑均為分析純。

UV-2100紫外分光光度計(jì)：Unic公司；垂直電泳儀：美國Bio-Rad公司；JD-801凝膠成像儀：江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司；Agilent 1100型氨基酸專用高效液相色譜儀：美國安捷倫公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1酵母活化及擴(kuò)培用米汁培養(yǎng)基活化斜面保藏的酵母菌株，以10%的接種體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行三級擴(kuò)培。

1.2.2釀酒實(shí)驗(yàn)采用3 L的三角瓶發(fā)酵600 g糯米，釀造工藝流程見圖1。

1　材料與方法

圖1　黃酒釀造工藝流程Fig. 1 Diagram of Chinese rice wine brewing

1.2.3樣品收集與處理分別在第1、2、3、4、7、10、13、17、21天取樣，6 000 r/min離心10 min，上清液用濾紙過濾，測定各個(gè)指標(biāo)或-20℃儲存待測。

1.2.4樣品測定總糖、總酸、酒精度、非糖固形物和氨基酸態(tài)氮的測定：參照國家標(biāo)準(zhǔn)方法（GB/T 13662-2008）；上清液蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測定：采用Bradford方法[7]；活酵母數(shù)：采用YPD平板計(jì)數(shù)法；上清液Tricine-SDS-PAGE：參照曹佐武[8]改良的實(shí)驗(yàn)方法；游離氨基酸的測定：采用OPA/FMOC柱前衍生法[9]。

2　結(jié)果與分析

2.1后酵時(shí)間對氨基酸態(tài)氮的影響

黃酒釀造中前酵階段采用28℃發(fā)酵4 d，進(jìn)入后酵階段，后酵溫度為15℃，設(shè)定繼續(xù)進(jìn)行14、17、20、23 d的后發(fā)酵，即總發(fā)酵時(shí)間分別為18、21、24、27 d，考察延長后酵時(shí)間對氨基酸態(tài)氮的影響。發(fā)酵過程中原料的米蛋白和麥曲中的蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶、肽酶逐步降解，其中一部分被微生物吸收利用合成菌體蛋白，一部分轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，剩余的殘留在醪液中，因此醪液中酵母的數(shù)量和蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度與氨基酸態(tài)氮有著密不可分的關(guān)系。

圖2顯示，前酵階段醪液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度快速下降，由于生、熟麥曲皆含有米曲霉分泌的酸性蛋白酶和中性蛋白酶，且熟麥曲中還含有二肽酶和氨肽酶[10]，前酵溫度利于酶活作用，為蛋白質(zhì)的分解提供了有利的條件。酵母數(shù)量和氨基酸態(tài)氮的含量都呈現(xiàn)直線上升的趨勢，酵母的活菌數(shù)量達(dá)到最高值為1.24億/mL。進(jìn)入后酵階段，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度下降的速率明顯減緩，分析認(rèn)為既與較低的后酵溫度影響酶活有關(guān)，還與蛋白酶或肽酶的酶活經(jīng)過較長時(shí)間以及醪液中的較高乙醇濃度和低pH等因素的影響后可能出現(xiàn)下降，因此分解蛋白質(zhì)的能力也逐步減弱。進(jìn)入后酵階段后，酵母的繁殖速率小于死亡速率，活菌數(shù)量呈下降的趨勢，并且在所考察的后酵末期18～27 d中死亡率逐步增大。在整個(gè)后酵階段醪液中氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度不斷升高，且增長速率逐步增加，尤其是在后酵末期出現(xiàn)快速增長。文獻(xiàn)[11-12]報(bào)道酵母自溶會釋放出蛋白酶A、多肽和氨基酸，因此醪液中的蛋白質(zhì)極有可能在麥曲中的蛋白酶和酵母釋放的酸性蛋白酶雙重作用下被分解，酵母的代謝活動減弱，利用的氨基酸速率也會減慢，并且酵母自溶會釋放氨基酸，使得醪液中氨基酸態(tài)氮呈現(xiàn)上升的趨勢，這與趙梅[13]的發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量變化趨勢相同。圖2顯示，隨著后酵末期時(shí)間的延長，氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度越來越高，酵母活細(xì)胞數(shù)量和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度越來越低。

圖2　發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮、蛋白質(zhì)及酵母數(shù)量的變化Fig. 2 Changes of amino acid nitrogen, proteins and the amounts of yeast during the brewing course

