紅景天注射液HPLC指紋圖譜研究

楊勝巖，趙國(guó)華，王仁久，房宗寶，吳海波，劉倩，唐鋮，3，段宏泉，3

（1.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300070；2.通化玉圣藥業(yè)有限公司，通化134000；3.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心，天津300070）

論著

紅景天注射液HPLC指紋圖譜研究

楊勝巖1，趙國(guó)華2，王仁久2，房宗寶2，吳海波2，劉倩1，唐鋮1，3，段宏泉1，3

（1.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300070；2.通化玉圣藥業(yè)有限公司，通化134000；3.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心，天津300070）

目的：建立紅景天注射液的色譜指紋圖譜，為紅景天注射液的質(zhì)量控制提供依據(jù)。方法：采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，以Agilent XDB C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱為固定相，乙腈-水（0.07%磷酸）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速0.8 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm，柱溫30℃；以中國(guó)藥典指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004版）對(duì)注射液進(jìn)行指紋圖譜數(shù)據(jù)分析。結(jié)果：所建立的色譜條件能夠有效分離紅景天注射液的主要成分，確定了6個(gè)共有峰，以化學(xué)對(duì)照品比對(duì)結(jié)合HPLC-MS鑒定了其中5個(gè)色譜峰，分別為沒(méi)食子酸、對(duì)羥基苯甲酸、酪醇、紅景天苷和對(duì)香豆酸。方法學(xué)考察結(jié)果表明，文中所建分析方法精密度RSD≤1.90%、重現(xiàn)性RSD≤0.32%、穩(wěn)定性RSD≤1.63%，均符合要求。對(duì)9個(gè)批次注射液進(jìn)行的指紋圖譜分析結(jié)果表明相似度均大于0.96。結(jié)論：文中所建立的指紋圖譜分析方法準(zhǔn)確可靠，可以用于紅景天注射液的質(zhì)量控制。

紅景天注射液；高效液相色譜指紋圖譜；色譜峰鑒定；相似度評(píng)價(jià)

紅景天（Rhodiola rosea L.）的主要成分為紅景天苷、酪醇和酚酸類化合物等，具有抗疲勞、抗衰老、增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶、抑制腫瘤、提高免疫等多種功能[1-2]；其所含多元酚類化合物和黃酮類化合物具有抗氧化作用[3]，對(duì)心腦血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用[4-5]；能擴(kuò)張血管，增加冠脈血流量，減少心肌耗氧量，改善心肌微循環(huán)，從而改善心肌的供血供氧[6]，并能夠增強(qiáng)機(jī)體對(duì)缺氧的耐受力，快速緩解心血管疾病癥狀。近些年來(lái)，已有將該藥制成注射液應(yīng)用于臨床的報(bào)道[7]。中藥注射液由于直接進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)，其質(zhì)量控制水平的提高對(duì)于保障質(zhì)量，防止注射液不良反應(yīng)的發(fā)生尤為重要。近年來(lái)，指紋圖譜技術(shù)被逐步應(yīng)用于中藥注射液的質(zhì)量控制，其優(yōu)點(diǎn)在于可全面反映中藥復(fù)雜的化學(xué)成分及其相對(duì)比例，在大多數(shù)中藥有效成分尚未闡明的現(xiàn)狀下，仍可有效地表征中藥質(zhì)量。與現(xiàn)行的單一有效成分或指標(biāo)性成分鑒定相比，指紋圖譜所含的信息量更大，更為科學(xué)、合理[8]。本文采用高效液相色譜法建立紅景天注射液指紋圖譜分析條件，通過(guò)對(duì)多批次注射液分析確定共有峰，結(jié)合HPLC-MS和HPLC保留時(shí)間和對(duì)照品疊加試驗(yàn)方法對(duì)共有峰進(jìn)行指認(rèn)，進(jìn)一步通過(guò)方法學(xué)考察建立色譜指紋圖譜分析方法，為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制方法的改進(jìn)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Agilent 1200 series高效液相色譜儀，包括二元高壓泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器，Agilent Chemstation工作站；中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004版（國(guó)家藥典委員會(huì)）；分析天平（十萬(wàn)分之一，上海恒平科學(xué)儀器有限公司）。

