超聲波輔助提取蓮子心總黃酮的響應(yīng)面優(yōu)化

曾璟，徐明生，沈勇根，吳少福，丁琴（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江西省發(fā)展與改革委員會農(nóng)產(chǎn)品加工與安全控制工程實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330045）

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超聲波輔助提取蓮子心總黃酮的響應(yīng)面優(yōu)化

曾璟，徐明生，沈勇根*，吳少福，丁琴
（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江西省發(fā)展與改革委員會農(nóng)產(chǎn)品加工與安全控制工程實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330045）

摘要：研究超聲波輔助提取蓮子心總黃酮的最佳工藝條件。單因素試驗(yàn)考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度、超聲功率、料液比、超聲時(shí)間對總黃酮提取得率的影響，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken響應(yīng)曲面法考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲溫度及其交互作用對總黃酮得率的影響。利用軟件Design Expert6.0.1對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到二次多項(xiàng)式回歸方程預(yù)測模型。結(jié)果表明，蓮子心總黃酮的提取工藝最佳條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶16（g/mL），超聲溫度50℃，超聲功率120 W，超聲時(shí)間20min，此條件下總黃酮的提取得率為3.0715%，與預(yù)測值基本一致。

關(guān)鍵詞：蓮子心；超聲波；總黃酮；響應(yīng)曲面；優(yōu)化

蓮子心是睡蓮科植物蓮（Nelumbo nucifera Gaertn）成熟種子中的干燥幼葉和胚芽，《本草綱目》記載其性味苦寒[1-2]，在我國其主要產(chǎn)于浙江、江蘇、福建、湖南等地[3]?，F(xiàn)代研究表明，蓮子心含有生物堿、谷甾醇、揮發(fā)油、微量元素、黃酮類化合物等化學(xué)成分，具有降血壓、抗心律失常、抗血小板聚集、抑制脂質(zhì)過氧化及清除自由基、抗癌等藥理作用[4-6]。同時(shí)采用蓮子心為原輔料可開發(fā)出適用于特定人群食用的具有天然作用的保健食品，其保健作用在《本草綱目》中也有記載，尤其對生物堿的研究較為深入，蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿等為蓮子心生物堿的主要活性成分，具有降血壓、降血脂、抗氧化、清咽、增強(qiáng)免疫力等保健功能，目前，對蓮心保健茶和蓮心保健飲料的相關(guān)報(bào)道較多[7-10]。

蓮子心具有悠久的歷史，多方面的藥用和保健價(jià)值，為了進(jìn)一步開發(fā)利用黃酮資源，本文采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化超聲波輔助提取蓮子心總黃酮的工藝參數(shù)，為蓮子心的總黃酮提取工藝提供參考依據(jù)，提高蓮子心的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

蓮子心：購于江西省廣昌縣，干燥后粉碎成粉末，過60目篩備用；蘆丁對照品：上海試劑三廠；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純。

1.2儀器

KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；723C可見分光光度計(jì)：上海欣茂儀器有限公司；Anke LxJ-ⅡB低速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；101A-4B型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠；Q-350B3高速多功能粉碎機(jī)：上海冰都電器有限公司。

1.3方法

1.3.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[11]

精密稱取干燥后恒重的蘆丁對照品0.021 1 g，用體積分?jǐn)?shù)70 %的乙醇溶液溶解并定容100 mL，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.211 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.0，2.0，4.0，5.0，6.0，8.0，10.0 mL于25 mL容量瓶中，加入70 %乙醇稀釋至10 mL，加入5 % NaNO2溶液1 mL，搖勻，靜置6 min后加入10 % AlNO3溶液1 mL，搖勻，靜置6 min后加入NaOH溶液10.0 mL，搖勻后再用體積分?jǐn)?shù)為70 %的乙醇定容至25 mL，搖勻。靜置15 min后，以試劑空白作為參比，于510 nm波長下測定其吸光度值，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。得線性回歸方程為：y=7.573 5x+0.006 2，R2=0.997 6。蘆丁含量在0.0168 8 mg/mL～0.084 4 mg/mL內(nèi)與吸光度（A）呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

1.3.2蓮子心總黃酮的提取與含量測定

準(zhǔn)確稱取2 g蓮子心粉末，于100 mL三角瓶中，在一定條件下（乙醇濃度、超聲溫度、超聲功率、料液比、提取時(shí)間）進(jìn)行超聲提取，提取結(jié)束后將提取液進(jìn)行離心，離心后取1 mL上清液于25 mL容量瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，測定其吸光度值。根據(jù)回歸方程得出黃酮濃度，代入公式計(jì)算總黃酮得率。

