FlowCytomix檢測類風濕關節(jié)炎患者細胞因子表達譜

汪雪峰，舒　 揚，汪　毅，周月鵬，毛朝明

(江蘇大學附屬醫(yī)院1.中心實驗室；2.核醫(yī)學科，江蘇 鎮(zhèn)江　212001)

?

◇臨床醫(yī)學◇

FlowCytomix檢測類風濕關節(jié)炎患者細胞因子表達譜

汪雪峰1,2，舒 揚1,2，汪毅1，周月鵬2，毛朝明2

(江蘇大學附屬醫(yī)院1.中心實驗室；2.核醫(yī)學科，江蘇 鎮(zhèn)江212001)

摘要：目的應用FlowCytomix檢測類風濕關節(jié)炎患者(RA)細胞因子表達譜，探討其在RA發(fā)病及治療中的作用。方法分離RA患者及健康對照者外周血單個核細胞(PBMCs)，經(jīng)PHA刺激后，收集細胞培養(yǎng)上清，F(xiàn)lowCytomix檢測上清中細胞因子濃度。結果與健康對照組相比，RA患者IL-17、IL-6、IL-1β、TNF-α水平均顯著升高(P<0.05)，但IFN-γ水平顯著降低(P<0.05)，IL-10水平無明顯改變。RA患者疾病活動組IL-17、IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著高于緩解組(P<0.05)，但IFN-γ水平低于緩解組(P<0.05)；IL-17、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ水平與DAS28評分顯著相關(P<0.05)。結論FlowCytomix多細胞因子檢測系統(tǒng)可特異、靈敏地檢測RA患者PBMCs中細胞因子產生，RA患者PBMCs中IL-17、IL-6、IL-1β、TNF-α水平反映了其關節(jié)的炎癥程度及活動狀態(tài)。

關鍵詞：FlowCytomix；類風濕關節(jié)炎；細胞因子表達譜

類風濕關節(jié)炎(RA)是一種以慢性侵蝕性周圍關節(jié)炎為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病，致殘率高，已經(jīng)成為一種嚴重威脅人類健康的疾病[1]。RA的病因及發(fā)病機制尚不完全清楚，大量的細胞因子參與RA的病理過程，RA患者的炎癥關節(jié)滑膜及滑液中，能檢測出大量的細胞因子，這些細胞因子所形成的“免疫網(wǎng)絡”促使滑膜組織慢性炎癥不斷遷延，最終引起軟骨和骨質破壞等。因而，其中的一些細胞因子作為靶標，通過封閉這些細胞因子從而治療RA。其中，白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)已經(jīng)作為RA患者炎癥狀態(tài)的指示劑[2-3]。因而單一的細胞因子檢測不能反映RA患者的免疫狀態(tài)及炎癥水平。FlowCytomix多細胞因子分析系統(tǒng)是將熒光標記的微球與不同的抗體連接，抗體能與樣本中的不同細胞因子特異反應，然后根據(jù)微球大小不同和熒光強度的不同，用流式細胞儀檢測同一份樣本中各種細胞因子的表達。FlowCytomix能在一份小數(shù)量的樣本中同時檢測多種不同的細胞因子，同時減少樣本組間差異，減少樣本原料、分析時間、減少費用及人為誤差等，特別在大樣本或稀少樣本的檢測方面是一種非常有用的工具。用FlowCytomix檢測RA患者外周血中多種細胞因子改變，對監(jiān)測RA患者的炎癥狀態(tài)，或對治療藥物的應答反應具有重要的臨床意義。本研究用FlowCytomix檢測了RA患者外周血單個核細胞經(jīng)PHA刺激后多種細胞因子的分泌，旨在探討RA患者細胞因子的產生及其在RA發(fā)病中可能的作用。

1材料與方法

1.1材料選取2010年7月—2013年12月江蘇大學附屬醫(yī)院就診的RA患者38例，年齡32～70歲，病例選擇均符合2009年美國風濕病學會和歐洲抗風濕聯(lián)盟(EULAR)提出的新RA分類標準和評分系統(tǒng)。根據(jù)28個關節(jié)的疾病活動度評分(disease activity score in 28 joints, DAS28)評定疾病的活動狀態(tài)。其中RA活動組23例，其DAS28>5.1分，男6例，女17例，平均年齡(51.2±11.6)歲；RA緩解組15例，其DAS28<2.6分，男4例，女11例，平均年齡(48.5±12.7)歲；健康對照組20例，年齡35～71歲，所有RA患者及健康對照者無感染性疾病、惡性腫瘤、心血管或其他炎癥性疾病。研究對象均知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2主要儀器及試劑BD FACScan流式細胞儀、MAVM09608 Milipore 真空抽濾裝置(美國Milipore公司)、淋巴細胞分離液(濟南元興公司)及干擾素-γ(IFN-γ)、TNF-α、IL-17、IL-6、IL-1β、IL-10的FlowCytomix檢測試劑盒(奧地利Bender MedSystems公司)。