發(fā)酵醪上清液的蛋白質(zhì)Tricine-SDS-PAGE結(jié)果可直觀反映出黃酒發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)的降解，結(jié)果見圖3。

圖3　發(fā)酵過程中醪液上清液的Tricine-SDS-PAGE圖譜Fig. 3 Tricine-SDS-PAGE electrophoresis of the samples during the brewing process

圖3醪液中可溶性蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量均小于66 000，前酵1～2 d，蛋白質(zhì)條帶較多且集中在35 000以下，條帶a（Mw約為60 000）略微減少。結(jié)合樣品上樣前所測定的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，由凝膠成像軟件分析得知，發(fā)酵第2天條帶a含量減少了13.6%，其余條帶變化不明顯；而在前酵2～3 d，蛋白質(zhì)降解最為顯著，這與圖2中醪液蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度在該階段減少量相一致。從各個(gè)條帶的變化來看，Mw約為35 000的條帶b降解最多，質(zhì)量濃度降低90%以上。其他條帶的降解量分別為：條帶a減少約63.9%，條帶c（Mw約為27 000）減少70%，條帶d （Mw約為23 000）減少47.5%。發(fā)酵第3天后，圖譜上的蛋白質(zhì)條帶變化不大，反映出蛋白質(zhì)的降解主要發(fā)生在前酵階段。此外條帶c、e、和f始終存在于發(fā)酵醪液中直至發(fā)酵結(jié)束，未能被降完全解，這些蛋白質(zhì)很可能與黃酒的沉淀有關(guān)。

測定不同發(fā)酵時(shí)間結(jié)束時(shí)的黃酒理化指標(biāo)，結(jié)果見表1。隨著發(fā)酵時(shí)間延長，酒精度由15.5%提高到19.3%，總糖質(zhì)量濃度顯著降低?？偹豳|(zhì)量濃度略有升高，酸度常作為黃酒發(fā)酵是否正常的衡量指標(biāo)，干型酒規(guī)定總酸質(zhì)量濃度在4.0～7.0 g/L，結(jié)果顯示此次發(fā)酵正常。酵母量隨發(fā)酵時(shí)間延長而減少，與前酵末期酵母數(shù)量最多的第4天相比，進(jìn)入后酵階段，隨著發(fā)酵時(shí)間延長，酵母死亡率分別為20.2%、30.6%、35.5%和39.5%，變化幅度逐漸減小。氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度隨時(shí)間延長呈遞增趨勢，分別增加了24.7%、31.8%和37.6%，但增加幅度也逐漸減小，與酵母數(shù)量變化幅度相似，顯示出后酵末期氨基酸態(tài)氮的增加和酵母自溶關(guān)系密切，適當(dāng)延長發(fā)酵時(shí)間能在一定程度上提高氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度。

表1　發(fā)酵結(jié)束時(shí)黃酒的理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical indexes of Chinese rice wine at different brewing times

國標(biāo)中采用甲醛滴定法測定氨基酸態(tài)氮，由其測定原理可知其值包含氨基酸以及二肽、三肽等小分子肽所含的氮總和。用OPA/FMOC柱前衍生法測定不同后酵時(shí)間發(fā)酵醪液中的游離氨基酸含量，并計(jì)算總含氮量，結(jié)果見表2。可以看出，氨基酸是氨基酸態(tài)氮的主要成分，占氨基酸態(tài)氮的60%以上。氨基酸的總量隨發(fā)酵時(shí)間的延長逐漸升高，質(zhì)量濃度一直升高且增加量最大的為天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸，與酵母自溶釋放的氨基酸中質(zhì)量濃度較高的氨基酸基本相同[14-17]，說明后酵階段酵母自溶對黃酒中氨基酸態(tài)氮的增加有很大貢獻(xiàn)。然而氨基酸含氮量占氨基酸態(tài)氮的百分比在發(fā)酵21 d，死亡率達(dá)到30%以后基本保持不變，反映出醪液中的小肽含量在穩(wěn)步增加。文獻(xiàn)[18]報(bào)道，酵母自溶是一個(gè)緩慢過程，先釋放的是相對分子質(zhì)量大于10 000的蛋白質(zhì)，隨后蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度降低，小分子肽數(shù)量增加。此外酵母自溶過程中釋放出的內(nèi)源性蛋白酶也可能降解發(fā)酵體系中的蛋白質(zhì)，促進(jìn)氨基酸態(tài)氮含量的增加，這還有待實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

