兒茶中表兒茶素提取工藝研究

孫　黎，周　娟，徐自奧，李曉祥

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥　230012；2.合肥邁可羅生物工程有限公司，安徽 合肥　230071)

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·方藥研究·

兒茶中表兒茶素提取工藝研究

孫黎1，周娟2，徐自奧2，李曉祥2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥230012；2.合肥邁可羅生物工程有限公司，安徽 合肥230071)

[摘要]目的優(yōu)選兒茶中有效成分表兒茶素的提取工藝。方法以甲醇為流動(dòng)相A，以0.04 mol/L檸檬酸溶液-N,N-二甲基甲酰胺(45∶8)為流動(dòng)相B，在phenomenex C(18)柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)上進(jìn)行等度洗脫，容積比為15∶85。柱溫：35 ℃;流速：1.0 mL/min;檢測波長：280 nm;進(jìn)樣量20 μL。以干膏得率和表兒茶素提取率為考察指標(biāo)，考察提取溶劑、提取溫度、提取次數(shù)和提取時(shí)間等因素，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選最佳提取工藝。結(jié)果優(yōu)選工藝為藥材加10倍量甲基叔丁基醚，70 ℃回流提取2次，每次1.0 h。結(jié)論優(yōu)選所得的工藝穩(wěn)定可行，可作為兒茶中表兒茶素的提取工藝。

[關(guān)鍵詞]兒茶；表兒茶素；提取工藝；優(yōu)化

兒茶為傳統(tǒng)中藥，2010年版《中華人民共和國藥典》一部收載的兒茶為豆科植物兒茶Acaciacatechu(L.f.)Willd.去皮枝干的干燥煎膏[1]。中藥復(fù)方如兒茶配方顆粒[2]、復(fù)方兒茶止瀉膜劑[3]、茶黃酊[4]、跌打活血散[5]等中均含有兒茶?，F(xiàn)代藥理研究表明，兒茶中有效成分表兒茶素具有抗菌[6]、抗凋亡[7]、抗病毒[8]和抗氧化[9]等作用。目前文獻(xiàn)[10]主要關(guān)注于表兒茶素的含量測定，未對兒茶中表兒茶素的提取工藝進(jìn)行研究。本研究以干膏得率和表兒茶素提取率為檢測指標(biāo)，采用反相高效液相色譜法測定兒茶藥材中表兒茶素的含量，優(yōu)選了兒茶中表兒茶素的提取工藝，為進(jìn)一步的工業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器島津LC-20AD高效液相色譜儀：日本島津公司；HS10260D型超聲清洗器：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；BP211D型十萬分之一電子天平：德國賽多利斯公司；RE-52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；PHS-25型pH計(jì)：上海雷磁儀器廠。

1.2試藥表兒茶素(批號(hào) 110878-200102)對照品：由中國藥品生物制品檢定所提供。兒茶藥材：由安徽海鑫中藥飲片有限公司提供，產(chǎn)地云南，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院孟楣主任中藥師鑒定為豆科植物兒茶Acaciacatechu(L.f.)Willd的去皮枝干所得的干燥煎膏；甲醇為色譜純，甲基叔丁基醚、亞硫酸鈉、檸檬酸和N,N-二甲基甲酰胺：均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為超純水。

2方法和結(jié)果

2.1高效液相色譜法測定表兒茶素含量

2.1.1色譜條件以Phenomenex C18為色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以甲醇為流動(dòng)相A， 0.04 mol/L檸檬酸溶液-N,N-二甲基甲酰胺(45∶8)為流動(dòng)相B，按流動(dòng)相A-流動(dòng)相B(15∶85)的比例進(jìn)行等度洗脫；柱溫35 ℃，檢測波長280 nm，進(jìn)樣量20 μL，流速1.0 mL/min。

2.1.2色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)在上述色譜條件下，取兒茶素提取物固體粉末適量，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，兒茶提取物中表兒茶素與其他組分色譜峰可實(shí)現(xiàn)基線分離且無干擾，理論塔板數(shù)以表兒茶素計(jì)大于6 000。對照品和兒茶提取物的色譜圖見圖1。

2.1.3對照品溶液的制備及線性關(guān)系精密稱取表兒茶素對照品4.3 mg，加甲醇溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度為172.0 μg/mL的對照品貯備液，置4 ℃冰箱中冷藏備用。分別取表兒茶素對照品貯備液2.5、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 μL注入液相色譜儀，以表兒茶素的峰面積積分值(y)為縱坐標(biāo)，濃度(x)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，表兒茶素的線性回歸方程分別為：y=180.83x+1.687，R2=0.999 9。結(jié)果表明，表兒茶素進(jìn)樣量在0.43～8.6 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.4供試品溶液的制備及測定精密稱取兒茶提取物固體粉末12.5 mg，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液20 μL注入液相色譜儀，記錄表兒茶素的峰面積。按表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品線性方程計(jì)算提取物中表兒茶素含量。