1.3外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)的制備采集各研究對象的空腹靜脈血5 mL，用Ficoll密度梯度離心法，按參考文獻[4]操作分離PBMC，收集細胞懸液備用。

1.4PBMCs培養(yǎng)上清中細胞因子檢測收集上述PBMCs，每孔2×105個細胞加入5 mg·L-1phytohaemagglutinin (PHA) 刺激24 h后，800×g離心10 min收集細胞培養(yǎng)上清，F(xiàn)lowCytomix Human Cytokine Kit(Bender MedSystems, Vienna, Austria)檢測上清中IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-6、IL-1β、IL-10。實驗步驟按照產品說明書進行。

1.5流式細胞儀校準儀器參數(shù)使用藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)標記的陽性和陰性對照微球設定儀器參數(shù)。檢測前向散射光(FSC)、側向散射光(SSC)，調節(jié)熒光通道FL2、FL3的參數(shù)。經(jīng)FSC、SSC分析，微球分為兩群R1、R2，分別對應于4.4 μm和5.5 μm，在FL2、FL3熒光通道下，根據(jù)熒光強度的不同分別分成11和9個微球群，因而在同一個熒光通道中，可以區(qū)分20種不同的細胞因子,見圖1。

圖1　 FlowCytomix校準儀器的流式細胞圖

1.6細胞因子標準曲線的擬定用試劑盒中的細胞因子標準品，倍比稀釋后，測定的細胞因子值擬定標準曲線，曲線擬合fit均大于80%，cut off 值為30%,見圖2。

1.7數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計學方法將FACS Calibur流式細胞儀檢測所得數(shù)據(jù)傳入FlowCytomix Pro 2.2分析軟件(Bender MedSystems公司提供)，建立各檢測因子的標準曲線，樣品濃度由軟件自動讀出。應用SPSS 10.1軟件進行統(tǒng)計學分析，兩組均數(shù)之間的比較采用成組t檢驗；兩變量相關分析采用Pearson相關分析。顯著性水準α=0.05。

2結果

2.1RA患者PBMCs中細胞因子檢測結果根據(jù)流式細胞儀校準的細胞因子參數(shù)(見圖1)及擬定的標準曲線(見圖2)測定RA患者及健康對照者PBMCs中細胞因子濃度，與健康對照組相比，RA患者PBMCs經(jīng)PHA刺激后，IL-17、IL-6、IL-1β、TNF-α水平(P<0.05)顯著升高，IFN-γ顯著降低(P<0.05)，IL-10水平無明顯改變。而且，RA患者疾病活動組IL-17、IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著高于疾病緩解組(P<0.05)，但疾病緩解組IFN-γ水平高于疾病活動組(P<0.05)；然而，疾病緩解組IL-6水平仍高于健康對照組(P<0.05)，見表1。

圖2　FlowCytomix檢測細胞因子的標準曲線圖

注：與健康對照組相比,aP< 0.05;與C組相比，bP< 0.05;與健康對照者相比,cP< 0.05。

2.2RA患者PBMCs中細胞因子與DAS28評分的相關性RA患者PBMCs中IL-17、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ與DAS28評分的Pearson 相關結果見表2。RA患者PBMCs中IL-17、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ與DAS28評分均顯著相關(P<0.05)。

