靶向survivin基因的小干擾RNA對食管癌細(xì)胞Eca-109 化療敏感性的影響

牛朝霞，彭蕤蕤，陳　潔，秦紫芳，裴　瑞

牛朝霞，彭蕤蕤，陳　潔，秦紫芳摘要：目的　利用RNAi (RNA interference, RNAi) 技術(shù)抑制食管癌Eca-109細(xì)胞survivin基因表達(dá)，觀察survivin基因沉默后對Eca-109細(xì)胞化療敏感性的影響。方法　構(gòu)建靶向survivin基因特定序列的小干擾RNA(small interference RNA, siRNA)真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染Eca-109細(xì)胞，篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的survivin干擾組細(xì)胞Eca-109 /si-survivin，同時(shí)設(shè)轉(zhuǎn)染無關(guān)干擾質(zhì)粒的Eca-109細(xì)胞為陰性對照組，未轉(zhuǎn)染的Eca-109細(xì)胞為空白對照組；通過Western Blot法檢測干擾前后survivin基因沉默抑制效果；隨后將各組細(xì)胞與不同濃度的氟尿嘧啶(5-Fu)作用，MTT法檢測各組細(xì)胞對5-Fu的半數(shù)抑制濃度(IC50)，流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果　干擾組Eca-109 /si-survivin細(xì)胞survivin蛋白表達(dá)水平(18.75±3.12)較陰性對照組Eca-109 /si-control(44.17±3.15)及空白對照組Eca-109 (46.20±2.62)明顯下調(diào)(P<0.05)；聯(lián)合應(yīng)用5-Fu的Eca-109 /si-survivin干擾組細(xì)胞IC50為(18.75±1.53)mg·L-1，顯著低于空白對照組(39.65±1.75)mg·L-1和陰性對照組(38.95±1.34)mg·L-1，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合應(yīng)用5-Fu的Eca-109 /si-survivin干擾組細(xì)胞凋亡率為(37.35±1.52)%，明顯高于空白對照組(11.26±1.21)%和陰性對照組(12.34±1.32)%，差異具有顯著性(P<0. 05)。 結(jié)論　靶向survivin的siRNA能特異性沉默survivin基因表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并增強(qiáng)人食管癌Eca-109細(xì)胞對5-Fu的化療敏感性。

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靶向survivin基因的小干擾RNA對食管癌細(xì)胞Eca-109 化療敏感性的影響

牛朝霞，彭蕤蕤，陳潔，秦紫芳，裴瑞

牛朝霞，彭蕤蕤，陳潔，秦紫芳摘要：目的利用RNAi (RNA interference, RNAi) 技術(shù)抑制食管癌Eca-109細(xì)胞survivin基因表達(dá)，觀察survivin基因沉默后對Eca-109細(xì)胞化療敏感性的影響。方法構(gòu)建靶向survivin基因特定序列的小干擾RNA(small interference RNA, siRNA)真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染Eca-109細(xì)胞，篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的survivin干擾組細(xì)胞Eca-109 /si-survivin，同時(shí)設(shè)轉(zhuǎn)染無關(guān)干擾質(zhì)粒的Eca-109細(xì)胞為陰性對照組，未轉(zhuǎn)染的Eca-109細(xì)胞為空白對照組；通過Western Blot法檢測干擾前后survivin基因沉默抑制效果；隨后將各組細(xì)胞與不同濃度的氟尿嘧啶(5-Fu)作用，MTT法檢測各組細(xì)胞對5-Fu的半數(shù)抑制濃度(IC50)，流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果干擾組Eca-109 /si-survivin細(xì)胞survivin蛋白表達(dá)水平(18.75±3.12)較陰性對照組Eca-109 /si-control(44.17±3.15)及空白對照組Eca-109 (46.20±2.62)明顯下調(diào)(P<0.05)；聯(lián)合應(yīng)用5-Fu的Eca-109 /si-survivin干擾組細(xì)胞IC50為(18.75±1.53)mg·L-1，顯著低于空白對照組(39.65±1.75)mg·L-1和陰性對照組(38.95±1.34)mg·L-1，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合應(yīng)用5-Fu的Eca-109 /si-survivin干擾組細(xì)胞凋亡率為(37.35±1.52)%，明顯高于空白對照組(11.26±1.21)%和陰性對照組(12.34±1.32)%，差異具有顯著性(P<0. 05)。 結(jié)論靶向survivin的siRNA能特異性沉默survivin基因表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并增強(qiáng)人食管癌Eca-109細(xì)胞對5-Fu的化療敏感性。

