綠色木霉固態(tài)發(fā)酵工藝及誘導條件研究

劉華（廣州工商學院，廣東廣州510000）

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綠色木霉固態(tài)發(fā)酵工藝及誘導條件研究

劉華
（廣州工商學院，廣東廣州510000）

摘要：探討綠色木霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生纖維素酶的誘導促進條件。通過初始培養(yǎng)基、表面活性劑、誘導物、緩沖pH體系等對綠色木霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的誘導情況進行分析，獲得產(chǎn)酶時間曲線和最大產(chǎn)酶量。不同條件下綠色木霉產(chǎn)纖維素酶活力存在顯著差異（P <0.05），麩皮∶秸稈粉＝1.5∶1（質(zhì)量比），培養(yǎng)基固液比1∶2.5（g/mL），硫酸銨按培養(yǎng)基干基的2 %加入，初始pH＝6為最佳條件，采用緩沖pH體系對產(chǎn)酶有促進作用，添加表面活性劑和適當種類的誘導物可以提高產(chǎn)酶量，而過高濃度的誘導物則降低產(chǎn)酶量。該研究為綠色木霉對秸稈的轉化應用提供了理論依據(jù)。

關鍵詞：纖維素酶；綠色木霉；固體發(fā)酵

利用微生物講解玉米秸稈，可以有效提高其綜合利用率，同時具有經(jīng)濟、環(huán)保特點，已經(jīng)逐漸成為近年來研究的熱點。纖維素酶（cellulase）是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，是一個包含了多種水解酶的復雜的酶系。它在食品、紡織、飼料工業(yè)以及醫(yī)學、能源、生物學、環(huán)保等領域應用廣泛[1]。固態(tài)發(fā)酵是國內(nèi)外研究較多的一種生產(chǎn)酶制劑的方法，與業(yè)態(tài)發(fā)酵相比，具備低成本和較少的運行費用。采用綠色木霉（Trichoderma viride）固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶由于低成本高產(chǎn)量而成為纖維素酶工業(yè)生產(chǎn)的技術發(fā)展方向[2]。自然界能夠產(chǎn)纖維素酶降解秸稈的微生物包括細菌、真菌、放線菌等，其中由于綠色木霉纖維素酶產(chǎn)量高，穩(wěn)定性好，培養(yǎng)和控制容易，且分泌的纖維素酶是胞外酶，易于分離純化，因此是目前用于纖維素酶生產(chǎn)最主要的菌種之一[3-5]。

研究綠色木霉的培養(yǎng)條件及其對纖維素酶活的影響為纖維素酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定一些試驗基礎，為更好地利用秸稈開辟新的途徑，這對于加強秸稈資源的充分利用，緩解飼料供求矛盾，促進農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展都將具有重要意義[6-7]。本文以綠色木霉為發(fā)酵菌種，以稻草秸稈為主要物料，對固態(tài)發(fā)酵工藝進行研究，探討固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶條件，為綠色木霉對秸稈的轉化應用提供了理論參考。

