131I標(biāo)記新型小分子肽VP2

馬　歡，唐　禹，楊遠(yuǎn)友，劉　寧，廖家莉，楊吉軍

(四川大學(xué) 原子核科學(xué)技術(shù)研究所 輻射物理及技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都　610064)

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131I標(biāo)記新型小分子肽VP2

馬歡，唐禹，楊遠(yuǎn)友，劉寧，廖家莉，楊吉軍

(四川大學(xué) 原子核科學(xué)技術(shù)研究所 輻射物理及技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都610064)

摘要：本文通過(guò)雙功能偶聯(lián)劑5-(三正丁基錫)-3-吡啶甲酸-N-琥珀酰亞胺酯(SPC)將(131)I標(biāo)記到小分子融合多肽VP2上，研究了(131)I標(biāo)記多肽VP2的體內(nèi)外穩(wěn)定性及在正常小鼠體內(nèi)的代謝與分布。結(jié)果表明，該標(biāo)記藥物室溫下放置48 h后放化純度仍可達(dá)97%，其在小鼠體內(nèi)可通過(guò)胃腸道快速代謝，在甲狀腺的攝取較低。用間接標(biāo)記法得到的(131)I-SPC-VP2在體內(nèi)外有良好的穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：(131)I；VP2；標(biāo)記藥物；小分子肽；生物分布

血管活性腸肽受體VIPRs是血管活性腸肽和垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽的功能性受體，在人類腫瘤及轉(zhuǎn)移部位高度表達(dá)[1]。一般說(shuō)來(lái)，VIPRs包含VPAC1、VPAC2和PAC1，而其中VPAC1受體可通過(guò)反式激活表皮生長(zhǎng)因子受體和表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤血管生成[2-3]。研究表明，VPAC1在惡性上皮腫瘤中高度表達(dá)，如結(jié)腸癌、直腸癌、肺癌和乳腺癌[4-5]，因此，該受體被視為是腫瘤診斷和治療的一個(gè)理想靶點(diǎn)。近期第三軍醫(yī)大核醫(yī)學(xué)科用噬菌體展示技術(shù)發(fā)現(xiàn)了對(duì)VPAC1受體有良好親和力的多肽VP2，作為一種新型小分子肽，VP2載體被證實(shí)具有諸多優(yōu)點(diǎn)，例如對(duì)VPAC1受體和幾個(gè)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系有高度特異性和親和力[6]；相對(duì)分子質(zhì)量小，在腫瘤組織中有較強(qiáng)的穿透力；生物半衰期短，清除快；較低的免疫原性等特性。為211At等核素的體內(nèi)放射治療提供了一個(gè)極有希望的靶向載體?；?31I及其同位素的優(yōu)良性質(zhì)，用放射性碘標(biāo)記的VP2多肽有希望成為早期結(jié)腸癌、直腸癌及其他癌癥的診斷分子成像探針?biāo)幬?。同時(shí)，131I與211At同族，有相似的化學(xué)性質(zhì)，本研究擬對(duì)131I標(biāo)記多肽在小鼠體內(nèi)的分布與代謝進(jìn)行探索，以促進(jìn)腫瘤診斷與治療的新型碘標(biāo)記藥物研發(fā)工作，對(duì)211At標(biāo)記藥物的研發(fā)提供參考。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

硅膠粉(Silicagel，200～400 mesh):Aldrich產(chǎn)品；氯代琥珀酰亞胺(NCS，純度>98%)：JK產(chǎn)品；Sephadex G10凝膠：瑞典Pharmacia公司；其他試劑為市售分析純，蒸餾水為高純水；Na131I(1.85×1012Bq/L,pH=7.0～9.0的NaOH溶液)：成都中核高通同位素股份有限公司；小分子融合多肽VP2(Ac-Gly-Phe-Arg-Phe-Gly-Ala-Leu-His-Glu-Tyr-Asn-Ser-NH2)：相對(duì)分子質(zhì)量約1 kDa，購(gòu)于上海耀強(qiáng)生物科技有限公司。

FH-603井型閃爍探頭、FH463A自動(dòng)定標(biāo)器：北京核儀器廠；INOVA-400MHz核磁共振儀：美國(guó)Bruker公司；高效液相色譜儀(HPLC)：美國(guó)Beckman公司334系列；BS210S電子天平：德國(guó)Sartorius公司；RE252C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、恒溫磁力攪拌器:上海亞榮生化儀器廠；PHS-3C精密pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明小鼠：(20 ±2) g，雌雄各半，購(gòu)于四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1雙功能偶聯(lián)劑SPC的合成

