聚酰胺-大孔樹脂聯(lián)用富集桑葉總黃酮工藝研究

楊超，劉冬戀，譚林，楊春梅，牟倩云（成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川成都610083）

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聚酰胺-大孔樹脂聯(lián)用富集桑葉總黃酮工藝研究

楊超，劉冬戀*，譚林，楊春梅，牟倩云
（成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川成都610083）

摘要：樣品溶液先以聚酰胺吸附，水洗除雜，再將除雜后的聚酰胺加于大孔吸附樹脂頂部，以乙醇洗脫，富集桑葉總黃酮。試驗(yàn)結(jié)果顯示聚酰胺與D-101大孔樹脂聯(lián)用能有效富集桑葉中的總黃酮。最佳工藝條件為聚酰胺料液比2.50 g/mL，大孔樹脂料液比5.50g/mL，以80%乙醇洗脫，收集洗脫液6 BV，富集總黃酮純度為48.09%。該方法優(yōu)于目前常用的桑葉總黃酮富集方法，工藝穩(wěn)定簡(jiǎn)單，具有較好的可行性。

關(guān)鍵詞：總黃酮；桑葉；富集方法；聚酰胺-大孔樹脂聯(lián)用

桑葉為?？浦参锷orua alba L.的干燥葉，桑葉苦、甘、寒，歸肺、肝經(jīng)，具有疏散風(fēng)熱、清肺潤(rùn)燥、平肝明目、涼血止血之功效[1]?，F(xiàn)代藥理及臨床研究表明，桑葉提取物在治療糖尿病、高血壓、高血脂及抗衰老等方面都具有良好的療效。桑葉總黃酮具有降血糖、血脂[2]，清除氧自由基[3]、抗運(yùn)動(dòng)疲勞[4]等作用。目前，桑葉總黃酮的富集主要采用大孔樹脂為主體的純化方法，但富集物的純度普遍較低。本試驗(yàn)用聚酰胺-大孔樹脂聯(lián)用技術(shù)富集桑葉總黃酮，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法，探索使富集物純度大幅度提高的純化方法，為桑葉總黃酮的精制提供理論基礎(chǔ)。

1　材料、試劑與儀器

桑葉（批號(hào)：130624）：四川省中藥飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)成都醫(yī)學(xué)院生藥教研室游元元副教授鑒定為?？浦参锷orus alba L.的干燥葉；蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：13040302）：中國(guó)藥品生物制品鑒定所；X-5、DA-201、AB-8、DM-301、D-101大孔吸附樹脂：天津海光化工有限公司；柱層析用聚酰胺（60目～80目，批號(hào)：20130615）：江蘇長(zhǎng)豐化工有限公司；其它所用試劑均為分析純。

BSA223S型萬(wàn)分之一電子天平：賽多利科學(xué)儀器有限公司；HH-S4型電熱恒溫水浴鍋：北京偉永儀器有限公司；Alpha-1900紫外可見分光光度計(jì)：上海譜元儀器有限公司；R215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士步琪公司；SHZ-82型超聲震蕩儀：江蘇億通電子有限公司。

2　方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品溶液的制備

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.2 mg置于100 mL容量瓶中，以70 %乙醇定容制成濃度為0.202 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL置于25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加5 %亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻放置6min，加10 %硝酸鋁溶液1 mL，搖勻放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度搖勻，放置15 min，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。以濃度（C）與吸收度（A）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=7.237 5C+0.089 0，R2=0.999 7，表明二者在5.1 μg/mL～36.4 μg/mL的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.3供試品溶液的制備及測(cè)定方法

取適量桑葉打粉過(guò)40目篩，用25倍量體積分?jǐn)?shù)為70 %的乙醇浸泡1 h，超聲30 min，冷凝回流1.5 h，濾過(guò)，減壓回收至溶劑無(wú)醇味，浸膏用70 %乙醇溶解，并稀釋至質(zhì)量濃度為0.263 g/mL，作為上柱供試液，并按照文獻(xiàn)方法[5]測(cè)定，得到藥材中總黃酮的量為3.75 %。

2.4聚酰胺洗脫分析

精密量取上柱供試液適量（約相當(dāng)于2.00 g浸膏），拌入2 g干燥聚酰胺粉末，揮去溶劑后裝入1.5 cm× 20 cm的層析柱，依次用水及20 %、40 %、60 %、80 %、95 %乙醇洗脫，分別收集洗脫液5 BV，將洗脫液干燥后稱重，得到洗脫液中含有的固體量。同時(shí)，通過(guò)測(cè)定洗脫液中總黃酮的量，計(jì)算總黃酮的純度和收率。

總黃酮純度/% =（洗脫液中所含總黃酮量/洗脫液含固體量）×100；

總黃酮收率/% =（洗脫液中所含總黃酮量/上柱前藥液所含總黃酮量）×100。

結(jié)果見圖1。

圖1　不同濃度的乙醇溶液對(duì)聚酰胺樹脂洗脫的影響Fig.1 Effect of different concentration ethanol on elution of polyamide resin