1　材料與方法

1.1菌種

綠色木霉Trichoderma viride。

1.2培養(yǎng)基材料

馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基PDA：馬鈴薯煮汁1000mL，蔗糖20 g，瓊脂20 g，pH5.5～6.0。先將新鮮無病害的馬鈴薯洗凈，去皮后切成小薄片，稱200 g，加水1 000 mL，煮沸20 min后過濾，其濾汁為馬鈴薯煮汁。然后加瓊脂和蔗糖煮溶，后補足水分至1 000 mL，裝管（瓶）滅菌備用；菌種擴大培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基：麩皮5 g，秸稈粉5g，Mendels營養(yǎng)液20mL，加水25mL；Mendels營養(yǎng)液：（NH4）2SO41.4 g/L，MgSO40.3 g/L，KH2PO42.0 g/L，CaCl20.3 g/L，尿素0.3 g/L；微量元素：FeSO45.0 mg/L，MnSO41.6 mg/L，ZnSO41.4 mg/L，CoCl22.0 mg/L；0.1 mol/L pH 4.6醋酸-醋酸鈉緩沖液：準確稱取醋酸鈉（CH3COONa·3H2O）和冰醋酸2.60 mL，以蒸餾水溶解，定容至1 000 mL；3，5-二硝基水楊酸顯色液：準確稱取6.30 g 3，5-二硝基水楊酸，置于2N氫氧化鈉262 mL溶液中，然后加酒石酸鉀鈉的熱溶液（182.0 g酒石酸鉀鈉溶于500 mL水中），再加5.0 g苯酚和0.5 g亞硫酸鈉，攪拌至溶解，冷卻后定容至1 000 mL，貯存于棕色瓶中，冰箱中備用。0.1 %標準葡萄糖溶液：精確稱取經(jīng)105℃烘至恒重的無水葡萄糖250.0 mg，溶解于蒸餾水中，定容至250 mL。

1.3主要儀器及設備

BS210S型電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；PHS-2C型酸度計：上海虹益儀器廠；手提式壓力蒸汽消毒器：江陰濱江醫(yī)療設備廠；SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；L1000A型光學顯微鏡：尼康儀器（上海）有限公司；80-2型離心機：上海悅豐儀器儀表有限公司；DHZ-D冷凍恒溫振蕩器：廣州深華生物技術有限公司；722型分光光度計：上海棱光技術有限公司。

1.4方法

1.4.1培養(yǎng)方法

擴大培養(yǎng)母種：將已滅菌的PDA培養(yǎng)基在無菌工作臺擺斜面，靜置冷卻后，在已有的菌種中挑取菌絲和孢子，接種斜面，置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后移至10℃左右冰箱中保藏。

菌種擴大培養(yǎng)：于無菌工作臺將接有母種的PDA斜面中加入10 mL無菌水，并用接種環(huán)將培養(yǎng)基上的菌絲和孢子輕刮下，再將含有菌體的水倒入菌種擴大培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基中，于28℃培養(yǎng)5 d后，可發(fā)現(xiàn)白色菌絲結滿整個培養(yǎng)基，培養(yǎng)基表面有大量綠色孢子，培養(yǎng)基嚴重結塊。這時菌種即可作為種子使用。

接種入三角瓶培養(yǎng)：接種操作在無菌工作臺進行，接種前先用紫外光對接種臺滅菌30 min，并將酒精燈、接種環(huán)、移液槍等接種時需要的物品放入同時滅菌。接種前要用75 %的乙醇將臺面、使用物品和手進行消毒，接種時應在酒精燈焰所造成的無菌區(qū)域內(nèi)操作。接種時，先將種子培養(yǎng)基中加入100 mL無菌水，并用玻棒搗碎結塊的培養(yǎng)基，使菌體和孢子盡量均勻地分布在水中，用移液槍吸取2 mL液體接入三角瓶，接種時應盡量使液體均勻分布在培養(yǎng)基表面。接種完后用5層紗布包扎，放入29℃恒溫箱中培養(yǎng)。

1.4.2取樣方法

在固體發(fā)酵曲中加入蒸餾水100 mL，30℃下抽提1 h，抽提時要將曲盡量搗碎，并定時攪拌，使酶盡可能溶于水中，之后取上清液在4 000 r/min下離心10 min，去除孢子，上清液即為粗酶液，然后測定酶活。

1.4.3分析方法

標準曲線的繪制：分別吸取0.1 %標準葡萄糖溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分別定容至50 mL。再分別吸取上述溶液各2.5 mL于試管中，各加2.5 mL 3，5-二硝基水楊酸顯色液，煮沸5 min（另作一管空白，取2.5 mL蒸餾水，2.5 mL 3，5-二硝基水楊酸顯色液，同樣煮沸5 min）。冷卻后，用721型分光光度計，在530 nm波長下比色，記錄各管的光密度值，以光密度為橫坐標，對應標準葡萄糖溶液含糖的毫克數(shù)為縱坐標，繪制曲線。采用Origin 6.1軟件進行線性回歸以獲得標準曲線，回歸結果如表1和圖1所示。

