低溫環(huán)境下提高美極梅奇酵母菌生防效果的研究

郭東起，蔣楠，劉亞軍，朱麗霞（塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗室，新疆阿拉爾843300）

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低溫環(huán)境下提高美極梅奇酵母菌生防效果的研究

郭東起，蔣楠，劉亞軍，朱麗霞*
（塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗室，新疆阿拉爾843300）

摘要：以美極梅奇酵母菌（Metschnikowia pulcherrima）為試材，通過添加不同的碳源、氮源及保護(hù)劑，研究其在低溫環(huán)境下對拮抗酵母菌的生長及抑菌效果的影響，明確提高其生防功效的方法。結(jié)果表明，以蔗糖為碳源，酵母膏為氮源有利于美極梅奇酵母菌在低溫條件下生長，體外抑菌效果俱佳，添加0.1 %CaCl2（氯化鈣）及2 %海藻糖均能提高美極梅奇酵母菌生防效果。

關(guān)鍵詞：低溫；美極梅奇酵母菌；生防

冬棗是環(huán)塔里木盆地種植的晚熟鮮食品種，以其優(yōu)良的品質(zhì)受到消費(fèi)者的青睞，但由于其含水量高，皮薄肉脆，極易腐爛變質(zhì)，目前，對冬棗的貯藏絕大部分還停留在傳統(tǒng)的化學(xué)殺菌劑方面，然而，長期使用化學(xué)殺菌劑會造成環(huán)境污染，藥物殘留，進(jìn)而危害消費(fèi)者的身體健康[1-2]。利用生防微生物替代傳統(tǒng)化學(xué)殺菌劑控制果蔬采后病害已成為研究熱點(diǎn)[3-5]。M. pulcherrima是從新疆冬棗表面分離獲得的生防酵母菌，用于冬棗的采后貯藏中腐爛的防治效果良好[6-7]。但要保證其在冬棗的實(shí)際貯藏中發(fā)揮更好的生防效果，其必須適應(yīng)貯藏的低溫環(huán)境，因此，本試驗通過對M. pulcherrima低溫環(huán)境下，添加不同外源物對拮抗酵母菌的生長及抑菌效果的影響，明確提高拮抗酵母菌生防效果的方法，為新疆冬棗的生物保鮮技術(shù)提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1冬棗及菌株

冬棗：采于阿克蘇地區(qū)阿拉爾市10團(tuán)，選取大小均一、無病蟲害、無機(jī)械損傷的8～9成熟的果實(shí)，當(dāng)天運(yùn)回并貯藏在南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗室冷庫[（-2±1）℃，相對濕度（90±5）%]預(yù)冷，待用；生防酵母菌種：M. pulcherrima，生工生物工程（上海）有限公司鑒定；橘青霉（Penicilliium citrinum）是新疆冬棗貯藏過程中青腐病的主要病原菌[8]。

1.1.2主要儀器與試劑

LS-B50L型立式壓力蒸氣滅菌器：上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；PL203/O1電子分析天平：特勒一托利多儀器（上海）有限公司；DGG-101-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱、HH.B 1型電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市天宇試驗儀器有限公司；756紫外分光光度計：長春泰恒儀器表有限公司；等。

牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、蔗糖、麥芽糖、硫酸銨、海藻糖、乳糖、可溶性淀粉、氯化鎂、氯化鐵、氯化鈣等（均為分析純）。

1.1.3培養(yǎng)基的制備

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH，121℃，滅菌20 min。

1.2方法

1.2.1 M. pulcherrima的擴(kuò)大培養(yǎng)

在無菌操作條件下，從酵母菌YDP斜面上用接種環(huán)挑取2環(huán)菌種，轉(zhuǎn)接到裝有100 mL NYDB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶內(nèi)，28℃下振蕩（140 r/min），培養(yǎng)36 h后，4℃冰箱貯存，待用。