由圖1可知，在水洗脫液和95 %乙醇洗脫液中，總黃酮收率相對(duì)較少，雜質(zhì)較多，而60 %～80 %乙醇洗脫液中的總黃酮純度和收率均較高，具有很好的總黃酮富集作用。藥液經(jīng)過(guò)聚酰胺的吸附后，用水將生物堿類成分和水溶性雜質(zhì)脫除，再用60 %～80 %的乙醇作為洗脫液，可實(shí)現(xiàn)桑葉總黃酮的初步富集。

2.5大孔樹脂型號(hào)的篩選

取等量型號(hào)不同的大孔樹脂，見表1。

表1　5種樹脂的物理特性Table 1 Physical characteristics of five resin

預(yù)處理后裝入層析柱。供試品溶液5等份分別加入等量的聚酰胺粉末，揮干溶劑后置于1.5 cm×20 cm的層析柱中，以等量水洗脫至流出液近無(wú)色（7 BV）。將水洗脫后的聚酰胺分別置于預(yù)先以水為填充溶劑的大孔樹脂層析柱（2.5 cm×30 cm）上部，用80 %乙醇洗脫，收集洗脫液5 BV。測(cè)定洗脫液中的固體量及總黃酮的量，計(jì)算總黃酮純度和收率。結(jié)果見圖2。

圖2　不同型號(hào)大孔樹脂對(duì)桑葉總黃酮洗脫效果的考察Fig.2 Elution for total flavonoids of mulberry leaves on different types of macroporous resins

由圖2可知，5種樹脂中非極性的D-101在桑葉總黃酮的純度和收率方面效果最好，因此，選用D-101為優(yōu)選大孔樹脂。

2.6洗脫溶劑濃度的考察

精密量取供試品溶液適量（約相當(dāng)于2.00 g浸膏）與2.00 g聚酰胺混合，置于預(yù)先以水為溶劑填充的D-101大孔樹脂層析柱上部，先以水洗至流出液近無(wú)色（5 BV），后依次用體積分?jǐn)?shù)為15 %、30 %、50 %、60 %、70 %、80 %、95 %乙醇洗脫，分別收集洗脫液6 BV，測(cè)定洗脫液中所含的固體重量和總黃酮的量，計(jì)算總黃酮純度和收率。結(jié)果見圖3。

由表3可知，供試液經(jīng)聚酰胺初步精制后再通過(guò)大孔樹脂柱，60 %～80 %乙醇洗脫部分總黃酮收率為69.17 %，其中80 %乙醇洗脫部分總黃酮的純度和收率分別為45.53 %、48.31 %，因此選用80 %乙醇作為洗脫溶劑。

圖3　不同濃度乙醇對(duì)洗脫效果的影響Fig.3 Effects of different ethanol concentrations on elution efficiencies

2.7響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.7.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，12個(gè)分析點(diǎn)，5個(gè)零點(diǎn)以估計(jì)誤差，選用聚酰胺（g）與上樣體積（mL）之比即聚酰胺料液比X1、洗脫液收集量X2、大孔樹脂（g）與上樣體積（mL）之比即大孔樹脂料液比X3為變量，以桑葉總黃酮純度為響應(yīng)值R進(jìn)行響應(yīng)面分析。試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平表見表2。

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)水平表Table 2 Factors and levels of RSM

2.7.2數(shù)據(jù)處理

利用Design-Expert 8.0.5軟件，采用二項(xiàng)式模型進(jìn)行回歸分析。

2.7.3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3、4。

表3　響應(yīng)面分析結(jié)果Table 3 The results of response surface analysis

續(xù)表3　響應(yīng)面分析結(jié)果Continue table 3 The results of response surface analysis

注：*表示P<0.05；**表示P<0.01。

通過(guò)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到二次回歸擬合方程式：總黃酮純度/% = 47.04+1.17X1-1.57X2-3.05X3+4.14X1X2-3.80X1X3-0.14X2X3-2.24X12-6.40X22-4.83X32

由表4可知，模型的P<0.01，說(shuō)明試驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型具有極顯著性；失擬項(xiàng)P>0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著；且校正系數(shù)R2=0.972 9，表明模型充分?jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，因此可用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)純化桑葉總黃酮的工藝[6]。由F值可知，各因素對(duì)總黃酮純度的影響次序：洗脫液收集量>大孔樹脂料液比>聚酰胺料液比。

2.7.4響應(yīng)面圖分析

利用RSM研究聚酰胺料液比、洗脫液收集量與大孔樹脂料液比的交互作用對(duì)桑葉總黃酮純度的影響，得出響應(yīng)面分析圖及相應(yīng)等值線圖。結(jié)果見圖4。

圖4（A）中，由交互作用的等高線可知，沿洗脫液收集量軸向等高線密集，而大孔樹脂料液軸向等高線相對(duì)稀疏，說(shuō)明洗脫液收集量對(duì)響應(yīng)值峰值的影響比大孔樹脂料液比大。圖4（B）中，聚酰胺料液比對(duì)響應(yīng)值影響不顯著，表現(xiàn)為曲面平緩，等高線稀疏，大孔樹脂料液比軸向等高線相對(duì)密集，說(shuō)明大孔樹脂料液比對(duì)響應(yīng)值峰值的影響比聚酰胺料液比大。圖4（C）中響應(yīng)值隨洗脫液收集量呈現(xiàn)由低到高再降低的趨勢(shì)，即響應(yīng)值在零水平附近具有極大值。洗脫液收集量軸向等高線相對(duì)密集，說(shuō)明洗脫液收集量對(duì)響應(yīng)值峰值的影響比聚酰胺料液比大。