紅景天苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110818-201206）；酪醇對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111676-200602）；乙腈（色譜純，百靈威公司）；超純水（Merck Millipore Q-Gard T1）；其他試劑均為市售分析純；紅景天注射液(通化玉圣藥業(yè)有限公司，批號(hào)：3001141104-1，3001141105-1，3001141201-1，3001141202-1，3001141204-1，3001141205-1，3001141206-1，3001141207-1，3001150105-1，3001150106-1，3001150107-1，3001150108-1，3001150109-1，3001150110-1，3001150201-1，3001150202-1，3001150203-1，3001150204-1，3001141103-1，3001141208-1，3001141209-1，3001141210-1，3001150101-1，3001150102-1，3001150103-1，1001150401-1，1001150402-1）。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照品及供試品溶液的配制 精密稱取紅景天苷對(duì)照品5.12 mg，酪醇對(duì)照品1.72 mg，分別置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，分別制得濃度為0.512mg·mL-1的紅景天苷貯備液和0.172 mg·mL-1的酪醇貯備液。精密吸取紅景天注射液1.0 mL，用超純水稀釋至10.0 mL，搖勻，所得溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.2.2 色譜條件 本品含有的主要藥效物質(zhì)為紅景天苷和酪醇等苯乙醇苷化合物，通過(guò)紅景天苷、酪醇全波長(zhǎng)掃描分析可知，上述化合物的最大吸收波長(zhǎng)均在278 nm。故本文選擇278 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。固定相：Agilent XDB C18色譜柱（5 μm，250 mm× 4.6 mm）；流動(dòng)相：A-乙腈，B-0.07%磷酸水溶液，梯度洗脫，0～10 min，0～0A；10～30 min，0～3%A；30～38min，3%～5%A；38～45min，5%～7%A；45～50min，7%～13%A；50～60min，13%～22%A；檢測(cè)波長(zhǎng)：278nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30℃；流速：0.8 mL·min-1。

1.2.3 色譜指紋圖譜的建立

1.2.3.1 共有峰的確定：按照“1.2.2”項(xiàng)下色譜條件，分析18批注射液的色譜指紋圖譜。

1.2.3.2 各色譜峰的化學(xué)成分鑒定：參照文獻(xiàn)[9]并適當(dāng)調(diào)整，建立質(zhì)譜分析條件如下：（1）儀器一：Agilent 1200 series高效液相色譜儀，Bruker HCT Iontrap三維離子阱質(zhì)譜儀，BrukerESICompass1.3for HCT/Esquire工作站；質(zhì)譜條件：ESI源，負(fù)離子檢測(cè)模式，掃描范圍為m/z100～1000，毛細(xì)管電壓為145 V，錐孔電壓為30 V，脫溶劑氣為氮?dú)猓?50℃，8 L/min。（2）儀器二：Agilent 6520 QTOF四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀，Agilent MassHunter Workstation Qualitative Analysis工作站；質(zhì)譜條件：ESI源，負(fù)離子檢測(cè)模式，掃描范圍為m/z 50～1 000，毛細(xì)管電壓為200 V，錐孔電壓為30V，脫溶劑氣為氮?dú)猓?80℃，6L/min。

1.2.4 色譜指紋圖譜方法學(xué)考察

1.2.4.1 精密度試驗(yàn)：取同一批次紅景天注射液1支，按“1.2.1項(xiàng)”下制備方法制備供試液；按“1.2.2項(xiàng)”下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次。

1.2.4.2 重現(xiàn)性試驗(yàn)：取同一批次紅景天注射液6支，分別按“1.2.1項(xiàng)”下制備方法制備供試液6份；按“1.2.2項(xiàng)”下色譜條件，分別進(jìn)樣分析。

1.2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批次紅景天注射液1支，按“1.2.1項(xiàng)”下制備方法制備供試液；按“1.2.2項(xiàng)”下色譜條件，分別于0、2、6、10、12、24 h進(jìn)樣分析。

1.2.5 對(duì)照?qǐng)D譜的生成和相似度評(píng)價(jià) 對(duì)18批紅景天注射液按“1.2.2項(xiàng)”下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。將紅景天注射液色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》研究，計(jì)算各樣品指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度。

