海南黎藥毛黃肉楠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的初步研究△

譚小玉

(海南省藥物研究所，海南 ?？?570311)

海南黎藥毛黃肉楠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的初步研究△

譚小玉*

(海南省藥物研究所，海南 海口 570311)

目的：初步研究了海南黎藥毛黃肉楠的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：對毛黃肉楠進(jìn)行化學(xué)成分預(yù)試驗(yàn)，采用紫外-可見分光光度法測定毛黃肉楠枝干中總黃酮含量，并對其水分、灰分和浸出物進(jìn)行測定。結(jié)果：初步明確了毛黃肉楠化學(xué)成分類型，建立總黃酮含量測定紫外分光光度法，以蘆丁為對照品，測定波長為506nm，回歸方程為Y=12.08580X-0.01610(r2=0.9999)，在0.003～0.077mg/mL線性關(guān)系良好，平均回收率為100.16%(RSD1.29%，n = 6)；并確定了毛黃肉楠枝干水分、總灰分和浸出物的限量。結(jié)論：所建立方法簡便、快捷、準(zhǔn)確，可為毛黃肉楠藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

毛黃肉楠；總黃酮；含量測定；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

毛黃肉楠(Actinodaphne pilosa (Lour.) Merr.) 系樟科(Lauraceae)黃肉楠屬植物。毛黃肉楠具有凈化大氣污染的作用，多作為行道樹、綠化樹、生態(tài)公益林等在城市進(jìn)行栽培[1]。在海南，黎族人民將毛黃肉楠枝干作為民間驗(yàn)方的組成之一，這已經(jīng)有很長的使用歷史。毛黃肉楠又稱茶膠樹、刨花、膠木等，文獻(xiàn)記載毛黃肉楠具有祛風(fēng)、消腫、散瘀、解毒、止咳之效，并能治瘡癤，對跌打亦有效[2]。有文獻(xiàn)采用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對毛黃肉楠葉片揮發(fā)油成分進(jìn)行分析，鑒定出75種揮發(fā)性化合物[3]，而枝干的成分分析未見報道。目前對毛黃肉楠的研究甚少，尚無其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的文獻(xiàn)報道，這極大地限制了毛黃肉楠藥材的開發(fā)利用。本文通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，擬從化學(xué)成分預(yù)試驗(yàn)、總黃酮含量測定、水分、灰分、浸出物等方面進(jìn)行分析研究，按2015版《中華人民共和國藥典》的方法和要求規(guī)范制定毛黃肉楠的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以促進(jìn)海南黎藥毛黃肉楠的開發(fā)使用。

1 儀器與材料

1.1 儀器：島津UV-2401PC紫外分光光度計，島津AUW220D電子天平，DHG-9203A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，SXZ-4-10N型箱式電阻爐(上海一恒科技有限公司)，萬能電子爐， SK250HP型超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)，XMTE-8112型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 藥材：毛黃肉楠采自海南五指山地區(qū)，經(jīng)海南大學(xué)黃世滿教授鑒別為樟科植物毛黃肉楠Actinodaphne pilosa (Lour.) Merr.的枝干。

1.3 試劑：蘆丁對照品(批號 100080-201408，中國藥品生物制品檢定所)；其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 化學(xué)成分預(yù)試驗(yàn)[4]

2.1.1 水提取液的制備及結(jié)果：取毛黃肉楠粉末2g，置錐形瓶中，加入50mL超純水，于50～60℃水浴中溫浸1h，濾過，濾液供檢識備用。經(jīng)Molish反應(yīng)陽性，表明可能含有糖、多糖或苷類物質(zhì)；三氯化鐵-鐵氰化鉀、明膠-氯化鈉反應(yīng)均陽性，表明可能含有鞣質(zhì)；香草醛-鹽酸反應(yīng)陽性，表明可能含有間苯二酚和間苯三酚結(jié)構(gòu)的化合物。

2.1.2 石油醚提取液的制備及結(jié)果：取1g毛黃肉楠粉末，加10mL石油醚，室溫下浸漬提取2～3h，濾過，濾液供檢識備用。油斑試驗(yàn)中，濾紙上未留下油斑表明本品可能不含有油脂或揮發(fā)油。

2.1.3 乙醇提取液的制備及結(jié)果：取毛黃肉楠粉末0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%乙醇20mL，超聲提取2次，每次60min，濾過，合并濾液，水浴蒸干，殘渣加適量75%乙醇溶解轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加75%乙醇定容至刻度，即得乙醇提取液，用于黃酮類成分預(yù)試驗(yàn)。系列顏色反應(yīng)結(jié)果(見表1)均可表明，毛黃肉楠中存在黃酮類化合物。