圖1表兒茶素對照品(A)和兒茶提取物(B)的高效液相色譜圖

2.2單因素提取工藝的考察

2.2.1提取溶劑的選擇取兒茶藥材4份，每份10.0 g，分別加入乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷和甲基叔丁基醚4種極性由強(qiáng)到弱的溶劑200 mL，浸漬30 min，在N2保護(hù)下，70 ℃加熱回流提取1.0 h，過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋去濾液中溶劑，將所得黏稠物傾入蒸發(fā)皿，真空干燥至恒質(zhì)量，得固體無定形粉末。按“2.1.4”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，注入液相色譜儀，根據(jù)峰面積計(jì)算表兒茶素提取率，結(jié)果見表1。

表1　提取溶劑對表兒茶素提取率的影響

由表1可知，在4個(gè)不同極性溶劑(乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷和甲基叔丁基醚)中，強(qiáng)極性乙醇提取出的成分最少，干膏得率僅為5.4%，對表兒茶素的提取率也較低，僅為31.1%。而弱極性甲基叔丁基醚提取出的成分最多，干膏得率為22.1%，表兒茶素的提取率也最高，為47.7%。從外觀上觀察，藥材采用乙醇及甲基叔丁基醚提取獲得的產(chǎn)品均為淡紅色粉末，且?guī)в幸欢ǔ潭鹊墓鉂?；而采用乙酸乙酯及二氯甲烷提取后的提取物均為淡褐色粉末，有顆粒感，光澤較差，因此選擇兒茶藥材的提取溶劑為甲基叔丁基醚。

2.2.2提取溫度的選擇取兒茶藥材3份，每份10.0 g，均加入甲基叔丁基醚200 mL，浸漬30 min，在N2保護(hù)下，分別在60 ℃、70 ℃及90 ℃水浴中回流提取1.0 h，過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋去濾液中溶劑，將所得黏稠物傾入蒸發(fā)皿，真空干燥至恒質(zhì)量，得固體無定形粉末。按“2.1.4”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，注入液相色譜儀，根據(jù)峰面積計(jì)算表兒茶素提取率，結(jié)果見表2。表明兒茶藥材在90 ℃提取干膏得率最高，但對表兒茶素的提取與70 ℃相比有所下降，且提取物顏色與70 ℃相比也較深，顯示在90 ℃環(huán)境下提取其終產(chǎn)品雜質(zhì)含量較高，因此初步選擇70 ℃為兒茶藥材的提取溫度。

表2　提取溫度對甲基叔丁基醚提取

2.3正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝在單因素考察實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇料液比(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)和提取次數(shù)(D)為考察因素，按L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)，對兒茶藥材的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。因素水平見表3。該正交試驗(yàn)以干膏得率和表兒茶素提取率為檢測指標(biāo)，并輔以提取物外觀色澤等考察因素，采用綜合評分法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表4。綜合得分=干膏得率×30%+表兒茶素提取率×70%。對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5。

表3　L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表

表4　 L9 (34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表5　正交試驗(yàn)方差分析表

由上述極差分析結(jié)果可知，各因素對實(shí)驗(yàn)的影響程度大小順序?yàn)锳>D>B>C；由方差分析結(jié)果可知，提取次數(shù)對表兒茶素提取率影響最大。結(jié)合工藝成本考慮，確定表兒茶素的最佳提取工藝為A2B2C2D2，即藥材加入10倍量甲基叔丁基醚，浸漬30 min，在N2保護(hù)下，70 ℃加熱回流提取2次，每次1.0 h。

2.4驗(yàn)證試驗(yàn)根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果所得最佳工藝條件，分別提取3批兒茶藥材進(jìn)行驗(yàn)證，具體操作：取兒茶藥材約200 g，加入10倍量的甲基叔丁基醚，浸漬30 min，在N2保護(hù)下，70 ℃加熱回流提取1.0 h，過濾，將濾渣加入約10倍量的甲基叔丁基醚，在N2保護(hù)下，70 ℃加熱回流繼續(xù)提取1.0 h，過濾，合并兩次濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋去濾液中溶劑，將所得黏稠物傾入蒸發(fā)皿，真空干燥至恒質(zhì)量，得固體無定形粉末，同法制備3份。以干膏得率和表兒茶素提取率為檢測指標(biāo)，并輔以提取物外觀色澤等考察因素，對該提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，采用該工藝提取的兒茶藥材中表兒茶素各項(xiàng)指標(biāo)良好。結(jié)果見表6。