1.2.2 M. pulcherrima生長曲線的測定

M. pulcherrima NYDB培養(yǎng)液，按2 %的量接種到不同裝有YDP液體培養(yǎng)基的錐形瓶（250 mL錐形瓶，裝100 mL YDP液體培養(yǎng)基），4℃下振蕩（140 r/min）培養(yǎng)，每1 d取樣1次，用無菌水稀釋10倍，未發(fā)酵的YDP液體培養(yǎng)基作空白對照，測定OD500值，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD500值為縱坐標(biāo)，繪制其生長曲線，試驗重復(fù)3次，求均值[9]。

1.2.3碳源對M. pulcherrima生長及體外抑菌效果的影響

以LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以2 %的可溶性淀粉、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖為碳源，在錐形瓶（250 mL）裝入150 mL培養(yǎng)基，121℃，滅菌15 min，2 %的接種量，在4℃下培養(yǎng)4、6、8、10、12 d，用分光光度計測定其在OD500，測定其對M. pulcherrima菌體產(chǎn)生量的影響；采用牛津杯法，測定5種碳源對M. pulcherrima菌體外抑菌效果的影響，用消過毒的打孔器（內(nèi)徑為5 mm）從培養(yǎng)7 d的病原菌PDA平板上取菌餅，并將其移至另一PDA平板中央，并對稱放置4個牛津杯，用移液槍吸取100 μL含5種不同碳源M. pulcherrima培養(yǎng)液（4℃下培養(yǎng)10 d），注入牛津杯中，其中同一碳源十字交叉放置，于4℃下培養(yǎng)8 d，觀察M. pulcherrima和病原菌的生長情況，并測量抑菌圈直徑的大小，重復(fù)3次，求均值。

1.2.4氮源對M. pulcherrima生長及體外抑菌效果的影響

以PDA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加1 %的牛肉膏，蛋白胨，酵母膏，硫酸銨，每個錐形瓶（250 mL）裝150 mL培養(yǎng)基，121℃滅菌，15 min，2 %的接種量，在4℃下培養(yǎng)4、6、8、10、12 d，用分光光度計檢測其OD500，測定其對M. pulcherrima菌體產(chǎn)生量的影響；采用牛津杯法，測定4種不同氮源對M. pulcherrima體外抑菌效果的影響，方法同1.2.3所述，重復(fù)3次，求均值。

1.2.5海藻糖及金屬離子對M. pulcherrima抑菌效果的影響

在NYDB中分別加入0.1 %（0.1 mg/100 mL）CaCl2、MgCl2、FeCl3和2 %（2 mg/100 mL）的海藻糖，添加量根據(jù)預(yù)試驗確定，28℃，振蕩（120 r/min）培養(yǎng)24 h，待用。在無菌室，將橘青霉轉(zhuǎn)接到PDA平板上，28℃培養(yǎng)1周，然后用接種環(huán)在平板上刮取適量孢子，放入10 mL 含0.05 %Tween-80的無菌蒸餾水中，并用無菌紗布過濾4次，濾去其菌絲體，用血球計數(shù)板法計數(shù)，調(diào)整橘青霉孢子數(shù)為1×105spores/mL。選取新鮮冬棗，先用2 % NaClO溶液將其消毒2 min，并用清水沖洗干凈，晾干備用。在冬棗表面赤道部位用消過毒的打孔器人工制造一個傷口（3 mm×3 mm×3 mm），接著用移液槍在傷口處加入20 μL（1×105spores/mL）的橘青霉的孢子懸浮液，自然晾干，再分別接種含不同金屬離子和海藻糖的NYDB液態(tài)培養(yǎng)液25 μL，自然晾干后，將冬棗裝入保鮮袋，以只接種橘青霉的冬棗作為對照，置于4℃，RH（90±5）%的環(huán)境下貯藏，10 d后，測量冬棗的病斑直徑，并計算出腐爛率。每個處理組200個冬棗，重復(fù)3次，求均值。

2　結(jié)果

2.1M. pulcherrima的生長曲線測定

4℃下，M. pulcherrima在YDP液體培養(yǎng)基NYDB生長曲線測定結(jié)果見圖1。

圖1　4℃下M. pulcherrima的生長曲線Fig.1 Growth curve of M. pulcherrima at 4℃

M. pulcherrima的生長曲線為：0 d～2 d為適應(yīng)期，2 d～7 d為指數(shù)期，7 d～13 d為恒定期，13 d后為衰亡期。

2.2碳源對M. pulcherrima生長及體外抑菌效果的影響

2.2.1碳源對M. pulcherrima生長的影響

碳源對M. pulcherrima生長的影響見圖2。

圖2　碳源對M.pulcherrima生長的影響Fig.2 Effect of carbon source on the growth of M.pulcherrima