表1　葡萄糖標準曲線數(shù)據(jù)Table 1 The data of glucose standard curve

圖1　散點圖及線性回歸后的直線Fig.1 Scatter plots and straight line after linear regression

Origin 6.1軟件的回歸結果及誤差分析圖如圖2所示。

圖2　Origin 6.1軟件的回歸結果及誤差分析圖Fig.2 The chart of Origin 6.1 software regression results and error analysis

所得標準曲線為Y= 0.076 59+0.236 31X，相關系數(shù)R＝0.998 97，說明標準曲線擬合較好。

式中：Y為葡萄糖量，mg；X為OD值。

樣品測定：精確吸取2.0 mL酶液和3.0 mL緩沖液于試管中，加入1 cm×6 cm新華5號濾紙條一條，50℃水浴加熱靜止反應1 h。

吸取濾紙酶解液1.0 mL，加蒸餾水1.5 mL，加3，5-二硝基水楊酸顯色液2.5 mL于試管中，沸水浴煮沸5 min，冷卻后稀釋10倍，530 nm處測定OD值。

空白測定：吸取2.0 mL蒸餾水代替2.0酶液，其他操作同樣品測定。

1.4.4計算方法

濾紙酶活力/（U/g干基）=

2　結果與分析

2.1秸稈和麩皮的比對綠色木霉固態(tài)發(fā)酵的影響

一般認為纖維素酶是一種誘導酶，大多采用含有纖維素的原料作為碳源，大多采用含有纖維素的原料作為碳源，常用的粗纖維原料有稻草、秸稈、玉米芯、紙漿、麩皮和糖醛渣等。綜合考慮原料來源、成本及效果的考慮，一般采用麩皮和秸稈粉作為碳源。秸稈粉中的纖維素對酶的產(chǎn)生有誘導作用，而麩皮的影響是雙方面的：一方面它為產(chǎn)酶提供必要的營養(yǎng)因子；另一方面，其含量的增加又會降低培養(yǎng)基的蓬松程度，是通氣量降低，從而影響產(chǎn)酶[8-9]。我們采用不同比例的秸稈粉與麩皮混合，29℃下培養(yǎng)，結果如圖3所示，當麩皮與秸稈粉的比例為1.5∶1（質(zhì)量比）時酶活最高。

圖3　麩皮秸稈粉比對產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of the ratio of bran and straw powder on enzyme production

2.2硫酸銨加入量對產(chǎn)酶的影響

一般的培養(yǎng)基采用尿素、（NH4）2SO4、谷氨酸鈉、硝酸鈉、蛋白胨作為氮源。有文獻記載，采用（NH4）2SO4、谷氨酸鈉作為氮源時效果較好[10]。而谷氨酸鈉價格昂貴，其產(chǎn)酶活性又與（NH4）2SO4相差不大，而（NH4）2SO4成本較低，故采用（NH4）2SO4作為氮源。

我們在其他條件相同的培養(yǎng)基中加入不同含量的（NH4）2SO4進行比較，如圖4，當硫酸銨含量為2 %時效果較好。而在硫酸銨加入量大于2 %時，產(chǎn)酶量反而下降，可能是因為氮源過量使得微生物的生長期過長，而減短了產(chǎn)酶期，導致酶的產(chǎn)量下降。

圖4　硫酸銨加入量對產(chǎn)酶量的影響Fig.4 Effect of the quantity of ammonium sulfate for enzyme production