黃酮得率/%=[C×V×N/（W×1 000）]×100（1）

式中：C為稀釋后樣品中總黃酮濃度，mg/mL；V為提取液總體積，mL；N為提取液稀釋倍數(shù)；W為蓮子心粉末質(zhì)量，g。

1.3.3單因素試驗(yàn)

為更系統(tǒng)地考察超聲波輔助提取的工藝參數(shù)，該試驗(yàn)進(jìn)行了乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度、超聲功率、料液比、超聲時(shí)間5個因素的單因素試驗(yàn)。方案如下，乙醇體積分?jǐn)?shù)40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 % 6個水平；超聲溫度25、30、40、50、60、70℃6個水平；超聲功率90、105、120、135、150 W 5個水平；料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL）6個水平；超聲時(shí)間10、20、30、40、50、60 min 6個水平。按照1.2.2法提取蓮子心總黃酮，并計(jì)算得率。

1.3.4響應(yīng)曲面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以蓮子心總黃酮提取得率為響應(yīng)值，選擇單因素試驗(yàn)中對響應(yīng)值有顯著影響的因素作為自變量，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)方案，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件Design Expert 6.0.1對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，用模型對超聲波輔助提取蓮子心總黃酮得率進(jìn)行分析和預(yù)測，得出最佳的提取工藝參數(shù)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素表見表1。

表1　響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1乙醇體積分?jǐn)?shù)對蓮子心總黃酮提取得率的影響

分別稱取2 g蓮子心粉末，按料液比1∶20（g/mL）分別加入濃度為40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %的乙醇溶液，在超聲功率為120 W，超聲溫度為30℃，超聲處理30 min，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮得率的影響見圖2。

圖2　乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids

由圖2可看出，隨著乙醇濃度的增大，總黃酮得率也逐漸上升，當(dāng)乙醇濃度為70 %時(shí)，總黃酮得率最大，之后隨著乙醇濃度的增大總黃酮得率反而下降。這可能與黃酮類化合物的極性有關(guān)，不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇極性不同，根據(jù)相似相溶原理，蓮子心總黃酮的極性可能與70 %的乙醇極性相當(dāng)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于70 %時(shí)，醇溶性雜質(zhì)、色素和其它脂溶性成分溶出，這些雜質(zhì)與黃酮類化合物競爭，導(dǎo)致總黃酮得率下降[12]。

2.1.2超聲溫度對蓮子心總黃酮提取得率的影響

分別稱取2 g蓮子心粉末，按料液比1∶20（g/mL）加入體積分?jǐn)?shù)為70 %的乙醇，在超聲功率為120 W，溫度為25、30、40、50、60、70℃的條件下超聲提取30 min，研究超聲溫度對總黃酮得率的影響見圖3。

圖3　超聲溫度對黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the yield of total flavonoids

由圖3可看出，當(dāng)溫度在25℃～30℃時(shí)，隨著溫度的升高，總黃酮提取得率也隨著增大，在30℃時(shí)，總黃酮提取得率達(dá)到最大值，之后，隨著溫度的不斷升高，總黃酮提取得率反而逐漸下降。其原因可能是隨著溫度的升高，分子運(yùn)動加快，黃酮類化合物易溶于溶劑當(dāng)中，過高的溫度使提取液中黃酮類成分或水解或裂解而被破壞，且雜質(zhì)的溶出量增加[13]，導(dǎo)致總黃酮提取量下降。

2.1.3超聲功率對蓮子心總黃酮提取得率的影響

分別稱取2 g蓮子心粉末，按料液比1∶20（g/mL）加入體積分?jǐn)?shù)為70 %的乙醇，在超聲功率為90、105、 120、135、150 W，超聲溫度為30℃的條件下超聲提取30 min，研究超聲功率對總黃酮得率的影響見圖4。

圖4　超聲功率對黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the yield of total flavonoids

由圖4可看出，隨著超聲功率的增大，總黃酮提取得率也隨之增大，當(dāng)超聲功率達(dá)到120 W時(shí)，總黃酮提取得率最大，之后隨著超聲功率的增大，總黃酮提取得率反而急劇下降。與汪明珠等[14]在響應(yīng)曲面優(yōu)化女貞子總黃酮的超聲波提取工藝中的結(jié)果一致。其原因可能是增大超聲功率，細(xì)胞破碎程度也更大，黃酮類化合物溶出量隨之增大，但是過大的超聲功率，熱效應(yīng)產(chǎn)生的高溫使部分黃酮類物質(zhì)被裂解或破壞[15]，導(dǎo)致總黃酮提取得率下降。

