補(bǔ)腎生髓方和益氣活血方對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠額頂葉皮質(zhì)Notch信號(hào)通路Nurr1、SMO mRNA及其蛋白表達(dá)的影響

宋祖榮，徐　偉，王　鍵，胡建鵬

(1.安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽 合肥　230088；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥　230038)

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·實(shí)驗(yàn)研究·

補(bǔ)腎生髓方和益氣活血方對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠額頂葉皮質(zhì)Notch信號(hào)通路Nurr1、SMO mRNA及其蛋白表達(dá)的影響

宋祖榮1，徐偉2，王鍵2，胡建鵬2

(1.安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽 合肥230088；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥230038)

[摘要]目的 探討補(bǔ)腎生髓方和益氣活血方對(duì)腦缺血再灌注大鼠額頂葉皮質(zhì)Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Nurr1、SMO mRNA及其蛋白表達(dá)的影響。方法采用線栓法復(fù)制右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)腎生髓方組和益氣活血方組。腦缺血2 h后，持續(xù)灌注7 d。采用PCR檢測(cè)額頂葉皮質(zhì)Nurr1、SMO mRNA表達(dá)水平，采用Western blot檢測(cè)其蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組Nurr1、SMO mRNA及其蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào)(P<0.05)；益氣活血方組和補(bǔ)腎生髓方組Nurr1 mRNA及其蛋白、SMO蛋白相對(duì)表達(dá)水平均較模型組明顯下調(diào)(P<0.05)；模型組、益氣活血方組和補(bǔ)腎生髓方組SMO mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；益氣活血方組與補(bǔ)腎生髓方組Nurr1、SMO蛋白表達(dá)水平有顯著差異(P<0.05)。結(jié)論補(bǔ)腎生髓方和益氣活血方促進(jìn)腦組織修復(fù)的作用與其下調(diào)Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中Nurr1、SMO mRNA及其蛋白表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]腦缺血再灌注；益氣活血方；補(bǔ)腎生髓方；Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)在一定條件下可增殖分化成神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞[1]，參與神經(jīng)功能的修復(fù)過(guò)程，對(duì)于其在缺血性腦卒中中的修復(fù)作用已引起普遍的重視[2]。大量實(shí)驗(yàn)證明，通過(guò)激活Notch信號(hào)通路能夠抑制脊椎動(dòng)物體內(nèi)神經(jīng)發(fā)生，保持NSCs特性[3]。以往研究證實(shí)，補(bǔ)腎生髓方和益氣活血方能通過(guò)調(diào)節(jié)Notch信號(hào)通路，促進(jìn)局灶性腦缺血再灌注損傷的腦組織修復(fù)[4]。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈線栓法復(fù)制動(dòng)物模型，觀察兩種中藥復(fù)方對(duì)模型大鼠缺血側(cè)額頂葉皮質(zhì)中Nurr1和SMO基因及其蛋白表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制。

1材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性健康SD大鼠40只，體質(zhì)量280～320 g，月齡4個(gè)月，由安徽省定遠(yuǎn)縣永康青源養(yǎng)殖場(chǎng)提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(皖)2011-002，被隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)腎生髓方組、益氣活血方組，每組10只。

1.2藥物與試劑益氣活血方(腦絡(luò)欣通)：川芎、三七各10 g，紅花6 g，黃芪30 g，等。補(bǔ)腎生髓方：金毛狗脊、杜仲、鹿角膠、龜板膠等各10 g。兩方均由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥制劑室制備，分別相當(dāng)于原生藥的1.0、2.4 g/mL，益氣活血方和補(bǔ)腎生髓方分別按8.54、10.25 g/kg的中等劑量每天灌胃使用。Nurr1、SMO單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Stan Cruz公司；山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG和β-actin均購(gòu)置于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Notch通路PCR芯片購(gòu)自美國(guó)SABiosciences公司；丙烯酰胺、過(guò)硫酸氨、Tris堿、TEMED均購(gòu)自美國(guó)sigma公司；RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；電化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)pierce公司；Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；無(wú)RNA酶的糖原購(gòu)自Ambion公司；RNeasy?MinEluteTM純化試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；EDTA、MOPS購(gòu)自華美生物工程公司；RNase Inhibitor購(gòu)自Epicentre公司。

