雞抗血清3型鴨甲型肝炎血清的制備與初步應(yīng)用

孫慶歌，劉丹，肖愛芳，李晶梅，祝春花，李 建，朱薇，廖園園，漆世華，謝紅玲*

(1.武漢中博生物股份有限公司，湖北 武漢 430070；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

雞抗血清3型鴨甲型肝炎血清的制備與初步應(yīng)用

孫慶歌1，劉丹2，肖愛芳1，李晶梅1，祝春花1，李 建1，朱薇1，廖園園1，漆世華1，謝紅玲1*

(1.武漢中博生物股份有限公司，湖北 武漢 430070；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

通過使用血清3型鴨甲型肝炎疫苗毒免疫SPF雞，制備血清3型鴨甲型肝炎診斷用標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，對制備血清進(jìn)行無菌、支原體和特異性檢驗以及效價測定，并用該抗血清進(jìn)行鴨病毒性肝炎治療試驗。結(jié)果表明，該血清無菌檢驗合格，無支原體污染，特異性良好，無禽類常見13種外源病毒抗體，血清中和效價為10-2.8。發(fā)病雛鴨緊急治療保護(hù)率為91.67%,而與血清1型鴨甲型肝炎病毒（DHAV-1）無交叉保護(hù)。

血清3型鴨甲型肝炎病毒；抗血清；治療

鴨病毒性肝炎是危害雛鴨的一種高度致死性的病毒性傳染病。本病傳播迅速，病程短，死亡率可達(dá)90%以上，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來很大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。鴨病毒性肝炎的致病原，目前已經(jīng)研究的比較清楚，主要是由小RNA病毒科禽肝病毒屬3種不同基因型鴨甲型肝炎病毒和星狀病毒科禽星狀病毒屬的2種鴨星狀病毒引起[2]。根據(jù)文獻(xiàn)報道，我國國內(nèi)主要流行病毒株為DHAV-1，但DHAV-3在我國部分地區(qū)的商品鴨群中呈流行趨勢[3，4]。DHAV-1和DHAV-3不僅屬于不同的基因型，而且也是不同的血清型，兩種血清型無交叉反應(yīng)[5，6]。但該兩種血清病毒所引起的鴨病毒性肝炎病，在臨床癥狀和病理變化上極為相似，不借助實驗室檢測手段進(jìn)行鑒別診斷是十分困難的[7]。目前預(yù)防和控制鴨病毒性肝炎的主要手段是疫苗免疫接種和卵黃抗體治療。但近年來，不斷有免疫疫苗后仍然暴發(fā)鴨病毒性肝炎以及卵黃抗體無保護(hù)的臨床報道，考慮可能與致病原發(fā)生變異或者血清型不符等原因有關(guān)。

本研究通過用DHAV-3 B54株疫苗毒免疫SPF雞，制備一批DHAV-3標(biāo)準(zhǔn)抗血清，并對實驗條件下發(fā)病雛鴨的治療效果及與DHAV-1交叉保護(hù)情況進(jìn)行觀察?，F(xiàn)報告如下：

1 材料

1.1 病毒 DHAV-3致弱疫苗毒 （B54株）、DHAV-1（ATCC株）、鴨瘟疫苗株病毒（DPV），由武漢中博生物股份有限公司保存。

1.2 抗體ELISA檢測試劑盒 禽流感病毒(AIV)抗體、傳染性支氣管炎病毒(IBV)抗體、雞新城疫病毒（NDV）抗體、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）抗體、禽傳染性法氏囊病毒 (IBDV)抗體、雞貧血病毒(CAV)抗體、禽白血病病毒(ALV)抗體、禽腦脊髓炎病毒（AEV）抗體、禽呼腸孤病毒（REO）、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒(REV)抗體檢測試驗盒，均購自北京IEDXX公司。

1.3 檢測用抗原和抗體 減蛋綜合征病毒（EDS76）HA抗原，DHAV-1和DHAV-3鴨陽性血清及陰性血清均由武漢中博生物股份有限公司制備、鑒定和保存。

1.4 培養(yǎng)基 無菌檢驗培養(yǎng)基：硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（T.G），酪胨瓊脂培養(yǎng)基（G.A），葡萄糖蛋白棟培養(yǎng)基（G.P）；支原體培養(yǎng)基：改良 Frey氏固體和液體培養(yǎng)基，均購自北京海淀中海動物保健科技公司。

1.5 試驗動物 SPF雞3周齡，購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司；SPF鴨種蛋購自哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心；10日齡鴨胚和易感雛鴨，均購自武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所；10日齡SPF雞胚，用購自濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司SPF種蛋進(jìn)行自孵。

