納米鍶羥基磷灰石的制備及對甲氨蝶呤吸附性能的研究*

謝袁菲，季金茍，向存程，徐　溢

(重慶大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400030)

?

納米鍶羥基磷灰石的制備及對甲氨蝶呤吸附性能的研究*

謝袁菲，季金茍，向存程，徐溢

(重慶大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400030)

摘要：為了制備具有較高甲氨蝶呤(MTX)吸附性能的藥物載體用于骨腫瘤治療，用共沉淀法制備不同摻鍶量的納米鍶羥基磷灰石(nano-SrHA)，利用XRD、TEM等對其進行了表征，并考察了共沉淀時間、摻鍶比、甲氨蝶呤(MTX)濃度、溶液pH值等對吸附MTX性能的影響。結(jié)果表明，摻鍶比對nano-SrHA的大小及形狀都有一定影響，隨著摻鍶比的增加，晶體尺寸變??；摻鍶比影響nano-SrHA對MTX吸收，不同摻鍶比中nano-Sr(0.3)HA對MTX的吸附效果最佳；共沉淀反應(yīng)時間增加有利于晶型的銳化和吸附性能的提高；pH值為7.8的弱堿環(huán)境有助于nano-Sr(0.3)HA吸附MTX，最大吸附量高達43.09 mg/g。nano-Sr(0.3)HA是一種良好的MTX吸附載體。

關(guān)鍵詞：納米鍶羥基磷灰石；吸附性能；甲氨蝶呤

0引言

炎癥、腫瘤等常會引起骨組織的缺損，不僅造成畸變，還會引起一系列的功能障礙。納米羥基磷灰石[nano-Ca10(PO4)6(OH)2, nano-HA]是眾多磷酸鈣化合物的一種，其化學(xué)組分和晶型結(jié)構(gòu)類似人體自然骨，表現(xiàn)出較好的生物相容性、生物可降解性、生物穩(wěn)定性、吸附載藥性、引導(dǎo)骨生長、無毒性等生物活性[1-3]。nano-HA因其較大的比表面積和表面活性，能吸附和傳遞蛋白質(zhì)、多肽類、免疫調(diào)節(jié)劑、疫苗等藥物[4]，可有效地提高藥物的通透性而發(fā)揮藥效，故被廣泛地應(yīng)用于骨損傷方面的治療[5-7]。nano-HA中的OH-與2個Ca2+連接，當晶體表面的OH-位置在某一時刻空缺時，使得HA晶體表面帶有由Ca2+引起的多余的正電荷而形成較強的吸附位點(C點)，這個位點能夠吸附大分子上的磷酸基團或是羧基基團[8]。鍶是人體內(nèi)必需微量元素之一，在骨內(nèi)的含量約為0.01%，遠低于鈣含量。大量實驗表明，納米鍶羥基磷灰石[nano-CaxSry(PO4)6(OH)2, nano-SrHA,x+y=10]比nano-HA具有更好的生物性能，鍶的摻入改變了載體材料的結(jié)晶性和生物降解性，提高骨容量，減少骨流失，誘導(dǎo)成骨細胞活性，促進成骨細胞的增殖與分化，抑制破骨細胞活性，增強骨強度和更好地吸附蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、氨基酸及骨腫瘤治療藥物[9]。

本文以共沉淀法制備了不同摻鍶比的nano-SrHA，并對其進行表征，以含羧基的抗腫瘤藥物甲氨蝶呤(Methotreaxate, MTX)為模型藥物，考察了nano-SrHA對MTX的吸附性能，以期找到一個較好的抗骨腫瘤藥物載體。

1實驗

1.1 試劑與儀器

MTX(陜西頂點醫(yī)藥化工有限公司)、硝酸鈣、氯化鍶、磷酸氫二銨、氨水、氫氧化鈉等其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

T6-新世紀紫外分光光度計(北京普析通用有限責任公司)；Shimadzu XRD6000X射線衍射儀(XRD，日本Shimadzu制作所)；HITACHI-600透射電鏡(TEM，日本日立公司)；85-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(江蘇省金壇市中正儀器制造有限公司)；KQ-2200B超聲清洗器(鞏義市予華儀器有限責任公司)；FD-1冷凍干燥機(北京德天佑科技發(fā)展有限公司)等。