表1 黃酮類成分預(yù)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)結(jié)果

2.2 含量測定方法學(xué)研究

2.2.1 對照品溶液的制備： 取干燥的蘆丁對照品12mg，精密稱定，置50mL量瓶中，加75%乙醇溶解，并定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.2414mg/mL的蘆丁對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備：取毛黃肉楠粉末0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%乙醇20mL，于水浴中保持微沸回流提取2次，每次60min，濾過，合并濾液，水浴蒸干，殘渣加適量75%乙醇溶解轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加75%乙醇定容至刻度，得待測供試品溶液。

2.2.3 顯色方法[5]：精密移取待測液1mL，置25mL量瓶中，加5%NaNO2溶液1mL，搖勻，放置6min，加10%Al(NO3)31mL，搖勻，放置6min，加4%NaOH溶液4mL，加水定容至刻度，搖勻，放置15min，以75%乙醇溶液1mL加顯色劑用水定容為空白，測定。

2.2.4 測定波長的選擇： 取對照品溶液及供試品溶液按2.2.3項下顯色方法加入顯色劑，以相應(yīng)溶劑為空白，于400～700nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。發(fā)現(xiàn)兩者最大吸收波長均在506nm左右，故選定檢測波長為506nm。

2.2.5 線性關(guān)系考察： 精密量取蘆丁對照品溶液0.3，0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0mL，分別置25mL量瓶中，按2.2.3項下顯色方法加入顯色劑，以相應(yīng)溶劑為空白，于506nm波長處測定。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=12.08580X-0.01610(r2=0.9999)，表明蘆丁在0.003～0.077mg/mL呈良好線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗(yàn)： 精密量取對照品溶液4mL，置于25mL量瓶中，按顯色方法加入顯色劑，以相應(yīng)溶劑為空白，于506nm處測定吸光度，重復(fù)測定6次，記錄吸光度值，RSD 0.14%，結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.2.7 顯色穩(wěn)定性試驗(yàn)： 精密量取供試品溶液1mL，置25mL量瓶中，按顯色方法加入顯色劑，以相應(yīng)溶劑為空白，于506nm處測定吸光度，每隔5min掃描1次，記錄30min內(nèi)供試品溶液的吸光度值，結(jié)果表明該供試品溶液顯色后放置15min達(dá)到穩(wěn)定，30min內(nèi)RSD 1.50%。結(jié)果見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn)： 精密稱取同一份樣品粉末共6份，每份0.5g，精密稱定，平行按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.3項下顯色方法加入顯色劑，在506nm標(biāo)準(zhǔn)曲線下測定吸光度，并計算含量和RSD值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好，RSD 2.13%。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn)： 取同一份已知含量的樣品粉末共6份，各0.25g，精密稱定，分別精密加入蘆丁對照品6.095mg，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，精密移取供試品溶液1mL，按2.2.3項下顯色方法加入顯色劑，顯色后于506nm標(biāo)準(zhǔn)曲線下測定，記錄吸光度值，計算回收率。試驗(yàn)結(jié)果平均回收率為 98.10%，RSD 1.57%。結(jié)果見表3。

表3 毛黃肉楠蘆丁加樣回收率

3 樣品測定

準(zhǔn)確稱取毛黃肉楠枝干粉末，每個樣3個重復(fù)，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，精密移取供試品溶液1mL，按2.2.3項下顯色方法，參照蘆丁線性回歸方程，測得毛黃肉楠枝干總黃酮含量。結(jié)果見表4。

表4 毛黃肉楠總黃酮含量結(jié)果

4 檢查

按《中華人民共和國藥典》2015版四部通則0832第二法(烘干法)、通則2302、通則2201對采集的毛黃肉楠枝干水分、總灰分和浸出物進(jìn)行測定。結(jié)果如下(表5)：水分測定結(jié)果為10.31%～11.06%；總灰分測定結(jié)果為3.92%～5.03%；水溶性浸出物的測定結(jié)果為4.99%～5.97%；醇溶性(溶劑為95%乙醇)浸出物的測定結(jié)果為3.49%～4.60%。

表5 毛黃肉楠水分、總灰分、浸出物測定結(jié)果(n=3)