參照文獻(xiàn)[7]的方法，經(jīng)酯化、錫化、水解與琥珀酰化合成了雙功能偶聯(lián)劑5-(三正丁基錫)-3-吡啶甲酸-N-琥珀酰亞胺酯(SPC)，產(chǎn)物經(jīng)核磁(1H NMR)與質(zhì)譜(MS)表征分析，結(jié)果與文獻(xiàn)一致。產(chǎn)物SPC的1H NMR：(CDCl3，400 MHz)δ：0. 88～1. 63 (m，27H，3 × n-C4H14)，2.94(s,4H,COCH2CH2CO)，8. 41(s，1H，C-4H)，8.86(s，1H，C-6H)，9. 22(s，1H，C-2H)；SPC的MS(ESI)+：m/z511 (M+1，計(jì)算值510)；MS(ESI)-：m/z509(M-1，計(jì)算值510)。

2.2131I標(biāo)記小分子肽

參照文獻(xiàn)[8]的方法，在微型反應(yīng)管中依次加入100 μL Na131I(約1.8×108Bq)溶液、6 μL 冰醋酸、40 μL 20 g/L NCS的丙酮溶液和80 μL 10 g/L SPC的甲醇溶液，在65 ℃水浴中反應(yīng)5 min后，轉(zhuǎn)入室溫再反應(yīng)30 min，加入10 μL 20g/L Na2S2O3溶液終止反應(yīng)。經(jīng)薄層層析法(TLC)分析標(biāo)記率，TLC層析液為V(C6H14)∶V(乙酸乙酯)=1∶1。

通入氮?dú)廒s去有機(jī)相，然后加入500 μL 0.5 g/L的多肽溶液(溶解在0.1 mol/L，pH=9.0 硼酸鹽緩沖溶液中)，室溫下經(jīng)漩渦振蕩器震蕩10 min。再由Sephadex G10凝膠柱分離，用0.1 mol/L pH=7.6 的磷酸鹽緩沖液(PBS)淋洗， 每管收集1.5 mL淋洗液，測(cè)量每管的放射性活度，繪出淋洗曲線。

2.3131I-SPC-VP2體外穩(wěn)定性

將含131I-SPC-VP2的管淋洗液合并在一起備用，分別取500 μL淋洗液與血清及PBS等體積混合，室溫下放置。分別于1、24、48 h取樣，TLC分析標(biāo)記物的放化純度。層析液為V(MeOH)∶V(CHCl3)=1∶4。

2.4131I-SPC-VP2在正常小鼠體內(nèi)分布

將56只小鼠(雌雄各半)隨機(jī)分成14組，其中7組通過(guò)尾靜脈注射131I-SPC-VP2，另外7組注射Na131I溶液(用0.1 mol/L，pH=7.6的PBS稀釋)，每只注射0.2 mL放射性液體(約1.2×106Bq)，注射后分別于0.5、1、3、6、12、24、48 h處死，取血、心臟、肝臟、脾臟、腎、肺、胃、腸、肌肉與甲狀腺等組織，稱重并測(cè)量其放射性計(jì)數(shù)，甲狀腺連帶周圍組織一并取下但不稱重，計(jì)算各組織的放射性攝取率(%ID/g)。

3結(jié)果與討論

3.1131I標(biāo)記小分子肽

加入Na2S2O3溶液終止反應(yīng)，通過(guò)TLC分析標(biāo)記率，131I-SPC的Rf為0.5，而游離131I的Rf約為0，當(dāng)偶聯(lián)劑SPC與氧化劑NCS的溶劑分別為甲醇和丙酮時(shí)，131I-SPC的標(biāo)記率可達(dá)91%(圖1、圖2)，比二氯甲烷為溶劑的標(biāo)記率高(表1)。甲醇與丙酮既能與有機(jī)試劑相溶又能與水相溶，能很好的將Na131I與NCS、SPC混合起來(lái)，增大接觸面積，有利于反應(yīng)的進(jìn)行，提高標(biāo)記率。而以二氯甲烷為溶劑時(shí)，因二氯甲烷不能和水互溶，Na131I與NCS、SPC不能很好的接觸，標(biāo)記率比以甲醇和丙酮作溶劑稍低。實(shí)驗(yàn)體系為混合溶液體系，主要考慮到氧化劑NCS在一般的溶劑中溶解性不高，在保證NCS溶解度的同時(shí)不影響活性酯SPC的活性。與多肽偶聯(lián)后經(jīng)Sephadex G10凝膠柱淋洗得到的第一個(gè)放射性峰為最終標(biāo)記產(chǎn)物，總標(biāo)記率為28%，淋洗曲線如圖3所示。