1.2.6 市售樣品指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià) 取市售該企業(yè)的9批注射液，按上文中建立的指紋圖譜測(cè)定方法檢測(cè)，將所得指紋圖譜和上述紅景天注射液對(duì)照指紋圖譜通過(guò)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004B版》對(duì)各圖譜進(jìn)行全譜匹配，計(jì)算各樣品指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度。

2 結(jié)果

2.1 色譜指紋圖譜的建立

2.1.1 共有峰的確定 通過(guò)比較18批供試品色譜指紋圖譜的共有色譜峰，選擇穩(wěn)定性好、吸收強(qiáng)、特征明顯的色譜峰為共有峰，共標(biāo)定6個(gè)峰，見(jiàn)圖1。

圖1 紅景天注射液的色譜指紋圖譜Fig 1 The chromatographic fingerprint of Hongjingtian injection

2.1.2 各色譜峰的化學(xué)成分鑒定 通過(guò)分子離子峰與紅景天化學(xué)成分比較分析，分子離子峰提取TIC峰與UV色譜峰保留時(shí)間比對(duì)，鑒定了5個(gè)化學(xué)成分，見(jiàn)表1。

表1 5個(gè)共有色譜峰的化學(xué)成分鑒定Tab 1 Identifyingchemicalconstituentsof5commonchromatographic peaks

進(jìn)一步采用化學(xué)對(duì)照品的保留時(shí)間及與注射液疊加試驗(yàn)分析對(duì)比，最終確定本文鑒定的5個(gè)共有色譜峰的化學(xué)成分無(wú)誤。

2.2 色譜指紋圖譜方法學(xué)考察

2.2.1 精密度試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)共有峰進(jìn)行比較，選定第5個(gè)共有峰紅景天苷為參照物峰（S峰），結(jié)果顯示各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD≤0.16%，各共有峰相對(duì)峰面積RSD≤1.90%，表明精密度良好。

2.2.2 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果 各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD≤0.17%，各共有峰相對(duì)峰面積的RSD≤0.32%，表明所建方法重現(xiàn)性較好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD≤0.83%，各共有峰相對(duì)峰面積RSD≤1.63%。表明所建方法穩(wěn)定性良好。

2.3 對(duì)照?qǐng)D譜的生成和相似度評(píng)價(jià) 對(duì)18批紅景天注射液進(jìn)行測(cè)定并將紅景天注射液色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》，研究結(jié)果見(jiàn)圖2，相似度計(jì)算結(jié)果顯示18批樣品相似度均在0.9以上，平均為0.982，RSD為0.85%。生成紅景天注射液對(duì)照指紋圖譜見(jiàn)圖3。

2.4 市售樣品指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià) 各樣品指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度結(jié)果見(jiàn)表2，9批注射液相似度均高于0.970，表明不同批次紅景天注射液相似度較高，指紋圖譜相似性良好說(shuō)明工藝較穩(wěn)定。

圖2 1～18批紅景天注射液指紋圖譜（R為對(duì)照指紋圖譜）Fig 2 The fingerprints of the 1-18 batches of Hongjingtian injection(R is the control fingerprint)

圖3 紅景天注射液對(duì)照指紋圖譜Fig 3 Control fingerprint of the Hongjingtian injection

表2 9批紅景天注射液樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 2 Results for the similarity evaluation of the 9 batches of Hongjingtian injection

3 討論

在檢測(cè)波長(zhǎng)選擇方面：由于中藥產(chǎn)品中存在的物質(zhì)成分差別較大，指紋圖譜樣品在色譜響應(yīng)行為上也有較大差別。因此檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇就顯得尤為重要[10]。檢測(cè)波長(zhǎng)選擇的主要原則是整體全面，盡可能減少數(shù)據(jù)間差別，達(dá)到最優(yōu)化的顯示[11]。本品主要化學(xué)成分為紅景天苷和酪醇，兩者最大吸收均為278 nm，結(jié)合DAD檢測(cè)譜圖中紅景天各色譜峰隨波長(zhǎng)的峰高分布情況，研究表明該化合物在278 nm波長(zhǎng)處色譜峰數(shù)目最多且峰面積最大，可滿足有效指紋信息最大化原則，故最終確定以278 nm檢測(cè)波長(zhǎng)用于注射液的綜合質(zhì)量控制。