2.3緩沖pH對產(chǎn)酶的影響

在發(fā)酵過程中，基質(zhì)的消耗和微生物代謝物的產(chǎn)生都可能改變培養(yǎng)基的pH，這種改變可能對酶活的產(chǎn)生造成影響。這個試驗中，我們選取產(chǎn)酶活較高的初始pH樣品做兩個采用緩沖溶液配制的對照樣，來研究緩沖pH能否提高產(chǎn)酶。結果如表2所示。

表2　緩沖pH對產(chǎn)酶的影響Table 2 Effect of buffer pH on enzyme production

由結果可以看出，使用緩沖溶液可以使酶活得到一定的提高，這可能使因為發(fā)酵過程中的產(chǎn)物使pH向不利于產(chǎn)酶的方向改變。但由于酶活的提高幅度較小，在工業(yè)生產(chǎn)中是否值得推廣要視成本核算而定。

2.4表面活性劑的添加對產(chǎn)酶的影響

表面活性劑可以改變細胞膜的通透性，從而影響纖維素酶的分泌，我們在其他條件相同的培養(yǎng)基中加入不同量的吐溫-20和吐溫-80，來研究加入表面活性劑對產(chǎn)酶的影響。

表面活性劑的添加對產(chǎn)酶的影響，結果如表3所示。

表3　表面活性劑的添加對產(chǎn)酶的影響Table 3 Effect of surfactants on enzyme production

當吐溫-20的加入量較小時對產(chǎn)酶有抑制作用，而加入量較大的時候，對酶有明顯的促進作用。加入兩種濃度的吐溫-80都對產(chǎn)酶有促進作用。這可能是因為表面活性劑對產(chǎn)酶具有兩方面影響。一方面，表面活性劑可以增加細胞膜的通透性，加速纖維素酶的分泌；另一方面，表面活性劑對細胞膜的影響導致微生物的生長受到抑制[11-12]。

2.5誘導物的添加對產(chǎn)酶的影響

纖維素酶是一種誘導酶，纖維二糖對產(chǎn)酶應具有誘導作用。本試驗采用了不同濃度水平CMC-Na、葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖和醋酸鈉作為誘導物，試驗二糖和一些單糖及二碳化合物對纖維素酶的影響。試驗結果如表4。

表4　不同誘導物對產(chǎn)酶的影響Table 4 Effects of different inducer of enzyme production

從表中的數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)，可溶性淀粉的兩種濃度水平都對產(chǎn)酶有誘導作用，對酶活有一定的提升，而低濃度水平的CMC-Na和蔗糖對產(chǎn)酶有誘導作用，但濃度過高反而抑制產(chǎn)酶。而麥芽糖和葡萄糖的兩種濃度水平都會導致酶活下降。這可能因為高濃度的纖維二糖被菌體利用后產(chǎn)生葡萄糖效應，阻遏微生物合成纖維素酶，從而減少產(chǎn)酶量。至于醋酸鈉不屬于糖類，但其加入導致酶活大幅下降，估計是醋酸鈉對菌體有毒害作用，也可能是醋酸鈉作為堿性生理鹽使培養(yǎng)基的pH上升的緣故[13-14]。

3　結論

本試驗旨在用廉價的農(nóng)產(chǎn)品及其副產(chǎn)物為木霉菌發(fā)酵提供碳、氮成分。試驗證明，不同條件下綠色木霉產(chǎn)纖維素酶活力存在顯著差異（P <0.05），麩皮∶秸稈粉＝1.5∶1（質(zhì)量比），培養(yǎng)基固液比1∶2.5（g/mL），硫酸銨按培養(yǎng)基干基的2 %加入，初始pH＝6為最佳條件。由于影響纖維素酶活的因素較多，同時纖維素的降解是一個比較復雜的過程，采用緩沖pH體系對產(chǎn)酶有促進作用，添加表面活性劑和適當種類的誘導物可以提高產(chǎn)酶量，而過高濃度的誘導物則降低產(chǎn)酶量。本文對綠色木霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)條件和誘導因素的研究結果，為提高產(chǎn)酶量提供了一定的理論根據(jù)。