1.3儀器ND-1000型微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)由美國(guó)Thermo公司提供；自動(dòng)制冰機(jī)(AF-10型)由意大利SCOTSMAN公司提供；ABI PRISM7700系統(tǒng)由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司提供；EPS 300型電泳儀、VE-180型電泳槽、VE-186型轉(zhuǎn)膜儀由上海天能科技有限公司提供；Modulus多功能光度計(jì)由美國(guó)Turner BioSystems提供；PVDF膜由美國(guó)Millipore公司提供；微量離心機(jī)(LX 300型)由海門市其林貝爾儀器制造有限公司提供；X膠片由Kodak提供等。

2方法

2.1模型復(fù)制與神經(jīng)缺損功能評(píng)分參照Longa[5]提出的模型復(fù)制及評(píng)定方法，假手術(shù)組僅作頸動(dòng)脈分離，其余各組腦缺血2 h后再灌注，再灌注后進(jìn)行神經(jīng)缺損功能評(píng)分，2～3分者入選。

2.2給藥按照成人正常劑量換算，補(bǔ)腎生髓方和益氣活血方分別按8.54、10.25 g/kg灌胃給藥，模型復(fù)制前30 min給藥1次，其后每日灌胃2次，假手術(shù)組與模型組大鼠接受等容量生理鹽水灌胃，持續(xù)灌胃10 d。

2.3取材分別在腦缺血2 h再灌注，持續(xù)10 d給藥后，以10%水合氯醛麻醉(3.5 mL/kg腹腔注射)大鼠后，迅速開(kāi)顱取腦，在冰凍0.9%生理鹽水條件下分離取額頂葉皮質(zhì)，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4PCR檢測(cè)依據(jù)規(guī)范操作流程[6]進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，以2-ΔΔC(T)相對(duì)定量方法[7]分析數(shù)據(jù)。

2.5Western blot法檢測(cè)取缺血側(cè)額頂葉皮質(zhì)約100 mg，裂解、離心，分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、漂洗，加入封閉液搖動(dòng)，室溫封閉2 h。用抗體稀釋液進(jìn)行稀釋，抗β-actin為鼠抗(1∶1 000稀釋，10%分離膠)；抗NR4A2、SMO為兔抗(1∶1 000稀釋，10%分離膠)。4 ℃孵育過(guò)夜，洗滌，用二抗稀釋液稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶10 000)，室溫封閉2 h。加入洗滌液TBST洗滌3次，每次10 min。應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)蛋白，X光膠片曝光顯影，凝膠圖像分析儀分析條帶光密度，以其與β-actin的比值表示相對(duì)表達(dá)水平。

3結(jié)果

3.1各組大鼠額頂葉皮質(zhì)Nurr1、SMO mRNA表達(dá)水平比較與假手術(shù)組比較，模型組Nurr1、SMO mRNA表達(dá)水平均明顯上調(diào)(P<0.05)。模型組、益氣活血方組和補(bǔ)腎生髓方組Nurr1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F(2，6)=25.08，P=0.001)，益氣活血方組和補(bǔ)腎生髓方組Nurr1基因表達(dá)均較模型組明顯下調(diào)(P<0.05)；3組SMO mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F(2，6)=1.33，P=0.333)。見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠額頂葉皮質(zhì)Nurr1、SMO mRNA

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；

與模型組比較，#P<0.05。

3.2各組大鼠額頂葉皮質(zhì)Nurr1、SMO蛋白表達(dá)水平比較與假手術(shù)組比較，模型組Nurr1和SMO蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)。模型組、益氣活血方組和補(bǔ)腎生髓方組Nurr1蛋白和SMO蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Nurr1蛋白：F(2，6)=741.68，P=0.000；SMO蛋白：F(2，6)=244.61，P=0.000)，益氣活血方和補(bǔ)腎生髓方組Nurr1和SMO蛋白相對(duì)表達(dá)水平均較模型組明顯減少(P<0.05)，益氣活血方組與補(bǔ)腎生髓方組Nurr1和SMO蛋白表達(dá)水平有顯著差異(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表2。