圖1　 131I-SPC的TLC分析Fig.1　Radioanalysis of the 131I labeled mixture by TLC

圖2　Na131I的TLC分析Fig.2　Radioanalysis of Na131I by TLC

反應(yīng)體系不同反應(yīng)時(shí)間的標(biāo)記率5min10min20min30min二氯甲烷41%62%68%71%[10]三氯甲烷60%70%72%79%甲醇+丙酮86%83%86%91%

圖3　131I-SPC-VP2經(jīng)Sephadex G10 的淋洗曲線Fig.3　Elution profile of 131I-SPC-VP2 purified by Sephadex G10 column

3.2131I-SPC-VP2體外穩(wěn)定性

將含有131I-SPC-VP2的0.1 mol/L PBS淋洗液(pH=7.6)及與血清的混合液在室溫下放置2 d，其放化純度無(wú)明顯變化，結(jié)果如表2所示，即使在48 h后其放化純度仍可達(dá)97%，表明以SPC為雙功能偶聯(lián)劑的間接標(biāo)記物在體外具有較高的穩(wěn)定性。

3.3131I-SPC-VP2在正常小鼠體內(nèi)的生物分布

131I-SPC-VP2與Na131I在小鼠體內(nèi)分布結(jié)果列于表3。131I-SPC-VP2和Na131I溶液進(jìn)入小鼠體內(nèi)后代謝速度都比較快。因?yàn)槎嚯南鄬?duì)分子質(zhì)量小，在小鼠體內(nèi)可以快速的被清除，131I-SPC-VP2在小鼠體內(nèi)的血液清除半衰期為2.5 h。6 h之后小鼠體內(nèi)沒(méi)有放射性殘留。由表3可見，注射131I-SPC-VP2后放射性通過(guò)血液在胃部有明顯的濃集，推測(cè)該131I標(biāo)記的多肽主要通過(guò)胃腸道代謝，其次在腎、脾、肺也有較高的攝取。但在該劑量下，對(duì)肝、腎臟并無(wú)明顯的損傷。相比其他器官而言，其在甲狀腺并沒(méi)有明顯的攝取。與131I-相比，在12 h前，注射131I-SPC-VP2后，各器官的放射性攝取都處于較低水平，尤其是甲狀腺，兩者的倍數(shù)差異高于其他器官，比如在6 h時(shí)，在胃部131I-的攝取為4.46%ID/g，而131I-SPC-VP2為1.56%ID/g，131I-是131I-SPC-VP2的2.8倍，同時(shí)在甲狀腺，131I-SPC-VP2的攝取為0.01%ID，而131I-為0.66%ID，131I-是131I-SPC-VP2的66倍。游離碘離子在體內(nèi)易高度濃集于甲狀腺，一般通過(guò)考察藥物在小鼠甲狀腺的放射性攝取高低來(lái)評(píng)價(jià)該藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性，以上結(jié)果說(shuō)明，該標(biāo)記藥物在小鼠體內(nèi)有良好的穩(wěn)定性。

表2　131I-SPC-VP2在室溫下的放化純度(n=4)

4結(jié)論

本文通過(guò)間接標(biāo)記法將131I標(biāo)記到小分子肽VP2上，考察了該標(biāo)記藥物體內(nèi)外的穩(wěn)定性與在正常小鼠體內(nèi)的生物分布。標(biāo)記物體內(nèi)外有較好的穩(wěn)定性。若用合適的核素對(duì)小分子肽VP2進(jìn)行標(biāo)記，該多肽可以快速的到達(dá)靶點(diǎn)，較快的代謝速率可以及時(shí)清除非靶器官的放射性，降低對(duì)正常組織的傷害程度。131I標(biāo)記小分子肽VP2的初步研究顯示，該藥物有希望制成放射免疫藥物用于結(jié)腸癌、直腸癌、肺癌及乳腺癌癌癥的診斷與治療。

參考文獻(xiàn)：

[1]Laburthe M, Couvineau A, Tan V. Class Ⅱ G protein-coupled receptorsfor VIP and PACAP: structure, models of activation and pharmacology[J]. Peptides, 28(9): 1 631-1 639.