2 方法

2.1 抗血清的制備

2.1.1 免疫原的制備與純化 將DHAV-3 B54株種毒1:1000倍稀釋，尿囊腔接種10日齡SPF鴨胚，每胚0.1ml，置于37℃孵化箱繼續(xù)孵化，不必翻蛋。收集36～96h死亡鴨胚，無菌收集尿囊液。純化方法為： 將收獲的尿囊液裝入透析袋，用PEG20000進(jìn)行包埋濃縮處理，待體積濃縮至原體積的1/50時，10000r/min離心60min，取上清液，再在同樣條件下45000r/min離心150min，棄去上清，再加入等體積滅菌PBS，懸浮沉淀物，-20℃凍存?zhèn)溆肹8]。

2.1.2 免疫及采血 將濃縮后的DHAV-3經(jīng)肌肉注射途徑接種3周齡SPF雞10只，0.5ml/只，隔離器中飼養(yǎng)。14日后加強(qiáng)免疫一次，加強(qiáng)免疫后28日，經(jīng)心臟無菌采血，分離血清[9]。

2.2 細(xì)菌與霉菌檢測 按現(xiàn)行 《中國獸藥典》附錄第42頁進(jìn)行，將制備的混合血清分別接種T.G小管及G.A斜面各2支，每只0.2ml，分別各一支置 37℃和 25℃，另取 0.2ml接種 G.P小管，置25℃，均培養(yǎng)7d，觀察有無細(xì)菌和霉菌生長。

2.3 支原體檢驗 按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄49頁進(jìn)行檢測，將制備的混合血清取0.2ml移植接種于1小管液體培養(yǎng)基中，將小瓶與小管置37℃培養(yǎng)，同時設(shè)滑液支原體和滅菌生理鹽水作陽性和陰性對照。分別于接種后 5、10、15日進(jìn)行移植培養(yǎng)，觀察14日。在上述每次液體培養(yǎng)物移植小管培養(yǎng)的同時，取培養(yǎng)物0.2ml接種于支原體瓊脂平板固體培養(yǎng)基，置含5%～10%CO2潮濕的環(huán)境，37℃培養(yǎng)14日，觀察結(jié)果。

2.4 特異性檢測

2.4.1 中和試驗 將制備血清于 56℃水浴滅活30min，分別與 DHAV-1、DHAV-3及 DPV (100ELD50)等量混合。37℃感作 1h，感作后的DHAV-1和DHAV-3分別經(jīng)尿囊腔接種5枚10日齡鴨胚；感作后的DPV經(jīng)絨毛尿囊膜接種5枚10日齡SPF雞胚，每胚0.2ml，連續(xù)觀察7日，記錄胚死亡情況。

2.4.2 ELISA檢測 應(yīng)用 ELISA法檢測 AIV抗體、NDV抗體、IBV抗體、ILTV抗體、IBDV抗體、CAV抗體、AEV抗體、REO抗體、REV抗體、ALV抗體。具體操作方法參見IDEXX產(chǎn)品說明書。

2.4.3 HI方法檢測 應(yīng)用HI方法檢測所制備的抗血清中EDS76病毒抗體，具體操作方法參考現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄第11頁進(jìn)行檢測。

2.5 中和效價的測定 采用固定病毒-稀釋血清法。將待檢血清、陽性血清和陰性血清置于56℃水浴中滅活30min；用滅菌PBS進(jìn)行2倍系列稀釋。將3型鴨肝炎病毒（B54株）稀釋至200ELD50/ 0.1ml，分別與等量的不同稀釋度的待檢血清、陽性血清和陰性血清相混合。37℃感作1h。將感作好的混合液，每個稀釋度經(jīng)尿囊腔接種SPF鴨胚5枚，每胚接種0.2ml，同時設(shè)置5枚鴨胚接種滅菌PBS作為空白對照，接種后封閉針孔，置37℃繼續(xù)孵育，每天照蛋檢查鴨胚情況，連續(xù)觀察 7d，記錄鴨胚死亡數(shù)量，按Reed-Muench法計算中和抗體效價。

2.6 治療試驗 選擇 1日齡櫻桃谷雛鴨 60只，平均分成2組，第1組為ATCC攻毒試驗組，第2組為DHAV-3 G攻毒試驗組。各試驗組又平均分成攻毒對照小組和治療小組，各小組15只雛鴨分別隔離飼養(yǎng)，于7日齡攻毒，攻毒劑量均為103.0LD50/0.5ml，當(dāng)攻毒后各試驗組雛鴨出現(xiàn)發(fā)病癥狀后，立即對各治療小組雛鴨腿部肌肉注射0.5ml抗血清。連續(xù)觀察7日，統(tǒng)計雛鴨死亡情況。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌、霉菌與支原體檢測 按照現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄42頁和49頁進(jìn)行無菌和支原體檢驗，結(jié)果表明所制備的血清無細(xì)菌、霉菌和支原體生長。

