七氟醚對(duì)大鼠急性肺損傷NF-кB活性的影響及肺保護(hù)作用△

傅艷妮　胡楚文　劉　玲　紀(jì)風(fēng)濤（中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院　廣州510120）

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七氟醚對(duì)大鼠急性肺損傷NF-кB活性的影響及肺保護(hù)作用△

傅艷妮胡楚文劉玲紀(jì)風(fēng)濤*（中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院廣州510120）

摘要：目的：應(yīng)用大鼠酸吸入急性肺損傷模型，在酸吸入損傷后早期吸入七氟醚，觀察對(duì)大鼠急性肺損傷NF-кB活性的影響及肺保護(hù)作用。方法：隨機(jī)將SD大鼠分為5組（n=16），生理鹽水組：氣管內(nèi)注入生理鹽水1mL/kg；鹽酸吸入組：氣管內(nèi)注入pH=1.25鹽酸溶液1mL/kg；七氟醚處理組：氣管內(nèi)注入鹽酸溶液，并分為3個(gè)亞組（七氟醚0．5h組，七氟醚1h組，七氟醚2h組），分別在給予鹽酸溶液1h后，吸入2．4%七氟醚0．5h、1h、2h。于注入生理鹽水或稀鹽酸5h后處死各組大鼠，檢測(cè)肺組織NF-кB活性及肺泡灌洗液中TNF-a、IL-6和IL-10的濃度。結(jié)果：與生理鹽水組比較，鹽酸吸入組肺組織NF-кB/p65陽(yáng)性細(xì)胞增多（P＜0.01），七氟醚處理1h與2h后陽(yáng)性細(xì)胞較鹽酸吸入組減少（P＜0．05）；鹽酸吸入組肺泡灌洗液中TNF-a、IL-6和IL-10的濃度較對(duì)照組增高（P＜0.01），七氟醚處理1h與2h后，與鹽酸吸入組比較，TNF-a、IL-6的濃度降低（P＜0．05），IL-10的濃度無(wú)明顯改變。結(jié)論：七氟醚對(duì)酸吸入急性肺損傷可起部分保護(hù)作用，其機(jī)制與抑制NF-кB在大鼠肺組織中激活有關(guān)。

關(guān)鍵詞：七氟醚急性肺損傷NF-кB炎癥反應(yīng)

麻醉期間，酸性胃內(nèi)容物反流誤吸入肺是導(dǎo)致急性肺損傷的臨床常見(jiàn)原因之一。七氟醚是臨床最常用的含氟類揮發(fā)性吸入麻醉劑，揮發(fā)性麻醉藥物對(duì)機(jī)體影響及作用機(jī)制的研究多集中于腦、心、肝臟等臟器，對(duì)肺的影響研究較少。有研究顯示含氟類揮發(fā)性吸入麻醉劑對(duì)正常肺的影響并非有利[1]，但大量離體或整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，吸入七氟醚對(duì)心肌及腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，可有效減少心肌和腦的梗死體積，減輕細(xì)胞損傷，抑制或延緩細(xì)胞凋亡、壞死[2]。核因子-кB（NF-κB）存在于肺內(nèi)多種細(xì)胞中，NF-кB活化與肺部炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。本研究擬應(yīng)用大鼠酸吸入急性肺損傷模型，在酸吸入損傷后早期吸入七氟醚，觀察對(duì)大鼠急性肺損傷NF-кB活性的影響及肺保護(hù)作用。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：健康清潔級(jí)雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量220～250g（中山大學(xué)動(dòng)物中心提供）。隨機(jī)分為5組，每組16只。生理鹽水組：氣管內(nèi)注入生理鹽水1mL/kg；鹽酸吸入組：氣管內(nèi)注入pH=1.25鹽酸溶液1mL/kg；七氟醚處理組：氣管內(nèi)注入鹽酸溶液，分為3個(gè)亞組（七氟醚0．5h組，七氟醚1h組，七氟醚2h組），分別在給予鹽酸溶液1h后，吸入2．4%七氟醚0．5h、1h、2h。

1.2動(dòng)物模型及七氟醚處理：各組大鼠腹腔注射戊巴比妥40mg/kg麻醉，頸部正中切口，顯露并穿刺氣管，滴注生理鹽水1mL/kg或pH=1.25鹽酸溶液1mL/kg。1h后將七氟醚組大鼠放入自制密封箱，兩端各有一進(jìn)氣孔和出氣孔，底部鋪薄層鈉石灰，進(jìn)氣口與裝有七氟醚氣體揮發(fā)罐的麻醉機(jī)（美國(guó)歐米達(dá)公司）連接，設(shè)定載入氧氣濃度為40%，出氣口接麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀（美國(guó)歐米達(dá)公司），調(diào)整揮發(fā)罐和新鮮氣流至出氣口七氟醚（美國(guó)雅培制藥有限公司）濃度為2．4%，大鼠自主呼吸，分別吸入七氟醚0.5h、1h、2h。