表2　各組大鼠額頂葉皮質(zhì)Nurr1、SMO蛋白

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與益氣活血方組比較，△P<0.05。

注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.益氣活血方組；D.補(bǔ)腎生髓方組。

圖1各組大鼠額頂葉皮質(zhì)Nurr1和SMO蛋白

表達(dá)水平(Western blot法)

4討論

由于中國(guó)人口逐步進(jìn)入老齡化，心腦血管病的發(fā)病率呈逐年增加的趨勢(shì)，而其中又以急性腦血管疾病多見(jiàn)。腦卒中在中醫(yī)學(xué)中又被稱為“中風(fēng)”，是屬于急性腦血管疾病范疇，其發(fā)病率、致殘率與病死率均很高，同時(shí)也是高復(fù)發(fā)率的疾病，居中國(guó)城市居民死因的首位，其病死率高于心血管疾病及癌癥[8]，已成為成年人致殘的最主要原因，帶來(lái)了極重的社會(huì)負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[9]。而這其中又以缺血性中風(fēng)病最為多見(jiàn)。

近年來(lái)通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)研究證明，NSCs對(duì)于缺血性腦卒中的修復(fù)起著重要的作用；腦缺血后NSCs的增殖分化為腦缺血損傷的自我修復(fù)展示了可喜的前景，但內(nèi)源性NSCs數(shù)量是有限的，如何通過(guò)內(nèi)外源性手段和方法促進(jìn)自我修復(fù)，成為新的研究課題。在胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路起著十分重要的作用，在促進(jìn)內(nèi)源性NSCs的增殖分化中扮演著非常重要的角色，可以通過(guò)多種蛋白質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)分子的表達(dá)、運(yùn)輸和降解等過(guò)程[10]。而作為Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中基因轉(zhuǎn)錄蛋白，Nurr1是一種轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體超家族成員，有研究[11]發(fā)現(xiàn)NSCs移植后在腦內(nèi)分化與Nurr1調(diào)控相關(guān)，該基因使外源NSCs向神經(jīng)細(xì)胞表型分化增多，通過(guò)局灶性腦梗死模型缺血周邊區(qū)移植轉(zhuǎn)染Nurr1基因的干細(xì)胞能顯著改善神經(jīng)功能缺損；SMO蛋白是一種跨膜蛋白，該蛋白能把細(xì)胞外Shh信號(hào)轉(zhuǎn)換成細(xì)胞內(nèi)Gli信號(hào)，以激活Sonic hedgehog信號(hào)通路，有研究[12]發(fā)現(xiàn)SMO能夠參與骨髓基質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)分化。