表2　RA患者PBMCs中細胞因子與DAS28評分的相關性

3討論

CD4+輔助性T細胞(Th)分化異常和功能紊亂可能是RA發(fā)病的重要原因。初始T輔助細胞(Th0)在不同的細胞因子的誘導下，表達不同的轉錄因子，進而分化為功能和表型不同的效應性T細胞(Th1、Th2和Th17)和調節(jié)性T細胞(Treg)。既往認為RA是Th1占優(yōu)勢的自身免疫病。Th1細胞主要分泌IFN-γ，但動物實驗發(fā)現(xiàn)IFN-γ基因敲除[5]或阻斷IFN-γ的治療[6]卻不能使關節(jié)炎小鼠病情緩解，提示Th1細胞可能在RA發(fā)病中并非占有主導地位。越來越多的證據(jù)表明Th17細胞在RA疾病進展中發(fā)揮著重要作用，在活動性RA患者血清及關節(jié)液中IL-17的表達均增高，阻止Th17細胞分化或封閉IL-17的活性，可明顯抑制RA的病理反應[7]。活動性RA患者炎癥關節(jié)局部的單核細胞能活化CD4+T細胞，自發(fā)特異地誘導Th17細胞，而不是Th1或Th2細胞[8]。IL-17能誘導T細胞活化，促進滑膜細胞分泌多種細胞因子，IL-17上調和/或協(xié)同局部炎癥介質如IL-6、IL-1β、TNF-α等，促進胞外基質損傷，抑制基質成分修復，導致RA進一步發(fā)展。一旦關節(jié)局部炎癥過程被啟動，IL-17能不依賴于TNF-α，維持RA的發(fā)生[9-10]。與上述文獻報道相一致，本研究發(fā)現(xiàn)，RA患者PBMCs經(jīng)PHA刺激后，與健康對照組相比，IL-17、IL-6、IL-1β、TNF-α水平均顯著升高(P<0.05)，但IFN-γ的產生顯著降低(P<0.05)，該研究結果與Dong等[11]的研究結果一致。但RA患者緩解組IL-17、IL-6、IL-1β、TNF-α水平均顯著低于活動組(P<0.05)，IFN-γ水平顯著高于活動組(P<0.05)。RA患者PBMCs中IL-17、IL-6、IL-1β、TNF-α水平與DAS28評分呈顯著正相關(P<0.05)，IFN-γ水平與DAS28評分呈顯著負相關(P<0.05)，表明RA患者PBMCs中IL-17、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ水平反映了其關節(jié)的炎癥程度及活動狀態(tài)。

除了監(jiān)測RA患者的免疫狀態(tài)外，目前，RA患者的細胞因子封閉或受體拮抗劑治療非常有效，但是，部分患者，最高達40%的患者對此類生物治療無反應[2]?？紤]到生物治療非常昂貴，生物標記預測，選擇高反應的患者進行生物治療具有重要的社會效益和經(jīng)濟效益。一些細胞因子水平反應了患者對治療的應答狀態(tài)。RA患者對anti-TNF-α無反應，其滑液中IL-6的水平增高；但對anti-TNF-α反應的患者，其IL-2、G-CSF的表達上調。滑液中IL-6、IL-2、G-CSF水平可能是對anti-TNF-α反應的預測指標[12]。Das等[13]報道，利妥昔單抗無反應的RA患者血清中IL-6的水平顯著增高，而應答者IL-6水平顯著減少。對anti-TNF-α(依那西普)起反應的患者，其IL-6水平減少， IL-23和IL-32的水平增加，無反應者其上述細胞因子無明顯改變[14]。

與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測技術相比，基于微球的FlowCytomix檢測能夠自一份標本中同時檢測多種指標，且所需樣本量少，檢測時間短，具有更高的靈敏度和更好的重復性，并且能最大限度地消除不同反應體系所帶來的各種誤差，重要的是，它還有免費脫機分析軟件，使得數(shù)據(jù)的分析處理更加便捷。而且，本課題組前期研究結果發(fā)現(xiàn)，PBMCs由于缺少血清中干擾因素，檢測PBMCs中細胞因子濃度顯著高于血清中濃度;FlowCytomix與ELISA在細胞因子濃度檢測方面顯著相關，但FlowCytomix比ELISA更靈敏，能檢測出更多PBMCs中細胞因子且檢測濃度顯著高于ELISA檢測濃度[15]。與其他基于微球技術的多參數(shù)檢測技術(如Luminex液相蛋白芯片技術，CBA流式微珠陣列技術)相比,FlowCytomix檢測技術的實驗過程幾乎可在所有的流式細胞儀上完成，這使得在流式細胞儀平臺上進行多參數(shù)檢測變的更加普遍。因而，考慮到RA本身發(fā)病機制的復雜性及異質性，應用FlowCytomix檢測RA患者多種細胞因子，不僅為RA患者的免疫狀態(tài)和炎癥水平提供更為可信的依據(jù)。而且，可用于預測RA患者對細胞因子治療的應答反應，為RA患者個性化治療提供一種有用的工具，更好地為臨床服務。

參考文獻：

[1]葛文賢.聯(lián)合檢測抗 CCP 抗體與 RF 在類風濕關節(jié)炎早期診斷中的應用[J].臨床合理用藥雜志2015，8(11A)：105-106.

[2]Burska A,Boissinot M,Ponchel F. Cytokines as biomarkers in rheumatoid arthritis[J].Mediators Inflamm，2014，2014：545493.

[3]邱艷,趙凌杰.白介素33在類風濕性關節(jié)炎中的研究進展[J].安徽醫(yī)藥,2014,18(7)：1370-1372.