圖4　兩因素交互作用對(duì)總黃酮純度的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots for the effect of operating parameters on the purity of total flavonoids

因此推斷對(duì)響應(yīng)值的影響順序?yàn)椋合疵撘菏占浚敬罂讟渲弦罕龋揪埘０妨弦罕?，這和方差分析結(jié)果一致?？赏ㄟ^(guò)軟件對(duì)模型極值求解和分析等高線得到最佳洗脫條件：聚酰胺料液比2.48 g/mL，洗脫液收集量6.12 BV，大孔樹脂料液比5.36 g/mL。

2.8驗(yàn)證試驗(yàn)

為檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，采用最優(yōu)提取條件進(jìn)行桑葉總黃酮的分離純化試驗(yàn)，同時(shí)考慮到實(shí)際操作的便利，將洗脫的最佳條件修正為聚酰胺料液比2.50 g/mL，洗脫液收集量6 BV，大孔樹脂料液比5.50 g/mL，實(shí)際得到總黃酮純度為48.09 %，總黃酮的純度由原來(lái)的3.75 %提高到48.09 %，提高了12.84倍，表明此工藝提取效果較為理想性。

3　討論

聚酰胺、大孔吸附樹脂是分離總黃酮類物質(zhì)的常用材料，其吸附機(jī)理不同，聚酰胺分子中含有豐富的酰胺基，可與黃酮類和多酚類化合物的酚羥基形成氫鍵結(jié)合從而被吸附，化合物分子中酚羥基數(shù)目越多，吸附力越強(qiáng)[7]。大孔樹脂具有良好的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和很高的比表面積，可以通過(guò)物理吸附方式從水溶液中有選擇地吸附有機(jī)物，從而達(dá)到分離提純的目的[8]。D-101大孔樹脂是一種非極性的吸附樹脂，通過(guò)與小分子內(nèi)的疏水部分的作用吸附溶液中有機(jī)物[9]。將聚酰胺與大孔吸附樹脂聯(lián)用可充分發(fā)揮兩者優(yōu)勢(shì)，彌補(bǔ)不足。選擇以聚酰胺作吸附劑，是因?yàn)榫埘０房奢^好的截留中藥中的色素和部分脂溶性成分從而減輕了大孔樹脂的負(fù)擔(dān)和壓力，且經(jīng)過(guò)水洗可除去大部分水溶性雜質(zhì)，有效的保留了主要藥效成分總黃酮[10]。利用大孔樹脂吸附和分子篩的雙重作用，經(jīng)聚酰胺初步精制的上柱液進(jìn)入大孔樹脂柱后將得到進(jìn)一步分離純化。

本試驗(yàn)對(duì)幾種常用的大孔樹脂進(jìn)行了篩選，選出非極性的D-101為富集桑葉總黃酮的優(yōu)選樹脂，同時(shí)進(jìn)行了聚酰胺料液比、大孔樹脂料液比、洗脫劑濃度和洗脫液收集量的考察，得到桑葉總黃酮較高的純度。但由于時(shí)間的關(guān)系，未對(duì)樹脂徑高比、聚酰胺的拌合方式、水洗脫用量和低濃度乙醇除雜效果等因素進(jìn)行考察，這些工作有待于進(jìn)一步研究。

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Enrichment of Total Flavonoids of Mulberry Leaves with Polyamide-macroporous Resin

YANG Chao，LIU Dong-lian*，TAN Lin，YANG Chun-mei，MOU Qian-yun
（Department of Pharmacy，Chengdu Medical College，Chengdu 610083，Sichuan，China）

Abstract：Polyamide adsorbed with sample was washed with water first to eliminate the impurities and then was loaded on the top of macroporous resin．The total flavonoids of mulberry leaves were enriched by eluting with ethanol．The results showed that D -101 resin combined with polyamide could effectively enrich the total flavonoids of mulberry leaves. The preferred condition for the procedure was as following：the weight of polyamide and D-101 resin was 2.50 and 5.50 times of the volume of sample，respectively．The volume of 80 % ethanol for elution was 6 times of the column volume．The purity of total flavonoids reached to 48.09 %．The process is simple and convenient，and the regeneration of resin is easy，which has a good application foreground．

Key words：total flavonoids；mulberry leaves；enriching method；polyamide-macroporous resin

收稿日期：2015-09-14

*通信作者：劉冬戀，女，碩士，實(shí)驗(yàn)師。

作者簡(jiǎn)介：楊超（1992—），男（漢），學(xué)士，研究方向：藥學(xué)。

基金項(xiàng)目：四川省省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201313705013）；成都醫(yī)學(xué)院校級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（CXJS201419）；成都醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室開放項(xiàng)目（Kf201406）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.011