在中醫(yī)學(xué)中，作為治療缺血性腦卒中的常用中醫(yī)治法益氣活血法和補(bǔ)腎生髓法是基于“腎精-腦髓”相關(guān)理論和“氣血相關(guān)”理論而形成的。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，氣與血是腦生長(zhǎng)發(fā)育和功能活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，其中，氣是生命之源，包括元?dú)?、宗氣、營(yíng)氣、衛(wèi)氣，而元?dú)馐怯赡I精所化，是人體中最基本、最重要的氣，可激發(fā)各臟腑組織的生理功能；而腎精對(duì)腦髓的生成和充滿起至關(guān)重要的作用；而津液也是血液的組成部分，營(yíng)氣與津液同行脈中，從而形成血液；因此氣血是化生腦髓的重要源泉，是腦生長(zhǎng)發(fā)育和維持其生理功能活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)；“氣虛血瘀”與“腎精不足”是缺血性腦卒中的主要病因病機(jī)，其治療核心環(huán)節(jié)是益氣活血和補(bǔ)腎生髓，通過(guò)益氣活血來(lái)改善腦血液循環(huán)狀態(tài)，通過(guò)補(bǔ)腎生髓使髓海得養(yǎng)、腦髓充滿、神機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，局灶性腦缺血再灌注大鼠額頂葉皮質(zhì)模型大鼠Nurr1、SMO mRNA及其蛋白表達(dá)顯著升高，提示腦缺血后Nurr1、SMO mRNA及其蛋白是一種高表達(dá)的狀態(tài)，其原因是大鼠腦組織在腦缺血再灌注后Notch信號(hào)通路被激活。Notch信號(hào)通路被激活后，對(duì)影響NSCs增殖分化的報(bào)道不相一致：有人認(rèn)為，Notch信號(hào)通路抑制后，NSCs進(jìn)入分化程序；也有人認(rèn)為，Notch信號(hào)通路激活后，NSCs進(jìn)入增殖程序。益氣活血方和補(bǔ)腎生髓方能降低Nurr1、SMO mRNA或蛋白表達(dá)。因此認(rèn)為Notch信號(hào)通路Nurr1、SMO mRNA及其蛋白表達(dá)可被這兩種中藥復(fù)方抑制，進(jìn)而影響腦缺血再灌注后NSCs增殖分化，有利于修復(fù)損傷腦組織，但其具體分子作用機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

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Effects of Bushen Shengsui Prescription and Yiqi Huoxue Prescription on mRNA and Protein Expression of Nurr1 and SMO in Notch Signaling Pathway in Frontal and Parietal Cortex of Rats with Focal Cerebral Ischemia-Reperfusion

SONGZu-rong1,XUWei2,WANGJian2,HUJian-peng2

(1.SchoolofPharmaceuticalSciences,AnhuiXinhuaUniversity,AnhuiHefei230088,China; 2.KeyLaboratoryofXin’anMedicine,MinistryofEducation,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of Bushen Shengsui Prescription (for tonifying the kidney to regenerate bone marrow) and Yiqi Huoxue Prescription (for tonifying qi and activating blood circulation) on the mRNA and protein expression of Nurr1 and SMO in the Notch signaling pathway in the frontal and parietal cortex of rats with focal cerebral ischemia-reperfusion. MethodsA rat model of right middle cerebral artery occlusion and focal cerebral ischemia-reperfusion was established by suture method. The rats were randomly divided into sham-operation group, model group, Bushen Shengsui group, and Yiqi Huoxue group. The perfusion started at 2 hours after cerebral ischemia and lasted for 7 days. PCR and Western blot were used to measure the mRNA and protein expression of Nurr1 and SMO, respectively. ResultsCompared with the sham-operation group, the model group had significantly upregulated mRNA and protein expression levels of Nurr1 and SMO (P<0.05). Compared with the model group, the Yiqi Huoxue group and Bushen Shengsui group had significantly down-regulated mRNA and protein expression levels of Nurr1 and protein expression of SMO (P<0.05). The mRNA expression of SMO showed no significant differences between the model group, Yiqi Huoxue group, and Bushen Shengsui group (P>0.05). The protein expression levels of Nurr1 and SMO showed significant differences between the Yiqi Huoxue group and Bushen Shengsui group (P<0.05). ConclusionBushen Shengsui Prescription and Yiqi Huoxue Prescription can promote the repair of injured cerebral tissues, which is associated with its ability to down-regulate the mRNA and protein expression of Nurr1 and SMO in the Notch signaling pathway.

[Key words]Cerebral ischemia-reperfusion; Yiqi Huoxue Prescription; Bushen Shengsui Prescription; Notch signaling pathway

(收稿日期：2015-12-14；編輯：曹健)

[中圖分類號(hào)]R285.5[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.02.020

通信作者：胡建鵬， hujianpeng351@126.com

作者簡(jiǎn)介：宋祖榮(1977-)，女，碩士，講師

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAI26B01)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30973692)；安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2014A098)