不同類型樹脂分離純化東風(fēng)桔總生物堿的篩選

董臣林，黃永昌，尹永芹，馮淡開，沈志濱

(1.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東 廣州　510006；2.廣東恒建制藥有限公司，廣東 江門　529000)

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◇藥學(xué)研究◇

不同類型樹脂分離純化東風(fēng)桔總生物堿的篩選

董臣林1，黃永昌1，尹永芹1，馮淡開2，沈志濱1

(1.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東 廣州510006；2.廣東恒建制藥有限公司，廣東 江門529000)

摘要：目的篩選適合用于分離純化東風(fēng)桔總生物堿的樹脂。方法 采用酸性染料比色法測定總生物堿的含量，以靜態(tài)吸附率及解吸率為指標(biāo)，對15種不同類型的樹脂進行篩選，然后通過單因素法考察上樣液pH值、吸附溫度、吸附時間等對樹脂吸附效果進行優(yōu)化。結(jié)果001*7陽離子交換樹脂對東風(fēng)桔總生物堿效果較好，總生物堿的吸附率達到73.51%，解吸率達到90.58%，在單因素試驗中，上樣液pH=2～3，T=50℃，吸附6 h時，具有最優(yōu)的吸附效果。結(jié)論 001*7陽離子交換樹脂適合用于東風(fēng)桔總生物堿的分離純化，為其進一步的富集工藝研究及新藥研發(fā)提供實驗參考。

關(guān)鍵詞:東風(fēng)桔；總生物堿；樹脂

東風(fēng)桔[Atalantiabuxifolia(Poir.) Oliv.ex Benth]為蕓香科植物酒餅簕的根及根莖部分，性溫，味微辛、苦，歸肺、胃、脾經(jīng)，產(chǎn)于廣東、廣西、海南等地，被收錄于《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》。東風(fēng)桔作為一種常用的民間用藥，具有祛風(fēng)散寒、行氣止痛功效，臨床上主要用于治療支氣管炎、風(fēng)寒咳嗽、感冒發(fā)燒、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性胃炎、胃潰瘍及跌打腫痛等[1-3]，效果顯著。東風(fēng)桔主要含有揮發(fā)油、檸檬苦素、生物堿、香豆素、黃酮等類成分[4]，有文獻報道[5]，其生物堿具有較好的化痰、止咳、平喘的活性。目前，對于總生物堿分離純化方法主要涉及有酸提堿沉法、有機溶劑萃取法、大孔樹脂法、陽離子交換樹脂法，其中后兩者具有富集率高，安全性好，可以重復(fù)使用等優(yōu)點而得到廣泛的應(yīng)用[6-8]。本文以吸附率、解吸率為指標(biāo)，對不同類型的樹脂進行篩選，得到適用于分離純化東風(fēng)桔總生物堿的最佳樹脂，為進一步富集工藝研究及新藥研發(fā)提供參考[9-13]。

1儀器及材料

1.1儀器UV-2450紫外—可見光光度計(日本島津)，電子恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)，BP211D型十萬分之一電子分析天平(德國賽多利斯公司)，DS8510DT超聲清洗器(上海生析超聲儀器有限公司)。1.2材料東風(fēng)桔藥材采自廣東電白市，由廣東藥學(xué)院劉基柱教授鑒定為蕓香科酒餅簕屬東風(fēng)桔[Atalantiabuxifolia(Poir.) Oliv.ex Benth]的根及根莖，標(biāo)本存放于廣東藥學(xué)院中藥化學(xué)實驗室。對照品生物堿(Buxifoliadine-B,自制，純度>98%)，溴甲酚綠(天津市天新化工開發(fā)中心)、枸櫞酸(天津福晨化學(xué)試劑廠)、三氯甲烷(天津市致遠化學(xué)試劑有限公司)、磷酸氫二鈉(天津市致遠試劑有限公司)等均為分析純，乙醇為工業(yè)級(可食)，水為超純水，HPD100、HPD400、HPD450、HPD600、HPD826、HPD722均購于河北寶恩生物科技有限公司，801、818、001*1、001*4、001*7購于安徽三星樹脂科技有限公司，D4020、AB-8、NKA-9購于南開大學(xué)化工廠。