5 討論

5.1 通過化學(xué)成分預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，毛黃肉楠中可能含有糖、多糖或苷類物質(zhì)、鞣質(zhì)、間苯二酚和間苯三酚結(jié)構(gòu)的化合物。根據(jù)系列顏色反應(yīng)表明，毛黃肉楠中存在黃酮類化合物。

5.2 通過對比冷浸提取法、超聲提取法和回流提取法，根據(jù)提取效果，回流法更適宜作為該藥材總黃酮含量測定的提取方法。以蘆丁為對照，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色反應(yīng)體系，采用紫外-可見分光光度法測定毛黃肉楠中總黃酮的含量，結(jié)果表明該方法具有操作簡單，測定快速，對儀器要求不高等優(yōu)點(diǎn)。

5.3 Al(NO3)3比色法常用于總黃酮的含量測定，原理是在堿性條件下，可與黃酮形成紅色螯合物為特征。進(jìn)行比色法測量時，要注意考察吸光度值的穩(wěn)定性，在NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系中，堿性條件經(jīng)常會影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性[6]。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，在穩(wěn)定性試驗(yàn)中，供試品溶液顯色后放置15min測定吸光度較穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)中吸光度值呈減小趨勢，可能因黃酮在堿性條件下與鋁離子形成的絡(luò)合物時間長不穩(wěn)定，易分解有關(guān)，測定過程中應(yīng)注意顯色后及時測定，避免造成實(shí)驗(yàn)誤差。

5.4 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步擬定擬定毛黃肉楠(枝干)水分不得超過13.0%；總灰分不得超過6.0%；水溶性浸出物含量不得低于4.0%，醇溶性(溶劑乙醇)浸出物含量不得低于3.0%。

目前，對毛黃肉楠的藥用價值探索仍處于初級階段，更完善的質(zhì)量控制方法需要后續(xù)進(jìn)一步的研究。

[1]孔國輝,陳宏通,劉世忠,等.廣東園林綠化植物對大氣污染的反應(yīng)及污染物在葉片的積累[ J] .熱帶亞熱帶植物學(xué)報,2003, 11(4):297-315.

[2] 中國科學(xué)院中國植物志編寫委員會.中國植物志第31卷[M].北京:科學(xué)出版社,1982:256.

[3] 馮志堅,李文鋒,陳秀娜,等.毛黃肉楠揮發(fā)油成分分析[J].廣東林業(yè)科技,2009,25(3):25-28.

[4] 王薇.中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].陜西:陜西科學(xué)技術(shù)出版社,2014.

[5] 馬雯芳,鄧慧連,蔡毅,等.冰糖草總黃酮含量測定及顯色方法優(yōu)化[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(3):112-115.

[6] 馬陶陶,張群林,李俊.中藥總黃酮的含量測定方法[J].安徽醫(yī)藥,2007,11(1):1030-1032.

2016年7月6日收稿

Preliminary Study on Quality Standards of Hainan Li Folk MedicineActinodaphnepilosa(Lour.) Merr.

TAN Xiao-yu

Pharmaceutical institute of Hainan Province, Haikou Hainan 570311 China

Objective: To study quality standards forActinodaphnepilosa(Lour.) Merr.Method: Preliminary tests for chemical constituents ofActinodaphnepilosa(Lour.) Merr. was performed. Total flavonoids were determined by ultraviolet spectrophotometry(UV). Determination of moisture, total ash and extractives were studies based on Chinese Pharmacopoeia published in 2015. Result: Its chemical constituents were determined. Limit of moisture, total ash and extractives inActinodaphnepilosa(Lour.) Merr. were determined. A quantitative method for the determination of total flavonoids by UV was established, using rutin as comparison sample, the detection wave length was set at 506nm. The standard curve of total flavonoids was linear in the range of 0.003～0.077mg/mL (r2=0.9999) and its average recovery ratio was 100.16 %( RSD 1.29%). Conclusion: The method simple, rapid and accurate can be used for the quality standards ofActinodaphnepilosa(Lour.) Merr.

Actinodaphnepilosa(Lour.) Merr.; total flavonoids ; quantitative method ; quality standards

海南省中藥現(xiàn)代化專項——海南黎族特色抗炎止血藥物院內(nèi)制劑的研究開發(fā)(項目編號ZY201420)

譚小玉(1989-)，女，本科學(xué)士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事海南黎藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究方向。E-mail：tan_xiaoyu@126.com。

*通訊作者：譚小玉(1989-)，女，本科學(xué)士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事海南黎藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究方向。E-mail：tan_xiaoyu@126.com。

R298.1

B

1006-6810(2016)11-0050-03