[4]金亮,張茜,沙泉.比較人AB型血清與胎牛在結核桿菌裂解物刺激人外周血單個核細胞中的作用[J].安徽醫(yī)藥,2015,19(2):276-279.

[5]Lee J,Lee J,Park MK,et al. Interferon gamma suppresses collagen-induced arthritis by regulation of Th17 through the induction of indoleamine-2,3-deoxygenase[J]. PLoS One,2013,8(4)：e60900.

[6]Brzustewicz E,Bryl E.The role of cytokines in the pathogenesis of rheumatoid arthritis -Practical and potential application of cytokines as biomarkers and targets of personalized therapy[J]. Cytokine,2015,76(2):527-536.

[7]Yang J,Sundrud MS,Skepner J,et al.Targeting Th17 cells in autoimmune diseases[J].Trends Pharmacol Sci,2014,35(10):493-500.

[8]Evans HG,Gullick NJ,Kelly S,et al.In vivo activated monocytes from the site of inflammation in humans specifically promote Th17 responses[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(15):6232-6237.

[9]Roeleveld DM,Koenders MI.The role of the Th17 cytokines IL-17 and IL-22 inrheumatoid arthritis pathogenesis and developments in cytokine immunotherapy[J].Cytokine,2015,74(1):101-107.

[10] Bartlett HS,Million RP.Targeting the IL-17-T(H)17 pathway[J]. Nat Rev Drug Discov，2015,14(1):11-12.

[11] Dong L,Wang X,Tan J,et al. Decreased Expression of MicroRNA-21 Correlates with the Imbalance of Th17 and Treg Cells in Patients with Rheumatoid Arthritis [J]. J Cell Mol Med,2014,18(11)：2213-2224.

[12] Wright HL,Bucknall RC,Moots RJ,et al.Analysis of SF and plasma cytokines provides insights into the mechanisms of inflammatory arthritis and may predict response to therapy[J].Rheumatology (Oxford),2012,51(3):451-459.

[13] Das S,Vital EM,Horton S,et al. Abatacept or tocilizumab after rituximab in rheumatoid arthritis? An exploratory study suggests non-response to rituximab is associated with persistently high IL-6 and better clinical response to IL-6 blocking therapy[J].Ann Rheum Dis,2014,73(5):909-912.

[14] Zivojinovic SM,Pejnovic NN,Sefik-Bukilica MN,et al. Tumor necrosis factor blockade differentially affects innate inflammatory and Th17 cytokines in rheumatoid arthritis[J].J Rheumatol,2012,39(1):18-21.

[15] Wang X,Dong L,Liang Y,et al.Performance evaluation of FlowCytomix assays to quantify cotokines in patients with rheumatoid arthritis[J].Int J Clin Exp Med,2015，8(9):16158-16166.

Detection of cytokine profile of patients with rheumatoid arthritis by FlowCytomix

WANG Xue-feng1,2, SHU Yang1,2, WANG Yi1, et al

(1.DepartmentofCentralLaboratory；2.DepartmentofNuclearMedicineandInstituteofOncology,theAffiliatedHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang,Jiangsu212001,China)

Abstract:Objective To detect cytokine profile of patients with rheumatoid arthritis (RA) by FlowCytomix. Methods Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from healthy controls and RA patients by Ficoll-Hypaquedensity gradient centrifugation, then the cells were stimulated with phytohaemagglutinin (PHA) and the supernatants were collected to quantitatively measure cytokine production by FlowCytomix. Results Compared with control group, the concentrations of IL-17, IL-6, IL-1β and TNF-α were significantly increased but the level of IFN-γ was decreased. The concentration of IL-10 was not significantly changed. The levels of IL-17, IL-6, IL-1β, and TNF-α were higher in active RA than those of remission, whereas IFN-γ level was high in remission. IL-17, IL-6, IL-1β, TNF-α, and IFN-γ levels and DAS28 score showed significant correlation.Conclusions Multiplex cytokine profiling systems of FlowCytomix can be applied to specific and sensitive quantification of cytokines of PBMCs from RA patients, and the levels of IL-17, IL-6, IL-1β, and TNF-α in PBMCs reflect the degree of inflammation in joints and the disease activity.

Key words:FlowCytomix；rheumatoid arthritis;cytokine profile

(收稿日期：2015-11-19，修回日期：2016-02-20)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.04.015

基金項目:江蘇省自然科學基金(No BK20141295)；江蘇省“333工程”科研項目(No BRA2014172);鎮(zhèn)江市社會發(fā)展項目(SH2015033)；鎮(zhèn)江市重點醫(yī)學人才資助(2014年)