2方法與結(jié)果

2.1樣品溶液的制備[14]

2.1.1對照品溶液的制備精密稱定Buxifoliadine-B 21.25 mg至50 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，即得。

2.1.2供試品溶液的制備 取東風(fēng)桔藥材粉末(80目)1 g，加入乙醇50 mL，精密稱定，浸潤30 min，超聲提取1 h，加乙醇補足質(zhì)量，過濾，取過濾液25 mL蒸干，殘渣用乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，即得。

2.2總生物堿的含量測定

2.2.1檢測波長考察 精密吸取對照品溶液1 mL和供試品溶液2 mL，分別置于25 mL量瓶中，水浴揮去溶劑，各加入pH=3.4枸櫞酸—磷酸氫二鈉緩沖液5 mL，溴甲酚綠溶液2 mL和三氯甲烷10 mL，密塞，劇烈振搖3 min，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，靜置30 min，分取三氯甲烷層，濾過，取濾液測定。同法制得空白溶液作為參比，于200～800 nm進行全波長掃描，結(jié)果顯示二者均在410 nm處有最大吸收，故確定檢測波長410 nm。

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取對照品溶液0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.5 mL，分別置于5.0 mL容量瓶中，加乙醇定容至刻度，搖勻，精密吸取2.5 mL，按“2.2.1”項下方法顯色以質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)(Y)，得回歸方程Y=3.427X+0.003 8(r=0.999 8)，線性范圍0.008 5～0.382 5 g·L-1。

2.2.3精密度試驗 精密吸取對照品溶液1 mL，按“2.2.1”項下方法顯色，平行測定6次，計算峰面積A的RSD為0.26%，儀器精密度符合要求。

2.2.4 重復(fù)性試驗 取6份東風(fēng)桔藥材粉末各約1 g，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.2.1”項下方法顯色，結(jié)果Buxifoliadine-B平均提取量3.11 mg·g-1，RSD為1.32%，該方法重復(fù)性良好。

2.2.5穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液和對照品溶液，依法顯色后，分別于制備后30、60、90、120 min測定鋒面積A，結(jié)果RSD為1.90%，待測溶液在2 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6加樣回收率試驗 精密稱取6份東風(fēng)桔藥材粉末，每份0.5 g，分別加入Buxifoliadine-B對照品適量，依次按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.2.1”項下方法顯色，結(jié)果平均回收率為99.33%，RSD為1.67%。

2.3樹脂型號篩選

2.3.1吸附能力考察 提取液減壓回收至無乙醇味，用蒸餾水定容至濃度為生藥量0.15 g·mL-1的濃縮液，分別取803、801、818、D4020、HPD100、NKA-9、AB-8、HPD600、HPD826、HPD450、HPD722、HPD400、001*1、001*4、001*7這15種處理好的樹脂，各取20 mL于具塞三角瓶中，加入2倍量體積的濃縮液靜態(tài)吸附12 h，不時攪拌。取上清液測總生物堿的含量，計算樹脂的吸附率，結(jié)果見表1。

表1　不同型號樹脂的吸附能力考察

注：吸附率=(吸附前溶液總生物堿量-吸附后溶液總生物堿量)/吸附前溶液總生物堿量×100%。

2.3.2解吸附能力的考察 對有較好吸附效果的803、NKA-9、AB-8、001*1、001*4、001*7這6個型樹脂進行解吸附能力考察，將吸附飽和的樹脂裝到玻璃柱，用蒸餾水洗滌除去雜質(zhì)，至流出的水澄清，pH=6時，再用95%乙醇洗脫樹脂至洗脫劑澄清，以洗脫的最大體積為標(biāo)準(zhǔn)，其它型號樹脂繼續(xù)用95%乙醇洗脫，使得最終洗脫體積相等，記錄洗脫液的體積，測量并計算總生物堿的含量。取一定體積的洗脫液放于已經(jīng)恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸至近干，再放置105℃烘箱中干燥至恒重，然后稱定重量，計算膏重，結(jié)果見表2，根據(jù)樹脂型號吸附率和解吸率最終篩選出001*7為理想的樹脂。