參考文獻：

[1] Adsul M G,Bastawde K B,Varma A J, et al.Strain improvement of Penicillium jant hinellum NCIM 1171 for increased cellulase production[J].Biore-source Technology,2007,98(7):1467-1473

[2]陳莉.綠色木霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學, 2013, 41(7):2823-2825

[3]李高揚,李建龍,王艷.利用高產(chǎn)牧草柳枝稷生產(chǎn)清潔生物質(zhì)能源的研究進展[J].草業(yè)科學, 2008,25(5):15-22

[4]馬旭光,張宗舟,藺海明,等.黑曲霉高產(chǎn)纖維素酶活突變株ZM-8的篩選[J].中國飼料,2007(5):30-32

[5]趙阿娜,丁萬隆,朱殿龍.拮抗人參根部病原菌木霉的篩選及其生物學特性初步研究[J].中國中藥雜志, 2006,31(20):1671-1673

[6]王永東,蔣立科,岳永德,等.生防菌株哈茨木霉H-13固體發(fā)酵條件的研究[J].浙江大學學報,2006,32(6): 645-650

[7]趙玉萍,楊娟.四種纖維素酶酶活測定方法的比較[J].食品研究與開發(fā),2006(3):116-118

[8] Yoon J J, Kim Y K. Degradation of crystalline cellu-lose by the Brown-rot Basidiomycete fomitopsis pal-ustris[J]. The Journal of Microbiology, 2005, 43 (6):487-492

[9]張佩華,王加啟,賀建華,等.青貯對飼料稻秸稈DM和NDF瘤胃降解特性的影響[J].草業(yè)科學,2008, 25(6):80-84

[10]季更生,林弦,曹陽.pH值對綠色木霉合成纖維素酶的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2007,35(27):8593-8594

[11]張麗英.飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學出版社,2007:28-30

[12]張濤,崔宗均,李建平,等.不同發(fā)酵類型青貯菌制劑對青貯發(fā)酵的影響[J].草業(yè)學報, 2005, 14(3): 67-71

[13]靳振江.纖維素酶降解纖維素的研究進展[J].廣西農(nóng)業(yè)科學,2007 (38)2:127-130

[14]王汝富,常寧芳,陳仲斌,等.甘肅開發(fā)利用秸稈飼料資源之實踐[J].草業(yè)科學,2006,23(6):69-72

Studies on the Inducing Conditions of Solid-state Fermentation by Trichoderma viride

LIU Hua
（Guangzhou College of Technology and Business，Guangzhou 510000，Guangdong，China）

Abstract：To explore promoting conditions of solid fermentation degrading corn straw by Trichoderma viride. Using Trichoderma viride as experimental materials，the conditions for cellulose production were studied by solid fermentation. The influences of the culture conditions，including medium，a surfactant，inducers，pH buffering system，enzyme-time curve and maximum enzyme production was obtained. The result showed that there was significant difference in cellulase activity produced by Trichoderma viride under different conditions （P<0.05）.It was found that optional conditions for fermentation of corn straw were based on culture at wheat bran and corn straw in the ratio of 1.5∶1（mass ratio），under 6.0 pH，with the medium liquid of 1∶2.5（g/mL），according to the medium dry ammonium sulfate 2 % was added. Using the pH buffer system for enzyme production advantageously，a surfactant is added and appropriate type of inducer enzyme production could be improved，and the high concentration of inducer may decrease the amount of enzyme production. The research provided certain theoretical basis for the transformations and the application of Trichoderma viride on straw.

Key words：cellulase；Trichoderma viride；solid state fermentation

收稿日期：2015-07-23

作者簡介：劉華（1982—），女（漢），碩士，研究方向：食品安全與營養(yǎng)檢測。

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.042