在色譜柱選擇方面：本文分別采用Agilent XDB C18（250mm×4.6mm，5μm）、AgilentXDBC18（150mm× 4.6mm，5μm）、AgilentZorbaxSBC18（250mm×4.6mm，5 μm）和Agilent Zorbax Extend C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）4種色譜柱，對(duì)同一批號(hào)的樣品進(jìn)行分析比較。結(jié)果顯示紅景天苷和酪醇在使用Agilent XDB C18分離時(shí)，可將各組分較好地分離，峰形良好并且分析時(shí)間較短，故最終選用Agilent XDB C18(150 mm× 4.6 mm，5 μm)進(jìn)行指紋圖譜檢測(cè)。

在特征峰的指認(rèn)方面，本文進(jìn)一步做了HPLC疊加分析試驗(yàn)。眾所周知，HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)雖然能夠快速鑒定色譜指紋圖中色譜峰所對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)，但是無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)別分子量相同而化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的化學(xué)成分，特別是中藥化學(xué)成分組成復(fù)雜，同分異構(gòu)體也很多，很難利用分子離子峰的裂解規(guī)律進(jìn)行鑒定。現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道常采用混合化學(xué)對(duì)照品分析，通過(guò)保留時(shí)間指認(rèn)色譜峰所對(duì)應(yīng)化學(xué)成分，但由于儀器分析精密度的局限性，如無(wú)法區(qū)分保留時(shí)間相差0.1～0.2 min的不同化學(xué)成分，而疊加試驗(yàn)則可以避免這類問(wèn)題。本研究采用化學(xué)對(duì)照品與注射液疊加試驗(yàn)作為色譜峰鑒定的補(bǔ)充。上述兩種方法相結(jié)合，鑒定的指紋圖譜中色譜峰所對(duì)應(yīng)化學(xué)成分準(zhǔn)確、依據(jù)充分。

本文建立的HPLC測(cè)定紅景天注射液指紋圖譜的方法，能較為全面地反映紅景天注射液的化學(xué)組成及其相對(duì)比例，有助于對(duì)藥品質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評(píng)價(jià)。

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（2015-09-15收稿）

Study on fingerprint of Hongjingtian injection by HPLC

YANG Sheng-yan1,ZHAO Guo-hua2,WANG Ren-jiu2,FANG Zong-bao2,WU Hai-bo2,LIU Qian1,TANG Cheng1,3,DUAN Hong-quan1,3
（1.Tianjin Key Laboratory on Technologies Enabling Development of Clinical Therapeutics and Diagnostics(Theranostics),School of Pharmacy,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2.Tonghua Yu Sheng Pharmaceutical Co.,Ltd.,Tonghua 134000,China; 3.Research Center of Basic Medical Sciences,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China)

Objective：To establish a HPLC fingerprint method and improve the quality control of Hongjingtian injection.Methods：Agilent XDB C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)column was used as stationary phase.And water containing 0.07%phosphoric acid－acetonitrile system was utilized as a mobile phase,at the flow rate of 0.8 mL·min-1.The detection wavelength was 278 nm,and the column temperature was set at 30℃.All the data was analyzed by fingerprint evaluation system(2004).Results：Components of Hongjingtian injection were analyzed.Six common peaks were obtained for standard fingerprint chromatography and five of them such as gallic acid,p-hydroxybenzoic acid,tyrosol,salidroside,p-hydroxycinnamic acid were identified by HPLC-MS and standard compounds.The similarities of nine batches sample were above 0.96.Conclusion：HPLC fingerprint method is accurate and reliable,and could be used for the quality control of Hongjingtian injection.

Hongjingtian injection;HPLC fingerprint;chromatograpic peak identification;similarity evaluation

R9

A

1006－8147（2016）02-0164-04

楊勝巖(1991-),女,碩士在讀,研究方向：中藥現(xiàn)代質(zhì)量控制與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；通信作者：段宏泉,E-mail:duanhq@tijmu.edu.cn。