表2　不同型號樹脂的解吸能力的考察

注：總生物堿含量=測膏重的溶液體積/測含量的體積×測含量的體積的總生物堿/膏重×100%。

2.4靜態(tài)吸附總生物堿的影響因素考察

2.4.1上樣液pH值考察提取液減壓回收至無乙醇味，用蒸餾水定容至濃度為生藥量0.15 g·mL-1的濃縮液，取5份處理好的樹脂20 mL倒入具塞三角瓶中，吸走水分，倒入40 mL濃縮液，用鹽酸和氨水調(diào)pH到2、4、6、8、12，加蓋，放置于35℃水浴中吸附12 h，每隔1 h攪拌。將吸附好的樹脂轉(zhuǎn)移到玻璃柱中，用蒸餾水沖至流出的水澄清，pH為中性后，用95%乙醇洗脫，洗脫至流出液無顏色，以洗脫的最大體積為標(biāo)準(zhǔn)，其它型號樹脂繼續(xù)用95%乙醇洗脫，使得最終洗脫體積相等，記錄洗脫體積，取0.5 mL洗脫液測含量。結(jié)果見表3，001*7對東風(fēng)桔總生物堿的吸附率隨pH的下降而上升，所以選擇pH=2為上樣液pH值。

表3　上樣液pH值對吸附效果的影響

2.4.2吸附溫度考察提取液減壓回收至無乙醇味，用蒸餾水定容至濃度為生藥量0.15 g·mL-1的濃縮液，取3份處理好的樹脂20 mL倒入具塞三角瓶中，吸走水分，倒入40 mL濃縮液，用鹽酸調(diào)pH=2，加蓋，分別放置于25、35、50℃水浴中吸附12 h，每隔1 h攪拌。將吸附好的樹脂轉(zhuǎn)移到玻璃柱中，用蒸餾水沖至流出的水澄清，pH為中性后，用95%乙醇洗脫，洗脫至流出液無顏色，以洗脫的最大體積為標(biāo)準(zhǔn)，其它型號樹脂繼續(xù)用95%乙醇洗脫，使得最終洗脫體積相等，記錄洗脫體積，取0.5 mL洗脫液測含量。結(jié)果見表4，結(jié)果表明001*7對東風(fēng)桔總生物堿的吸附率隨溫度的升高而升高，但根據(jù)001*7樹脂的使用范圍，選定50℃為最佳吸附溫度。

表4　溫度對樹脂吸附效果的影響

2.4.3吸附時間考察 提取液減壓回收至無乙醇味，用蒸餾水定容至濃度為生藥量0.15 g·mL-1的濃縮液，取5份處理好的樹脂20 mL倒入具塞三角瓶中，吸走剩下的少量水分，倒入40 mL濃縮液，用鹽酸調(diào)pH=2，加蓋，放置于50℃水浴中分別吸附1、2、3、6、12 h，每隔1 h攪拌。將吸附好的樹脂轉(zhuǎn)移到玻璃柱中，用蒸餾水沖至流出的水澄清，pH為中性后，用95%乙醇洗脫，洗脫至流出液無顏色，以洗脫的最大體積為標(biāo)準(zhǔn)，其它型號樹脂繼續(xù)用95%乙醇洗脫，使得最終洗脫體積相等，記錄洗脫體積，取0.5 mL洗脫液測含量。結(jié)果見表5，結(jié)果表明6 h后樹脂吸附飽和。