關(guān)鍵詞：小干擾RNA；survivin基因；Eca-109細(xì)胞；化療敏感性

食管癌作為消化系統(tǒng)常見的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率與病死率在我國呈逐年上升趨勢，是導(dǎo)致中國民眾乃至全世界人群惡性腫瘤死亡的重要因素之一[1-2]。目前臨床絕大多數(shù)中晚期食管癌患者主要采取手術(shù)輔以放化療的綜合治療手段，大大提高了患者術(shù)后5年生存率，改善了預(yù)后[3-5]。由此如何有效提高腫瘤對化療藥物的敏感性就成為當(dāng)前食管癌研究的一個(gè)新方向。survivin作為近年來新研究發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制基因，在包括食管癌在內(nèi)的人類多數(shù)腫瘤組織中呈特異性高表達(dá)，而在正常分化的成人組織中表達(dá)較低甚至不表達(dá)[6]，與腫瘤生長增殖、腫瘤血管生成、腫瘤細(xì)胞放化療敏感性等密切相關(guān)[7]，已成為當(dāng)前惡性腫瘤靶向基因治療的熱點(diǎn)基因之一。因此，survivin基因有望成為食管癌患者基因治療的潛在新靶點(diǎn)。本研究利用RNAi技術(shù)特異性沉默survivin基因，探討其對食管癌Eca-109細(xì)胞化療敏感性的影響，以期為臨床食管癌患者靶向基因治療提供可行性依據(jù)。

1材料

1.1主要試劑胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶和RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司；載體構(gòu)建相關(guān)試劑BamH1/HandⅢ限制性核酸內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶均購自大連寶生物有限公司(TaKaRa公司)；質(zhì)粒抽提試劑盒購自上海華舜生物工程公司；蛋白水平檢測相關(guān)試劑BCA蛋白濃度檢測試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒大多購自美國Pierce公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購自美國Promega公司；Survivin和β-actin檢測相關(guān)抗體購自美國Santa Cruz公司；陽性干擾載體pRNAT-U6.1/Neo、陰性對照干擾載體購自美國Gencript公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)均購自Sigma公司；細(xì)胞凋亡檢測采用Annexin V-FITC試劑盒，購自美國BD公司。

1.2藥品氟尿嘧啶(5-Fu，每支250 mg,批號:1236) 為天津金耀氨基酸有限公司產(chǎn)品。

1.3細(xì)胞株人食管癌Eca-109細(xì)胞購自上海細(xì)胞生物研究所，常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于含5%CO2、溫度37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)，待細(xì)胞生長融合度達(dá)70%～80%時(shí)，常規(guī)以2.5 g·L-1胰蛋白酶消化液進(jìn)行消化與傳代。

2方法

2.1靶向survivin的寡核苷酸序列的設(shè)計(jì)利用生物信息學(xué)預(yù)測軟件，本實(shí)驗(yàn)針對survivin基因487～505 bp的靶點(diǎn)設(shè)計(jì)兩條互補(bǔ)DNA鏈，其序列分別為：5＇-GATCCAGAATTTGAGGAAACTGCGCTGTGAAGCCACAGATGGGCGCAGTTTCCTCAAATTC-TTTTTTA-3＇和3＇-GTCTTAAACTCCTTTGACGCGACACTTCGGTGTCTACCCGCGTCAAAGGAGTTTAAG-AAAAAATTCGA-5＇，兩條DNA鏈的結(jié)構(gòu)均為：BamH1酶切點(diǎn)+正義序列+莖環(huán)序列+反義序列+轉(zhuǎn)錄終止子+HindⅢ酶切點(diǎn)，在細(xì)胞內(nèi)形成所謂的“發(fā)夾結(jié)構(gòu)”。