2.1.4料液比對蓮子心總黃酮提取得率的影響

分別稱取2 g蓮子心粉末，按料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL）加入體積分?jǐn)?shù)為70 %的乙醇，在超聲功率為120 W，超聲溫度為30℃的條件下超聲提取30 min，研究料液比對總黃酮得率的影響見圖5。

圖5　料液比對黃酮得率的影響Fig.5 Effec of solid to liquid ratio on the yield of total flavonoids

由圖5可看出，當(dāng)料液比小于1∶20（g/mL）時(shí)，料液比越大，總黃酮提取得率也越大，當(dāng)料液比大于1∶20（g/mL）時(shí)，隨著料液比的增大，總黃酮得率逐漸減小。與張俊生等[16]在超聲波輔助乙醇提取蓮子心總黃酮及其抗氧化活性的研究結(jié)果一致。分析其原因，可能是由于隨著溶劑的增大，蓮子心與乙醇溶劑之間的接觸面及濃度差也增加，提高了黃酮類物質(zhì)向溶劑中轉(zhuǎn)移的擴(kuò)散系數(shù)，使得總黃酮提取率增大，當(dāng)料液比超過1∶20（g/mL）時(shí)，溶劑量增多，過多的溶劑會對超聲波產(chǎn)生一定的吸收作用[17]，使得黃酮得率下降。

2.1.5超聲時(shí)間對蓮子心總黃酮提取得率的影響

分別稱取2 g蓮子心粉末，按料液比1∶20（g/mL）加入體積分?jǐn)?shù)為70 %的乙醇，在超聲功率為120 W，超聲溫度為30℃，分別超聲提取10、20、30、40、50、60 min，研究超聲時(shí)間對總黃酮得率的影響見圖6。

圖6　超聲時(shí)間對黃酮得率的影響Fig.6 Effec of ultrasonic treatment time on the yield of total flavonoids

由圖6可看出，當(dāng)超聲時(shí)間為10 min～20 min時(shí)，隨著超聲時(shí)間的加長，總黃酮提取得率也隨著增大，20 min時(shí)達(dá)到最大值，之后，隨著超聲時(shí)間的加長，總黃酮提取得率則逐漸緩慢降低。分析其原因可能是隨著時(shí)間的延長，樣品中黏液質(zhì)等雜質(zhì)進(jìn)入浸提液，使浸提液黏度增大，擴(kuò)散速度變慢，導(dǎo)致黃酮類化合物不易溶出[18]。

2.2響應(yīng)曲面法對蓮子心總黃酮的超聲波提取的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1響應(yīng)曲面試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)結(jié)果

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對總黃酮得率影響較大的因素：乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲溫度為主要考察因素，以蓮子心總黃酮得率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2　Box-Behnken響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experiment design and results of Box-Behnken response surface

續(xù)表2 Box-Behnken響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2 Experiment design and results of Box-Behnken response surface

2.2.2擬合回歸模型方程的建立

運(yùn)用Design-Expert軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到響應(yīng)曲面二次多元回歸模型方程：

y贊=23.519 18-0.383 85A-0.090 457B-0.429 45C+ 1.613 07×10-3A2+ 5.317 30×10-3B2+ 1.844 58×10-3C2-6.880 00×10-4AB+5.081 25×10-3AC-2.720 00×10-3BC

2.2.3試驗(yàn)結(jié)果的方差顯著性分析

對回歸模型進(jìn)行方差分析（表3）。

從表3可以看出：P模型=0.025 6＜0.05，表明該模型顯著。失擬項(xiàng)P=0.5735＞0.05，模型失擬項(xiàng)不顯著。模型的決定系數(shù)R2=0.8601，說明該模型能解釋86.01 %響應(yīng)值變化，擬合程度良好，試驗(yàn)誤差較小，可以用此模型對超聲波輔助提取蓮子心總黃酮得率各因素對其的影響進(jìn)行分析和預(yù)測。

由表3可知，方程一次項(xiàng)A對總黃酮得率有顯著影響，其余各項(xiàng)對結(jié)果影響不顯著，由F值可知，A、B、C三個因素對總黃酮得率影響的主次順序?yàn)锳>C>B；方程二次項(xiàng)對總黃酮得率均不顯著；交互項(xiàng)AC對總黃酮得率有極顯著影響，交互項(xiàng)AB、BC對結(jié)果影響不顯著。由此表明各因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。采用逐步回歸分析的方法在剔除了不顯著項(xiàng)后得到真實(shí)值的優(yōu)化回歸方程為：

y贊=13.901 70-0.171 78A-0.034 725B-0.336 29C+ 5.081 25AC，P模型=0.002 3＜0.01，表明模型極其顯著。失擬項(xiàng)P=0.520 2＞0.05，模型失擬度不顯著。說明該擬合回歸模型方程與實(shí)際情況擬合良好，較好的反應(yīng)了乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲溫度對總黃酮提取得率的影響。