表6　表兒茶素提取工藝驗(yàn)證結(jié)果

3討論

為尋找合理可行的兒茶中表兒茶素提取工藝條件，筆者首先進(jìn)行了提取溶劑與提取時(shí)間的單因素考察。在對提取溶劑的考察中，選取了4種不同極性溶劑(乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷和甲基叔丁基醚)，其中極性最強(qiáng)的乙醇提取出的表兒茶素得率最少；弱極性的甲基叔丁基醚提取出的表兒茶素得率最高，顯示甲基叔丁基醚可實(shí)現(xiàn)對兒茶中的表兒茶素進(jìn)行選擇性提取。這可能是由于醚類溶劑與表兒茶素易產(chǎn)生氫鍵作用，且表兒茶素分子中也存在醚鍵結(jié)構(gòu)，符合相似相溶原理所致。因此選擇甲基叔丁基醚為表兒茶素的提取溶劑。而在對提取溫度的考察中，溫度越高越有利于表兒茶素的提取，但升至90 ℃時(shí)，雖然干膏得率最高，但也伴隨著表兒茶素提取率的下降，產(chǎn)品外觀也呈淡褐色，缺少光澤，考慮工業(yè)化提取的經(jīng)濟(jì)能耗，70 ℃較適宜于表兒茶素的提取。

筆者從料液比、提取次數(shù)、提取時(shí)間和提取溫度4個(gè)因素入手，運(yùn)用4因素3水平的正交設(shè)計(jì)及高效液相色譜分析手段，以干膏得率和表兒茶素提取率為分析指標(biāo)，探索出兒茶中表兒茶素的最佳提取工藝條件。并對最佳工藝進(jìn)行了3批次的驗(yàn)證，結(jié)果顯示對兒茶中表兒茶素的提取重現(xiàn)性良好，各項(xiàng)指標(biāo)符合要求。

雖然筆者能獲得較高的提取率，但粗產(chǎn)品中均含有一定量雜質(zhì)，造成產(chǎn)品純度不高，為表兒茶素的后期藥理實(shí)驗(yàn)帶來不便。因此筆者采用通用的柱層析方法對表兒茶素進(jìn)行純化，洗脫程序如下：將干膏粉適量干法上硅膠柱，先以石油醚-乙酸乙酯(15∶1)洗脫3倍柱體積，再將洗脫液的容積比更換為10∶1，洗脫4倍柱體積，接著將洗脫劑的容積比更換2∶1，洗脫2倍柱體積，最后開始收集洗脫液，旋去溶劑后，真空干燥至恒質(zhì)量，得淡粉色粉末。產(chǎn)品用甲醇溶解后，經(jīng)高效液相色譜法分析，表兒茶素純度可達(dá)98%。

綜上所述，本研究通過優(yōu)化獲得兒茶中表兒茶素的最佳提取工藝條件為：在70 ℃水浴中，按料液比1∶10加入溶劑甲基叔丁基醚，共提取2次，每次1.0 h。筆者采用柱層析手段獲得了高純度的表兒茶素樣品，為工業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Optimization of Extraction Process for Epicatechin in Catechu

SUNLi1,ZHOUJuan2,XUZi-ao2,LIXiao-xiang2

(1.SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 2.HefeiMicrobiologicalEngineeringCo.,Ltd.,AnhuiHefei230071,China)

[Abstract]ObjectiveTo optimize the extraction process for epicatechin, which is an effective component of Acacia catechu (L.) Wild. MethodsWith methanol as mobile phase A and 0.04 mol/L citric acid solution-N, N-dimethylformamide (V/V=45∶8) as mobile phase B, isocratic elution was performed on the phenomenex C(18) column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) at a volume ratio of 15∶85, a column temperature of 35 ℃, a flow rate of 1.0 mL/min, a detection wavelength of 280 nm, and a sample volume of 20 μL. Dry extract yield and the extraction rate of epicatechin were selected as the assessment indices to determine the optimized process (extraction solvent, extraction temperature, times of extraction, and extraction duration) by an orthogonal test. ResultsIn the optimized process, catechu was mixed with methyl tertiary butyl ether (10 times), and reflux extraction was performed at 70 ℃ twice (1 h each time). ConclusionThe optimized process is stable and feasible and can be used as the extraction process for epicatechin in Acacia catechu (L.) Wild.

[Key words]Acacia catechu (L.) Wild; Epicatechin; Extraction process; Optimization

(收稿日期：2015-11-19；編輯：曹健)

[中圖分類號(hào)]R284.2[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.02.025

通信作者：李曉祥，45871118@qq.com

作者簡介：孫黎(1981-)，女，碩士，講師

基金項(xiàng)目：安徽省對外合作科技項(xiàng)目(1403062024)；安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1508085QH194)