2.2真核表達(dá)干擾質(zhì)粒的構(gòu)建載體pRNAT-U6.1/Neo經(jīng)HindⅢ和BamH1雙酶切后與已合成的靶向survivin的寡核苷酸鏈退火后連接，即得到針對survivin的siRNA真核表達(dá)干擾質(zhì)粒：pRNAT-siRNA-survivin，同法構(gòu)建陰性對照質(zhì)粒：pRNAT-siRNA-control。

2.3細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染待Eca-109細(xì)胞達(dá)對數(shù)生長期即細(xì)胞生長融合度達(dá)90%左右時(shí)，按轉(zhuǎn)染試劑盒說明將質(zhì)粒pRNAT-siRNA-survivin和pRNAT-siRNA-control分別轉(zhuǎn)染Eca-109細(xì)胞，待48 h后用G418進(jìn)行抗性篩選2～3周，可得到穩(wěn)定的細(xì)胞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，即為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，分別命名為：Eca-109 /si-survivin干擾組和Eca-109 /si-control陰性對照組，同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)染的Eca-109為空白對照組細(xì)胞。。

2.4Western blot檢測survivin基因沉默效果將對數(shù)生長期的survivin干擾組Eca-109 /si-survivin、陰性對照組Eca-109 /si-control、空白對照組Eca-109細(xì)胞按蛋白抽提要求進(jìn)行處理，取各組細(xì)胞50μg總蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳，隨后將分離的蛋白質(zhì)用半干石墨電轉(zhuǎn)移1.5h至硝酸纖維素膜上，再在室溫?fù)u床上用1×磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)配制的50 g·L-1脫脂奶粉封閉1h，加鼠抗人survivin一抗(1∶300)，4℃搖床孵育過夜，PBS洗膜3次，再加入兔抗鼠二抗(1∶2 000)，室溫孵育1.5 h，再用PBS洗膜3次，最后在化學(xué)發(fā)光儀上進(jìn)行顯色，以β-actin作為內(nèi)參，通過灰度掃描從蛋白表達(dá)水平對比觀察干擾前后survivin的不同表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5MTT法分析5-Fu對細(xì)胞生長的影響分別取對數(shù)生長期的空白對照組細(xì)胞Eca-109、陰性對照組細(xì)胞Eca-109 /si-control和survivin干擾組細(xì)胞Eca-109 /si-survivin每孔0.5×104個(gè)接種于96孔板中，每組接種5孔，待培養(yǎng)12 h細(xì)胞貼壁后，加5-Fu液，其質(zhì)量濃度分別為10、25、50、100、200 mg ·L-1，維持每孔終體積200 μL；待細(xì)胞培養(yǎng)48 h后每孔加入MTT 20 μL呈色，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)并棄培養(yǎng)液，每孔再加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解；然后在酶標(biāo)儀上測定490 nm波長處各孔的吸光度A值。細(xì)胞生長抑制率(%)=(對照組A490-實(shí)驗(yàn)組A490)/對照組A490×100%。最后用IC50計(jì)算軟件獲取3組細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

2.6流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡率將加5-Fu液培養(yǎng)48 h處于對數(shù)生長期的空白對照組、陰性對照組和survivin干擾組細(xì)胞分別收集到試管中，按照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒要求處理各組細(xì)胞，取488 nm為激發(fā)波長，用流式細(xì)胞儀分別測定各組細(xì)胞DNA含量，依DNA含量的分布不同進(jìn)行細(xì)胞凋亡率的分析，每組樣本重復(fù)3次。細(xì)胞凋亡率即細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)=陽性凋亡細(xì)胞數(shù)/觀察細(xì)胞總數(shù)×100%。