1.3樣本制備：注入生理鹽水或稀鹽酸5h后，經(jīng)頸動(dòng)脈放血處死大鼠?？焖匍_(kāi)胸取出完整肺臟，結(jié)扎右支氣管，取大鼠右肺下葉，10%中性甲醛固定后，石蠟包埋，4μm切片免疫組化染色。4℃生理鹽水灌洗左肺，收集肺泡灌洗液，離心取上清液-80℃保存，ELISA法檢測(cè)肺泡灌洗液中腫瘤壞死因子-a（TNF-a）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白細(xì)胞介素-10（IL-10）的濃度。

1.4結(jié)果判定：采用即用型超敏S-P免疫組化試劑盒（福州邁新公司）測(cè)定NF-кB的活性，抗p65單克隆抗體與NF-кB亞單位p65區(qū)域結(jié)合。正常情況下此結(jié)合區(qū)域被NF-кB抑制蛋白IкB覆蓋，抗p65單克隆抗體不能與之結(jié)合，只有當(dāng)IкB釋放后，才能結(jié)合，故該抗體能夠原位檢測(cè)到NF-кB的活化。ELISA法檢測(cè)肺泡灌洗液中TNF-a、IL-6和IL-10的濃度。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，多組兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況：5組大鼠體重、雌雄分布無(wú)顯著差異（P＞0．05）。大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)一死亡。

2.2肺組織NF-кB/p65陽(yáng)性細(xì)胞率：與生理鹽水組比較，鹽酸吸入組及七氟醚處理組，肺組織NF-кB/p65陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與鹽酸吸入組比較，七氟醚處理1h與2h陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少（P＜0．05），七氟醚處理0.5h無(wú)明顯差異（P＞0．05），見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠肺組織NF-кB陽(yáng)性細(xì)胞率比較（n）

2.3肺泡灌洗液中TNF-a、IL-6和IL-10的含量：與生理鹽水組比較，鹽酸吸入組及七氟醚處理組，肺泡灌洗液中TNF-a、IL-6 和IL-10的濃度明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與鹽酸吸入組比較，七氟醚處理1h與2h TNF-a、IL-6的濃度明顯降低（P＜0．05），七氟醚處理0.5h無(wú)明顯差異（P＞0．05）；IL-10的濃度無(wú)明顯改變，見(jiàn)表2。

表2　肺泡灌洗液中TNF-a、IL-6和IL-10的含量（pg/ml，n=16，±s）

表2　肺泡灌洗液中TNF-a、IL-6和IL-10的含量（pg/ml，n=16，±s）

△：與對(duì)照組比較：P＜0.01；▲：與鹽酸吸入組比較P＜0.05。

生理鹽水組　鹽酸吸入組　七氟醚處理0.5h七氟醚處理1h七氟醚處理2h TNF-a 48.35±12.18 273.41±31.22△261.12±34.12△227.31±29.33△▲197.46±22.13△▲IL-6　 55.67±17.23 312.58±28.96△306.71±32.98△274.39±27.43△▲233.54±25.72△▲IL-10　 37.92±6.53　 219.64±19.25△207.24±26.41△199.75±23.37△　201.68±30.63△

3　討論

七氟醚因?qū)粑来碳ば孕?，不易引起氣道痙攣，起效迅速，蘇醒快，是臨床最常用的含氟類揮發(fā)性吸入麻醉劑。肺是揮發(fā)性吸入麻醉藥物首先直接作用部位，有研究顯示，正常肺臟吸入1.5MAC七氟醚2h后，某些促炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)增加，但肺臟濕/干重比沒(méi)有明顯改變，病理學(xué)變化輕微，沒(méi)有出血、水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[1]。但大量離體或整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示，七氟醚對(duì)心肌及腦缺血再灌注損傷等有保護(hù)作用，可有效減少心肌和腦的梗死體積，減輕細(xì)胞損傷，抑制或延緩細(xì)胞凋亡壞死。

本實(shí)驗(yàn)于大鼠氣道內(nèi)注入鹽酸溶液，模擬急性肺損傷模型，并于損傷早期吸入1MAC七氟醚，并維持不同時(shí)長(zhǎng)。本研究結(jié)果顯示急性肺損傷肺組織NF-кB/p65陽(yáng)性細(xì)胞率較生理鹽水組明顯增高，七氟醚處理1h與2h后陽(yáng)性細(xì)胞顯著減少。NF-кB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)調(diào)控參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)、粘附分子及蛋白酶類的基因轉(zhuǎn)錄在炎癥反應(yīng)中起重要作用。NF-κB存在于肺內(nèi)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等免疫反應(yīng)細(xì)胞中。許多炎癥介質(zhì)如IL-1，IL-6，TNF-a，GM-CSF等都受NF-кB活化調(diào)控，與肺部炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。激活的NF-кB可增強(qiáng)TNF-a、IL-6等眾多細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，使炎癥細(xì)胞合成炎癥因子的時(shí)間縮短和數(shù)量增加[3]。因此，NF-KB是核內(nèi)炎性遞質(zhì)基因轉(zhuǎn)錄的開(kāi)關(guān)，阻斷NF-кB活化，可減少炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，減輕炎癥介質(zhì)對(duì)肺的損傷。