在相同培養(yǎng)條件下，以蔗糖和麥芽糖為碳源時，M. pulcherrima的OD500明顯高于以葡萄糖、乳糖及可溶性淀粉為碳源時的OD500，5種不同碳源提高M(jìn). pulcherrima菌體生長量的順序為蔗糖＞麥芽糖＞葡萄糖＞乳糖＞可溶性淀粉。結(jié)果表明，蔗糖和麥芽糖更有利于M. pulcherrima在冷脅迫條件下生長。

2.2.2碳源對M. pulcherrima體外抑菌效果的影響

碳源對M. pulcherrima體外抑菌效果見表1。

表1　碳源對M.pulcherrima體外抑菌效果的影響Table 1 Effects of carbon source on antimicrobial of M.pulcherrima

4℃下培養(yǎng)8 d測定蔗糖為碳源時，M. pulcherrima的抑菌圈直徑為30 mm，大于其它4種碳源時的抑菌圈直徑，結(jié)果表明，以蔗糖為碳源，M. pulcherrima體外抑菌效果最好，其抑菌效果見圖3。

圖3　蔗糖為碳源時M.pulcherrima體外抑菌效果（上、下）Fig.3 Effects of Sucrose as the carbon source on antimicrobial of M.pulcherrima（upper，lower）

因此，添加蔗糖利于M. pulcherrima菌體生長，其體外抑菌效果也最佳，故蔗糖為M. pulcherrima發(fā)酵的最佳碳源。

2.3氮源對M. pulcherrima生長及體外抑菌效果的影響

2.3.1氮源對M. pulcherrima生長的影響

氮源對M. pulcherrima生長的影響見圖4。

圖4　氮源對M.pulcherrima生長的影響Fig.4 Effect of nitrogen source on the growth of M.pulcherrima

在相同培養(yǎng)條件的4種不同氮源對M.pulcherrima菌體生長量的影響順序為酵母膏＞牛肉膏＞蛋白胨＞硫酸銨，以酵母膏為氮源，M.pulcherrima的菌體生長量明顯高于其它3種。

2.3.2氮源對M.pulcherrima體外抑菌效果的影響

氮源對M.pulcherrima體外抑菌效果見表2。

表2　氮源對M. pulcherrima抑菌效果的影響Table 2 Effect of nitrogen source on antimicrobial of M. pulcherrima

4℃下，加不同氮源培養(yǎng)8 d，以酵母膏為氮源時，M.pulcherrima體外抑菌效果最佳，其抑菌圈直徑為30 mm，因此，酵母膏對菌體生長量影響較大，其體外抑菌效果顯著，故酵母膏為M.pulcherrima發(fā)酵的最佳氮源。

2.4海藻糖及金屬離子對M.pulcherrima抑菌效果的影響

海藻糖及金屬離子對M.pulcherrima抑菌效果的影響見圖5，可知，與對照（CK）組的冬棗100 %的腐爛率相比，添加0.1 %（0.1 mg/100 mL）CaCl2、MgCl2、FeCl3和2 %（2 mg/100 mL）海藻糖均能提高M(jìn). pulcherrima體內(nèi)抑菌效果，明顯降低橘青霉因起的冬棗腐爛，添加0.1 %CaCl2的NYDB液態(tài)培養(yǎng)液抑菌效果最佳，冬棗的腐爛率最低，只有30 %，添加2 %海藻糖的NYDB液態(tài)培養(yǎng)液抑菌效果僅次于添加CaCl2抑菌效果，冬棗的腐爛率為35 %；比較對病斑直徑的影響，各處理均能降低傷口病斑直徑的擴(kuò)展，添加0.1 %CaCl2及2 %海藻糖的處理的抑制效果較佳，病斑直徑分別為10 mm 和11.5 mm。添加適宜濃度的金屬陽離子及保護(hù)劑能提高美極梅奇酵母菌在冷脅迫條件下的生防效果。