3結(jié)果

3.1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選轉(zhuǎn)染真核表達(dá)質(zhì)粒pRNAT-siRNA-survivin的Eca-109細(xì)胞，經(jīng)不同質(zhì)量濃度培養(yǎng)液G418抗性篩選，在倒置熒光顯微鏡下形成帶有綠色熒光蛋白GFP的陽性克隆。見圖1。

圖1　穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pRNAT-siRNA-survivin質(zhì)粒的

3.2干擾前后survivin蛋白的不同表達(dá)以β-actin為內(nèi)參，灰度掃描結(jié)果顯示干擾組Eca-109 /si-survivin細(xì)胞survivin蛋白表達(dá)水平(18.75±3.12)較陰性對照組Eca-109 /si-control(44.17±3.15)及空白對照組Eca-109 (46.20±2.62)明顯下調(diào)(P<0.05)；而兩對照組相比survivin蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異((P>0.05)。見圖2。

圖2　Western Blot檢測干擾前后

注：1:Eca-109/si-survivin；2:Eca-109 /si-control；3:Eca-109。

3.35-Fu對三組細(xì)胞的生長抑制作用MTT分析顯示：5-Fu對三組細(xì)胞的生長抑制作用呈劑量依賴性；對相同質(zhì)量濃度的5-Fu，干擾組細(xì)胞Eca-109 /si-survivin生長抑制率明顯高于空白對照組細(xì)胞Eca-109和陰性對照組細(xì)胞Eca-109 /si-control，差異具有顯著性(P<0.05)；Eca-109 /si-survivin干擾組細(xì)胞5-Fu的IC50為(18.75±1.53)mg·L-1，顯著低于Eca-109空白對照組(39.65±1.75)mg·L-1和Eca-109 /si-control陰性對照組(38.95±1.34)mg·L-1，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3　MTT檢測5-Fu對三組細(xì)胞的生長抑制作用

3.4沉默survivin基因?qū)?-Fu誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響分析結(jié)果顯示，三組細(xì)胞經(jīng)5-Fu 化療藥物作用后，Eca-109 /si-survivin干擾組平均細(xì)胞凋亡率(37.35±1.52)%明顯高于Eca-109 /si-control陰性對照組(12.34±1.32)%和未轉(zhuǎn)染Eca-109空白對照組(11.26±1.21)%，差異具有顯著性(F=355.459，P<0.05)；而陰性對照組和空白對照組平均細(xì)胞凋亡率無顯著性差異(P>0.05)。

4討論

survivin作為近年來新研究發(fā)現(xiàn)的抗凋亡基因，具有抑制細(xì)胞凋亡的重要生理功能，并參與促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂和促進(jìn)血管的形成[8]。研究表明，survivin基因特異性高表達(dá)于人類絕大多數(shù)腫瘤尤其是惡性腫瘤組織中，而在成年分化成熟組織和癌旁組織中低表達(dá)甚至不表達(dá)[9]，通過抑制腫瘤組織內(nèi)源性survivin的表達(dá)，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞生長增殖，進(jìn)而提高癌細(xì)胞對放化療的敏感性[10-11]。另有研究證實(shí)[12-13]survivin基因在食管癌組織中的表達(dá)水平顯著高于鄰近正常食管組織，可能作為一種腫瘤癌基因參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等病理生理過程。因此，survivin基因很可能與食管癌的發(fā)生、發(fā)展及診療密切相關(guān)，有望成為食管癌基因治療的理想靶點(diǎn)，從而為食管癌患者臨床綜合治療開辟新的路徑。