3.2 特異性

3.2.1 中和試驗 抗血清與DHAV-3感作后，接種的5枚鴨胚，連續(xù)觀察7日均未出現(xiàn)死亡，而鴨瘟病毒和1型鴨肝炎病毒抗血清感作組，兩組接種的胚在120h內(nèi)全部死亡。說明所制備的血清對DHAV-1和DPV無中和作用，是抗DHAV-3特異性血清。

3.2.2 ELISA檢測 使用IDEXX ELISA抗體檢測試劑盒，分別對 AIV、NDV、IBV、ILTV、IBDV、CAV、AEV、REO、REV、ALV抗體進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果均為陰性。

3.2.3 HI方法檢測 使用HI方法檢測抗血清中EDS76病毒抗體，檢測結(jié)果也為陰性。

3.3 中和效價測定 結(jié)果陽性血清對照和空白對照鴨胚全部健活，而陰性血清對照全部死亡。陽性和陰性血清平行試驗成立，按Reed-Muench法計算所制備的抗血清中和效價為 10-2.8，表明該血清在1:632稀釋時可保護(hù)50%的接毒鴨胚免于死亡，見表1。

表1 中和試驗結(jié)果

3.4 治療試驗 將隔離飼養(yǎng)的 7日齡雛鴨進(jìn)行攻毒，24h前各小組均無發(fā)病死亡現(xiàn)象。在攻毒后26h，當(dāng)DHAV-3 G株攻毒對照組第一例雛鴨出現(xiàn)發(fā)病癥狀時，對兩治療組鴨腿部肌肉注射0.5ml抗血清，觀察7日，DHAV-1 ATCC株和DHAV-3 G株攻毒對照組分別出現(xiàn)86.7%和 80%的死亡率，表明攻毒對照成立。出現(xiàn)發(fā)病雛鴨后緊急注射抗血清，對DHAV-1 ATCC株和DHAV-3 G株攻毒保護(hù)率分別為15.38和91.67，見表2。

表2 攻毒后雛鴨死亡情況

4 討論

本試驗中使用的免疫原是經(jīng)過純化的尿囊液病毒，沒有使用胚組織毒是因為其含有大量宿主雜蛋白，不僅會影響所制備的抗血清效價，而且還會影響在免疫酶技術(shù)中的使用效果。對于鴨肝炎病毒，雖然尿囊液中的病毒含量（滴度）較低，但是其它雜蛋白相對于胚組織量少，便于病毒抗原的純化與濃縮。

關(guān)于抗血清治療試驗，抗血清的使用時機(jī)非常重要，一般在發(fā)病后24h內(nèi)使用，效果比較明顯。由于鴨肝炎發(fā)病急促，一旦出現(xiàn)發(fā)病癥狀后，幾小時內(nèi)就會死亡，對病死雛鴨進(jìn)行解剖，可發(fā)現(xiàn)肝臟腫大、有明顯的出血點或出血斑，腦部也出現(xiàn)水腫，故當(dāng)觀察到癥狀后再用血清治療，很難奏效。我們根據(jù)多次兩株強(qiáng)毒的攻毒試驗研究，該毒株的攻毒劑量控制在一定范圍內(nèi)，一般均在攻毒24h后出現(xiàn)發(fā)病死亡，死亡高峰出現(xiàn)在32～48h。另外鴨肝炎病毒傳染能力極強(qiáng)，同群感染率高，所以對抗血清治療效果評價，以攻毒后抗血清的保護(hù)率為標(biāo)準(zhǔn)，即（對照組死亡率-治療組死亡率）/對照組死亡率，為使試驗結(jié)果更加確切，把抗血清使用時機(jī)定為攻毒后第一只雛鴨發(fā)病以后，以使抗血清治療效果更加接近實際應(yīng)用。

本試驗表明，制備的DHAV-3血清對DHAV-1基本無保護(hù)作用，這與鴨胚血清中和試驗具有一致性，故在臨床生產(chǎn)中，對易感雛鴨無論是免疫還是抗血清治療，要與流行發(fā)病的病株血清血清型一致才有保護(hù)效果。

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2016年補(bǔ)貼申報高峰期來臨！你的項目報上了嗎？

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S858.324.4+3

B

1673-1085（2016）2-0012-04

2016-01-12

孫慶歌，碩士，從事禽病的分子診斷技術(shù)研究。

?通訊作者：謝紅玲，E-mail：13419546263@163.com。