圖5　不同處理對接種橘青霉后冬棗傷口病斑直徑及腐爛率的影響Fig.5 Effects of different treatment on winter jujube wound decay and lesion diameter after artificial inoculation with P. citrinum

3　討論

不同的碳源及氮源對M. pulcherrima的生長及抑菌效果的影響各異，以蔗糖為碳源，以酵母膏為氮源時美極梅奇酵母菌在低溫條件下生長，體外抑菌效果俱佳，這可能是因為生防酵母菌的初始數(shù)量多，有利于增強(qiáng)其與病原菌之間的空間、營養(yǎng)的競爭能力，這與許多學(xué)者的研究結(jié)果相一致[10-13]。因此，要使拮抗酵母菌發(fā)揮更好的抑菌效果，應(yīng)考慮菌體生長情況，本試驗僅從碳源和氮源方面分析了拮抗酵母菌菌體的生長量，發(fā)酵條件如接種量、供氧、培養(yǎng)時間、添加微量元素等因子對菌體生長還需進(jìn)一步的研究[14]。很多外源化學(xué)物質(zhì)，如金屬鹽類與生防酵母結(jié)合使用，能顯著提高其生物防治活性；使用Ca2+可以降低了細(xì)胞壁降解酶活性，從而增加了果實(shí)的硬度，起到增強(qiáng)抑菌效果的作用[15]，本試驗添加0.1 %CaCl2明顯提高了M. pulcherrima對冬棗青腐病的病原菌的抑制效果，這與孫萍等人的研究結(jié)果一致[16]。生防酵母菌還可以通過添加復(fù)合脫脂乳、海藻糖、蛋白胨等保護(hù)性物質(zhì)，來增強(qiáng)自身對各種脅迫的適應(yīng)性，提高其拮抗效力[17]，試驗中添加2 %海藻糖能顯著提高美極梅奇酵母菌在低溫條件下的生防功效，可能是海藻糖作為內(nèi)源或外源保護(hù)因子對細(xì)胞質(zhì)膜和胞內(nèi)敏感蛋白具有保護(hù)作用，能增強(qiáng)細(xì)胞對多種脅迫的適應(yīng)性。

4　結(jié)論

4℃下，M. pulcherrima在YPD培養(yǎng)基中的生長曲線為：0 d～2 d為適應(yīng)期，2 d～7d為指數(shù)期，7 d～13 d為恒定期，13 d后為衰亡期；以蔗糖為碳源，以酵母膏為氮源是M. pulcherrima生長及體外抑菌效果俱佳。添加0.1 %CaCl2及2 %海藻糖能提高M(jìn). pulcherrima在低溫條件下的生防效果。

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The Study on Improving the Biocontrol Effect of Metschnikowia pulcherrima under Low Environmental Temperature

GUO Dong-qi，JIANG Nan，LIU Ya-jun，ZHU Li-xia*
（College of Life Science，Tarim University/Xinjiang Production and Construction Group Key Laboratory of Agricultural Products Deep Processing in South Xinjiang，Alar 843300，Xinjiang，China）

Abstract：Taking Metschnikowia pulcherrim as test material，the study on the influence of growth and antibacterial effect of antagonistic yeast by adding different carbon sources，nitrogen sources，and protective agents under cold stress，in order to clarify ways to improve biocontrol effect of antagonistic yeast. The results showed that sucrose as carbon source，yeast extract as nitrogen source was beneficial for growth of M. pulcherrima under cold stress condition，the antibacterial effect in vitro was best，the biocontrol efficacy of M. pulcherrima could significantly improve by adding 0.1 % CaCl2and 2 % trehalose.

Key words：low temperature；M. pulcherrima；biocontrol

收稿日期：2015-01-30

*通信作者：朱麗霞（1975—），女（漢），副教授，碩士，從事食品微生物研究。

作者簡介：郭東起（1975—）男（漢），副教授，碩士，從事食品安全及果蔬保鮮與加工技術(shù)研究。

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（31160342）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.041