表5　時間對樹脂吸附效果的影響

2.5驗證試驗 精密量取25 mL處理好的001*7離子交換樹脂3份放置于具塞三角瓶中，加入pH=2的濃縮液，放于50℃水浴中吸附6 h并不時攪拌，將吸附好的離子交換樹脂轉(zhuǎn)移到玻璃柱，用蒸餾水以2BV/H流速沖至流出液澄清，pH=6。用95%乙醇洗脫，洗脫至流出液無顏色，以洗脫的最大體積為標(biāo)準(zhǔn)，其它型號樹脂繼續(xù)用95%乙醇洗脫，使得最終洗脫體積相等，記錄洗脫體積，取0.5mL洗脫液測含量。取一定體積的洗脫液放于已經(jīng)恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸至近干，再放置105℃烘箱中干燥至恒重，然后稱定重量，計算膏重。結(jié)果見表6，總生物堿平均富集率為66.11%。

表6　001*7離子交換樹脂應(yīng)用于東風(fēng)桔

3討論

企業(yè)常用酸溶堿沉法富集總生物堿，但此方法只能針對叔胺型生物堿，應(yīng)用范圍有限，雖然大孔樹脂已經(jīng)在中藥領(lǐng)域內(nèi)大量應(yīng)用，但還沒特定針對生物堿的型號，難以使富集率達到50%以上[15-16]。陽離子交換樹脂原理是離子交換，能針對性吸附溶液中的生物堿陽離子，專屬性強。東風(fēng)桔中生物堿種類主要為吖啶酮類生物堿，分別為仲胺和叔胺類，堿性較弱，用所以選強酸型陽離子交換樹脂效果較好，使得生物堿的富集率達到50%，符合中藥5類新藥注冊要求。

在考察離子交換樹脂相關(guān)參數(shù)時，考慮到離子交換的速度比較慢，根據(jù)因素影響的大小和考慮到工業(yè)生產(chǎn)，選擇了上樣液pH值、吸附溫度、吸附時間為考察因素。上樣液pH是影響吸附的最大因素，在pH=2～3時，生物堿以離子態(tài)存在才能交換到陽離子交換樹脂的-SO3-上被吸附。交聯(lián)度大的離子交換樹脂交換量高，但網(wǎng)孔小，不利于生物堿分子擴散入樹脂內(nèi)進行交換，交聯(lián)度小的樹脂網(wǎng)孔大，有利于生物堿分子擴散進入樹脂內(nèi)進行交換，但交換量少。東風(fēng)桔生物堿分子量大小范圍為300～550，結(jié)果表明001*7陽離子交換樹脂相對于001*4、001*1樹脂從交聯(lián)度和交換容量都更加適合。

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Comparison of different resins for isolation and purification of total alkaloids from Atalantia buxifolia

DONG Chen-lin, HUANG Yong-chang, YIN Yong-qin, et al

(SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou,Guangdong510006,China)

Abstract:ObjectiveTo select proper resins for isolation and purification of total alkaloids from Atalantia buxifolia. MethodsThe content of total alkaloids was determined by acid dye-colorimetry. With the adsorption rate and desorption rate of total alkaloids as the observation indexes, the optimized resin was selected by screening 15 types of resins. And then the resin adsorption influence factors were investigated by single-factor experiments based on pH, temperature and adsorption time. Results The 001*7 cation-exchanging resin had good adsorption and desorption activities, with an adsorption rate being 73.51% and a desorption rate being 90.58%. The optimum adsorption process: the extracting solution pH=2～3, T=50 ℃, and adsorbing time 6 hours. ConclusionThe 001*7 cation-exchanging resin could be used for total alkaloids enrichment, which could also provide a reference for further study.

Key words：Atalantia buxifolia;total alkaloids;resin

(收稿日期：2015-11-20，修回日期：2016-01-20)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.04.006

作者簡介：董臣林，男，碩士研究生通信作者：沈志濱，女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥活性成分研究及新藥研發(fā)，E-mail：szb8113@126.com

基金項目:廣東省自然科學(xué)基金(No 2015A030313585)；中醫(yī)藥行業(yè)專項基金(No 201507004)