TNF-a是炎癥反應(yīng)和急性肺損傷過(guò)程中最早釋放的細(xì)胞因子，主要由單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，為炎癥反應(yīng)中重要啟動(dòng)因子，并受NF-кB活化調(diào)控。IL-6由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等在攝取抗原抗體復(fù)合物后或在抗原呈遞過(guò)程中產(chǎn)生。TNF-a和IL-6釋放，激活炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)細(xì)胞因子、脂性遞質(zhì)及活性氧簇；還可上調(diào)細(xì)胞黏附分子，最終促使炎性細(xì)胞浸潤(rùn)到組織內(nèi)[4]。

本實(shí)驗(yàn)中，急性肺損傷大鼠經(jīng)七氟醚處理，肺泡灌洗液中TNF-a和IL-6濃度升高被抑制，提示七氟醚通過(guò)降低TNF-a 和IL-6濃度減輕肺部炎癥反應(yīng)。七氟醚處理組灌洗液中TNF-a 和IL-6濃度與對(duì)照組比較仍升高，表明七氟醚處理不能完全抑制炎癥反應(yīng)，但可起部分保護(hù)作用。IL-10是一種多功能炎癥反應(yīng)負(fù)性調(diào)節(jié)因子，能夠參與免疫細(xì)胞、炎癥細(xì)胞等多種細(xì)胞生物調(diào)節(jié)，主要作用是抑制促炎細(xì)胞因子釋放[5]。本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到七氟醚處理后肺泡灌洗液中IL-10濃度無(wú)明顯變化，可能與七氟醚發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用使抗炎細(xì)胞因子與促炎細(xì)胞因子保持平衡有關(guān)。

綜上所述，七氟醚雖不能完全抑制鹽酸溶液所致急性肺損傷炎癥反應(yīng)，但可起部分保護(hù)作用，其機(jī)制可能與七氟醚抑制NF-кB在大鼠肺組織中激活，從而減少炎癥介質(zhì)釋放，減輕炎癥反應(yīng)對(duì)肺損傷有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[1]Kotain N，Hashimoto H，Sessler DI，et al．Expression of genes forproinflammatory cytokines in alveolar macrophages during propofol and isoflurane anesthesia．Anesth Analg，1999，89：1250-1256.

[2]Suter D，Spahn DR，Blumenthal S，et al. The immunomodulatory effect of sevoflurane in endotoxin-injured alveolar epithelial cells. Anesth Analg，2007，104（3）：638-645.

[3]Wissel H，Schulz C，Koehne P .Chlamydophila pneumoniae induces expression of Toll-like Receptor 4 and release of TNF-α and MIP-2 via an NF-κB pathway in rat typeⅡpneumocytes. Respir Res，2005，6:51.

[4]Sharma AK，F(xiàn)ernandez LG，Awad AS. Proinflammatory response of alveolar epithelial cells is enhaneed by alveolar macmphageproduced TNF-alpha during pulmonary ischemiareperfusion injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2007，293:L105-113.

[5]Cavaillon Jm，Adrie C，F(xiàn)itting C，et a1．Reprogramming of circulatory cells in sepsis and SIRS．J Endotoxin Res，2005，11（5）：311-320．

Effects of sevoflurane on hydrochloric acid aspiration induced acute lung injury in rats

Fu Yanni Hu Chuwen Liu Ling Ji Fengtao*（SunYat—Sen Memorial Hosital，SunYat—Sen University，Guangzhou 510120）

Abstract：Objective：To observe the effect of sevoflurane on hydrochloric acid aspiration induced acute lung injury in rats. Methods：80 rats were randomly divided into 5 groups（n=15）：NS group，HCL group，NS（1mL/kg）or HCL（1mL/kg）was instilled in rats airway．Sevoflurane groups（Sevo 0.5 h group，Sevo 1 h group，Sevo 2 h group）：One hour after HCL instillation，rats received 2.4%sevoflurane inhalation respectively for thirty minutes，one hour or two hours．Five hours after NS or HCL instillation，all groups were exsanguinated．The nurmber of NF-кB positive cells in lung tissue and the concentration of TNF-a，IL-6，IL-10 in BALF were measured. Results：book=113,ebook=120Compared with the NS group，after HCL instillation，the nurmber of NF-кB positive cells and the concentration of TNF-a，IL-6，IL-10 in BALF significantly increased（P＜0．01）. Compared with the HCL group，in sevoflurane groups（Sevo 1 h group and Sevo 2 h group），the nurmber of NF-кB positive cells and the concentration of TNF-a，IL-6 in BALF decreased（P＜0．05）. Conclusion：Sevoflurane could attenuate lung inflammation in rats with hydrochloric acid induced acute lung injury，inhibit activity of NF-кB and possess potential protective effects．

Key words：Sevoflurane Acute lung injury NF-кB Inflammation

*通訊作者

基金項(xiàng)目：△廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金（A2013206）

中圖分類號(hào)：R614

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1672-8351（2016）04-0112-03