[2]Valdehita A, Carmena M J, Collado B, et al. Vasoactiveintestinal peptide (VIP) increases vascular endothelial growth factor (VEGF) expression and secretion in human breast cancer cells[J]. RegulPept, 144(1-3): 101-108.

[3]Valdehita A, Bajo A M, Schally A V, et al. Vasoactive intestinal peptide (VIP) induces transactivation of EGFR and HER2in human breast cancer cells[J]. Mol Cell Endocrinol, 302(1): 341-348.

[4]Reubi J C, Laderach U, Waser B, et al. Vasoactive intestinal peptide/pituitary adenylatecyclase-activating peptidereceptor subtypes in human tumors and their tissues of origin[J]. Cancer Res, 60(11): 3 105-3 112.

[5]Reubi J C, K?rner M, WaserB,et al. High expression of peptide receptors as a novel target in gastrointestinal stromal tumours[J]. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 31(6): 803-810.

[6]Tang Bo, Li Zhexu, Huang Dingde,et al. Screening of a Specific Peptide Binding to VPAC1 Receptor from a Phage Display Peptide Library[J]. Plos One, 2013, 8(1), e54264.

[7]楊遠(yuǎn)友,廖家莉,林如山,等. 雙功能偶聯(lián)劑SPC 的一種新合成方法及其碘標(biāo)記[J]. 化學(xué)研究與應(yīng)用，2008,20(2)：162-165.

Yang Yuanyou, Liao Jiali, Lin Rushan, et al. A new synthesis route for SPC as a bi-functional linker for radioiodination and its labeling of iodine[J]. Chemical Research and Application, 2008, 20(2): 162-165(in Chinese).

[8]唐軍,金建南,劉寧,等. 用于放射性砹( 碘) 標(biāo)記蛋白質(zhì)的偶聯(lián)劑 SPC的合成與表征[J]. 原子能科學(xué)技術(shù),2004,25(3):261-265.

Tang Jun, Jin Jiannan, Liu Ning, et al. Synthesis and characterization of SPC as a linker for labeling proteins with astatine and iodine radioistopes[J]. Atomic Energy Science and Technology, 2004, 25(3): 261-265(in Chinese)

Preliminary Study of Radioiodination of VP2

MA Huan, TANG Yu, YANG Yuan-you, LIU Ning, LIAO Jia-li, YANG Ji-jun

(KeyLaboratoryofRadiationPhysicsandTechnology,MinistryofEducation,InstituteofNuclearScienceandTechnology,SichuanUniversity,Chengdu610064,China)

Abstract:The VP2 peptide specifically binding to vasoactive intestinal polypeptide receptor 1(VPAC1) receptor was radioiodinated with (131)I by bi-functional linker N-succinimidyl 5-(tributylstannyl)-3-pyridinecarboxylate (SPC), and in vitro and in vivo stability of the labeled peptide were evaluated. Mice were injected intravenously with either 1.2×106 Bq (131)I-SPC-VP2 or Na(131)I. Radiochemical purity and biodistribution were studied at various time points. The result showed that purified (131)I-SPC-VP2 exhibited radiochemical purity of 97% at room temperature up to 48 h. The tissue uptake of (131)I-SPC-VP2 was low after 6 h injection, especially in thyroid. The result indicated the labeled compound had fast clearance and good stability in vivo.

Key words：(131)I; VP2; labeled compound; peptide; biodistribution

doi：10.7538/tws.2016.29.01.0001

中圖分類號(hào)：R817.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000-7512(2016)01-0001-05

作者簡(jiǎn)介：馬歡(1992—)，女，浙江衢州人，碩士研究生，主要從事同位素應(yīng)用研究通信作者：楊遠(yuǎn)友，研究員， E-mail: yangyy@scu.edu.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(21371124，J1210004)

收稿日期：2015-00-00;修回日期：2015-00-00