2.2.4兩因素顯著交互作用對總黃酮提取得率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）與超聲溫度（C）的交互作用，圖7是料液比為1∶20（g/mL）時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲溫度的交互作用對蓮子心總黃酮提取得率的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲溫度的增大，總黃酮提取得率從開始的無明顯變化到逐漸增大。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在75 %～80 %，超聲溫度在45℃～50℃時(shí)總黃酮提取得率最大。

圖7　乙醇濃度體積分?jǐn)?shù)與超聲溫度的交互作用對總黃酮得率的影響Fig.7 Effect of ethanol valume fraction and ultrasonic temperature interaction on the yield of total flavanoids

2.2.5最佳工藝條件的預(yù)測與驗(yàn)證

利用得到的回歸方程，通過Design-Expert 6.0.1軟件計(jì)算可知，蓮子心總黃酮提取的最佳工藝參數(shù)為：乙醇濃度79.80 %，料液比1∶15.94（g/mL），超聲溫度49.97℃，超聲功率120 W，超聲時(shí)間20 min，此條件下模型預(yù)測的總黃酮提取得率的最大值為3.097 88 %?？紤]到試驗(yàn)操作的可行性，將最佳工藝條件修正為乙醇濃度80 %，料液比1∶16（g/mL），超聲溫度50℃，超聲功率120 W，超聲時(shí)間20 min，在此最優(yōu)條件下做3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的總黃酮提取得率為3.0715 %，兩者相對誤差為0.86 %，說明建立的數(shù)學(xué)模型可靠性較好，響應(yīng)曲面優(yōu)化蓮子心總黃酮提取的工藝條件可行。

3　結(jié)論

單因素試驗(yàn)中，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60 %～80 %時(shí)提取效果較好；超聲溫度為30℃～50℃時(shí)提取效果較好；料液比為1∶15（g/mL）～1∶25（g/mL）時(shí)提取效果較好；超聲功率為120 W時(shí)提取效果最佳；超聲時(shí)間為20 min最佳。采用響應(yīng)曲面法對超聲波輔助提取蓮子心總黃酮的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，對乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲溫度三個主要影響因素在三個不同水平上進(jìn)行試驗(yàn)。利用回歸方程，得到蓮子心總黃酮提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為：乙醇濃度80 %，料液比1∶16（g/mL），超聲溫度50℃，超聲功率120 W，超聲時(shí)間20 min，此條件下實(shí)際測得總黃酮的提取得率為3.0715%。

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Ultrasound-assisted Extraction of Total Flavonoids from Lotus Plumule with Response Surface Methodology

ZENG Jing，XU Ming-sheng，SHEN Yong-gen*，WU Shao-fu，DING qin
（Engineering Laboratory for Agro-processing and Safety Control of Jiangxi Development and Reform Commission，College of Food Science and Engineering，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，Jiangxi，China）

Abstract：The study aimed at optimizing the condition for extraction of total flavonoids from lotus plumule by means of unrasonic-assisted technique. The effects of ethanol valume fraction，ultrasonic temperature，ultrasonic power，solid-liquid ratio，ultrasonic time on the yield of total flavonoid were discussed in the single factor experiment. Based on the single factor experiment，effects of ethanol valume fraction，solid-liquid ratio，ultrasonic temperature and their interactions on the yield of total flavonoid were analyised by Box-Benhnken response method. The predictive model of polynomial regression equation was analysed by Design Expert software （6.0.1）. The result showed that the optimum extraction of total flavonoids from lotus seed core were：ethanol valume fraction 80 %，solid-liquid ratio 1∶16（g/mL），ultrasonic temperature 50℃，ultrasonic power 120 W，ultrasonic time 20 min，under this conditions the extraction of total flavonoids was 3.071 5 %，consistent with the predicted values.

Key words：lotus plumule；ultrasonic；total flavonoid；response surface；optimization

收稿日期：2015-02-01

*通信作者：沈勇根（1971—），男，教授，碩士，研究方向：食品科學(xué)與工程。

作者簡介：曾璟（1992—），女（漢），碩士生，研究方向：食品工程。

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.031