RNAi技術(shù)是近年來研究哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因功能的核心工具，由雙鏈RNA(double strand RNA, dsRNA)介導(dǎo)的特異性抑制同源基因表達(dá)的技術(shù)，具高度專一性，可產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄后特定基因沉默的效果[14]；目前RNAi技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物工程學(xué)、醫(yī)學(xué)及藥學(xué)研究等眾多領(lǐng)域中，為臨床眾多包括食管癌在內(nèi)的惡性腫瘤患者開辟了靶向基因治療的新路徑。但目前關(guān)于抑制survivin基因表達(dá)對食管癌化療敏感性影響的研究依然較少。

現(xiàn)今臨床常用于食管癌化療的藥物是氟尿嘧啶或順鉑，本研究通過構(gòu)建靶向survivin基因的真核表達(dá)載體pRNAT-siRNA-survivin，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染食管癌Eca-109細(xì)胞并經(jīng)化療藥物5-Fu作用后觀察細(xì)胞效應(yīng)的變化。結(jié)果顯示，RNA干擾后Eca-109 /si-survivin干擾組細(xì)胞survivin蛋白水平的表達(dá)明顯低于陰性對照組Eca-109 /si-control和空白對照組Eca-109；與陰性對照組和空白對照組相比，聯(lián)合應(yīng)用5-Fu的Eca-109 /si-survivin干擾組細(xì)胞IC50顯著降低，而聯(lián)合應(yīng)用5-Fu的Eca-109 /si-survivin干擾組細(xì)胞凋亡率顯著增加，提示靶向survivin基因的siRNA和5-Fu具有協(xié)同效應(yīng)，能夠大大改善食管癌細(xì)胞Eca-109對化療藥物5-Fu的敏感性，其可能機(jī)制是促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞增殖。因此，本研究主要借助siRNA特異性抑制survivin基因表達(dá)為臨床食管癌患者的靶向基因治療和有效化療提供理論基礎(chǔ)。

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Effects of siRNA targeting survivin gene on chemosensitivity of esophageal carcinoma cell Eca-109

NIU Zhao-xia, PENG Rui-rui, CHEN Jie, et al

(DepartmentofPathophysiology,HenanMedicalCollege,Zhengzhou,Henan451191,China)

Abstract:Objective To inhibit survivin gene expression by RNA interference technology and investigate the effects on chemosensitivity of esophageal carcinoma cell Eca-109. Methods siRNA eukaryotic expressing vector targeting specific sequence of survivin gene was constructed to transfect Eca-109 cells which were screened to select the survivin interference group Eca-109 /si-survivin with stable transfection.Meanwhile, the Eca-109 cells transfected with non-sense sequence were used as the negative control group and those untransfected were used as the blank control group.The expression level of survivin protein was detected by western blot to observe the interference effect. Then the cells of each group were treated with different concentrations of fluorouracil (5-Fu) , IC(50 )of 5-Fu in each group was detected by MTT and cell apoptosis rate was analyzed by flow cytometry. Results The survivin protein level (18.75±3.12) of the interference group Eca-109 /si-survivin was effectively lower than that of the negative control group Eca-109 /si-control (44.17±3.15)and the blank control group Eca-109 (46.20±2.62) (P<0.05); IC(50) of 5-Fu in the interference group Eca-109 /si-survivin was(18.75±1.53)mg·L(-1) , which was markedly lower than that of the blank control group(39.65±1.75)mg·L(-1) and the negative control group(38.95±1.34)mg·L(-1) with a statistically significant difference (P<0.05). The cell apoptosis rate of 5-Fu in the interference group Eca-109 /si-survivin was(37.35±1.52)%, which was evidently higher than that of the blank control group(11.26±1.21)% and the negative control group(12.34±1.32)% with a statistically significant difference (P<0.05). Conclusions siRNA targeting survivin can specifically silence the expression of survivin gene, inhibit cell proliferation, induce cell apoptosis, and thus enhance the chemosensitivity of human esophageal cancer Eca-109 cells to 5-Fu.

Key words:small interference RNA;survivin gene;Eca-109 cell;chemosensitivity

(收稿日期：2016-01-15，修回日期：2016-02-13)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.04.018

基金項(xiàng)目：河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(No 14B310002)