表2　發(fā)酵結(jié)束時(shí)氨基酸的質(zhì)量濃度Table 2 Contents of free amino acid at end of brewing

2.2后酵溫度對氨基酸態(tài)氮的影響

黃酒釀造是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的發(fā)酵體系，前酵階段適合各種酶作用，小麥、大米中的淀粉被糖化，蛋白質(zhì)被降解，使得酵母大量繁殖生長，消耗較多的糖分和氨基酸，產(chǎn)生大量的酒精及風(fēng)味物質(zhì)，而后酵是一個(gè)低溫長時(shí)間的發(fā)酵過程，酵母繼續(xù)進(jìn)行代謝，有利于各種風(fēng)味物質(zhì)的形成。由2.1可知，氨基酸態(tài)氮主要在后酵階段產(chǎn)生，同蛋白質(zhì)降解及酵母自溶存在一定關(guān)系。為研究后酵溫度對蛋白質(zhì)降解和酵母自溶的可能影響，設(shè)置不同后酵溫度，分別為13、15、17℃，后發(fā)酵17 d，前酵均采用28℃發(fā)酵4 d，即總發(fā)酵時(shí)間為21 d，考察后酵溫度變化對氨基酸態(tài)氮生成的影響。

從圖4（a）可看出，后酵溫度不同蛋白質(zhì)的降低速率也不同，溫度越高，降低速率越快，反映出后酵溫度對蛋白質(zhì)降解酶的酶活是有影響的，溫度越高越有利于蛋白質(zhì)的分解。整個(gè)發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮的總體變化趨勢與2.1研究結(jié)果一致，主要在后酵期間產(chǎn)生，且隨著后酵溫度的升高，氨基酸態(tài)氮含量分別增加8.5%和18.3%。但后酵溫度不同，氨基酸態(tài)氮增加的幅度有差異，13℃后酵溫度氨基酸態(tài)氮的增加速率明顯比15、17℃的慢，這與圖4A蛋白質(zhì)在后酵期間的降解速率緩慢相對應(yīng)。

圖4　不同后酵溫度發(fā)酵中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（A）、酵母數(shù)量（B）及氨基酸態(tài)氮（C）的變化曲線Fig. 4 Changes of proteins（A），the amounts of yeast cells （B）and amino acid nitrogen（C）under different post-fermentation temperature

從表3中酒精、總糖含量及酵母數(shù)可以看出，后酵溫度越高，微生物的代謝活動越強(qiáng)。后酵17℃比13℃的酒精度增加25.8%，酵母數(shù)量是13℃的1.2倍。由圖4（b）可知，進(jìn)入后酵階段酵母數(shù)量均呈現(xiàn)下降趨勢，后酵溫度13、15、17℃的酵母死亡率分別為26.4%、12.1%和10.9%。溫度越低，酵母死亡率越高，可能與該釀酒酵母菌株耐低溫能力有關(guān)。

表3　不同后酵溫度發(fā)酵結(jié)束時(shí)黃酒的理化指標(biāo)Table 3 Physicochemical indexes of Chinese rice wine under different post-fermentation temperature

綜合上述結(jié)果可知，雖然相對較低的后酵溫度導(dǎo)致蛋白質(zhì)的降解緩慢，但同時(shí)由于酵母較差的低溫耐受性導(dǎo)致的較高死亡率有利于自溶釋放氨基酸態(tài)氮，暗示在后酵階段氨基氮的形成同時(shí)受到蛋白質(zhì)降解酶活性和酵母自溶兩方面的綜合影響。

表4顯示，不同后酵溫度發(fā)酵結(jié)束時(shí)醪液中的游離氨基酸含量及氨基酸含氮量占氨基酸態(tài)氮的比值。氨基酸是氨基酸態(tài)氮的主要成分，其總量隨著后酵溫度升高而升高，且氨基酸含氮量占氨基酸態(tài)氮的比值也呈增大趨勢，反映出在較高的后酵溫度下醪液中小肽的比例下降，這一趨勢也在一定程度上暗示了蛋白質(zhì)降解酶對氨基酸態(tài)氮形成的影響。

表4　不同后酵溫度下發(fā)酵結(jié)束時(shí)氨基酸的質(zhì)量濃度Table 4　 Contents of free amino acid at end of brewing with different post-fermentation temperature

3　結(jié)語

黃酒的氨基酸態(tài)氮是用來反映其中的氨基酸及小肽總體水平的重要指標(biāo)，其含量的高低直接影響黃酒的質(zhì)量等級和整體風(fēng)味。作者針對黃酒后酵階段工藝條件進(jìn)行研究，通過對發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)、氨基酸態(tài)氮、活酵母數(shù)的動態(tài)變化以及酒體的理化指標(biāo)和氨基酸組成分析，考察后酵時(shí)間和溫度對氨基酸態(tài)氮生成的影響。

結(jié)果表明，氨基酸態(tài)氮主要產(chǎn)生在黃酒后酵階段，后發(fā)酵時(shí)間從14 d延長至17、20、23 d，氨基酸態(tài)氮的含量分別提高24.7%、31.7%和37.6%，酵母自溶對后酵末期氨基酸態(tài)氮的貢獻(xiàn)顯著。升高后酵溫度有利于氨基酸態(tài)氮的形成，后酵溫度對氨基酸態(tài)氮的形成同時(shí)受到蛋白質(zhì)降解酶活性和酵母自溶兩方面的綜合影響。不過在發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮的形成及變化還與高級醇等多種風(fēng)味物質(zhì)的代謝密切相關(guān)，并非越高越好，需要將它們的形成綜合起來考量。此外，研究結(jié)果顯示，氨基酸是氨基酸態(tài)氮的主要組成，氨基酸含氮量占氨基酸態(tài)氮的比例60%以上，尚需進(jìn)一步對其中的小肽類物質(zhì)開展研究，以深入理解黃酒的營養(yǎng)和功效，促進(jìn)黃酒的優(yōu)質(zhì)化發(fā)展。

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Effect of Post-Fermentation Technology on Amino Acid Nitrogen Generating during Chinese Rice Wine Brewing

PAN Huiqing1，2，CAO Yu*1，2，SHI Huiyuan2，LU Jian1，2，3，XIE Guangfa4
（1. Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2. School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；4. National Engineering Research Center for Chinese Rice Wine，China Shaoxing Rice Wine Group Co.，Ltd. Shaoxing 312000，China）

Abstract：Amino acid nitrogen（AAN）is an important indicator representing the overall level of amino acids and low molecular weight peptides in the Chinese rice wine，which content can affect the quality and flavor of wine. The influence of post-fermentation process parameters to AAN generating were discussed in this work，which included the post-fermentation time and post-fermentation temperature by tracing the dynamic changes of protein content，AAN content and amounts of viable yeast cells，Tricine analysis by SDS-PAGE，and the physicochemical indexes andbook=145,ebook=38amino acid composition of fermentation broth. The results showed that the post-fermentation was the main period for AAN producing. The content of AAN in draft rice wine was increased 24.7%，31.7% and 37.6%，respectively when post-fermentation time prolonged from 14 days to 17 days，20 days and 23 days. Yeast autolysis process offered a significant contribution to AAN at end of post-fermentation. Meanwhile it had positive effect on AAN formation when post-fermentation temperature raised at range of 13℃to 17℃. The results implied that AAN was influenced by both activities of protein degradation enzymes and the degree of yeast autolysis when post-fermentation temperature was changed. Furthermore，the work indicated that amino acids are the main composition of nitrogen compounds，which nitrogen content accounted for more than 60% of AAN. This study is aimed to understand the effect of process conditions on the AAN generating，which will benefit the quality improvement of Chinese rice wine.

Keywords：amino acid nitrogen，post-fermentation temperature，post-fermentation time，yeast autolysis

*通信作者：曹鈺（1971—），女，江蘇泰興人，工學(xué)碩士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事傳統(tǒng)釀造的機(jī)理及相關(guān)微生物和酶類的研究。E-mail：tsaoy5@jiangnan.edu.cn

基金項(xiàng)目：國家973計(jì)劃項(xiàng)目（2013CB733602）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目；江南大學(xué)糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（KLCCB-KF201407）。

收稿日期：2014-08-31

中圖分類號：Q 815

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1673—1689（2016）02—0144—07