1.2nano-SrHA的制備

采用共沉淀法制備nano-SrHA[10]。在伴有攪拌和回流的三頸瓶中，加入計量好的硝酸鈣和氯化鍶溶液，用1∶2的氨水調(diào)節(jié)溶液pH值=10，在油浴中加熱至60 ℃。另量取相應(yīng)的磷酸氫二銨溶液，事先用1∶1的氨水調(diào)節(jié)pH值=10，轉(zhuǎn)入滴液漏斗，以每分鐘2～5 mL的速度滴入三頸瓶中。滴加過程中用1∶2的氨水調(diào)節(jié)溶液pH值=10。于80 ℃下反應(yīng)3 h，加熱沸騰1 h，室溫陳化(靜置過夜)，制得nano-SrHAP。過濾，沉淀物用去離子水多次洗滌至pH值=7，沉淀冷凍干燥，制備含不同摻鍶比的nano-SrHA。

1.3nano-SrHA晶型及表面形貌表征

用XRD進行晶型分析，掃描2θ角為10～60°；另取少量樣品于 50 mL蒸餾水中，超聲分散后滴到銅網(wǎng)上，用磷鎢酸染色，室溫干燥，再用TEM觀察表面形貌。

1.4檢測波長的選擇

配制一定濃度的MTX溶液，用紫外-可見光200～600 nm掃描，確定MTX最大吸收波長。

1.5MTX標準曲線的繪制

配制0.25 mg/mL的MTX儲備液，分別吸取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9和1.0 mL儲備液置于10 mL容量瓶中，加0.01 mol/L的NaOH溶液定容，搖勻，即得MTX標準溶液。以0.01 mol/L的NaOH溶液為參比，在MTX最大吸收波長處測定其吸光度，重復(fù)3次，取平均值。

1.6載藥nano-SrHA的制備及藥物吸附量的測定

采用吸附-冷凍干燥法制備載藥nano-SrHA[11]。分別稱取一定量的不同摻鍶比的nano-SrHA粉體于適量藥物濃度的溶液中，超聲30 min，再恒溫振蕩吸附一定時間，過濾，用去離子水洗滌沉淀，去掉表面粘附的藥物，冷凍干燥沉淀，即得載藥nano-SrHA。濾液稀釋，于MTX最大吸收波長處測定其吸光度，換算成濃度，按下式計算藥物的吸附量

式中，q表示每克nano-SrHA吸附藥物的量，mg/g；C0為溶液中藥物的初始濃度，μg/mL；CV為吸附后殘留藥物濃度，μg/mL；m為nano-SrHA的質(zhì)量，g；V為吸附液體積，mL。

考察摻鍶比、共沉淀時間、藥物濃度、溶液pH值對nano-SrHA吸附MTX性能的影響。

2結(jié)果與討論

2.1摻鍶比對nano-SrHA晶型的影響

圖1為不同摻鍶比的nano-SrHA XRD圖，從圖中可以看出，2θ在25.8°(002)、31.7°(211)、32.2°(112)分別出現(xiàn)強的特征衍射峰。nano-HA的XRD譜與HA標準卡片(ICSD 09-0432)中的數(shù)據(jù)吻合，nano-HSr的XRD譜與HSr標準卡片(ICSD 33-1348)中的數(shù)據(jù)吻合，其余nano-SrHA(Sr/[Sr+Ca]=0.3～0.7)的XRD譜分別與34-0482、34-0479、34-0478中數(shù)據(jù)相對應(yīng)。由此可以推斷所制備的產(chǎn)物為nano-HA、nano-HSr及nano-SrHA(Sr/[Sr+Ca]=0.3～0.7)。

圖1Nano-HA、不同摻鍶比nano-SrHA、nano-HSr 的XRD圖

Fig 1 XRD patterns of nano-HA, nano-SrHA with different Sr ratios and nano-HSr

從圖1還可以看出，隨著摻鍶比的增加，(002)晶面與(211)晶面衍射峰逐漸向小角度偏移，這和Bragg 公式λ=2dsinθ是相一致的，由于Sr2+半徑大于Ca2+(Sr2+、 Ca2+半徑分別為0.113和0.099 nm)，使得晶格常數(shù)變大、晶面間距d增大，當X射線波長λ一定時，衍射角2θ向小角偏移。

本文發(fā)現(xiàn)，隨著摻鍶比的增加，(211)晶面與(002)晶面峰面積之比隨之增加，R2=0.98914(見表1)。這可以推測，隨著摻鍶比的增加，nano-SrHA沿c軸(002)晶面方向生長趨勢逐漸弱化。

表1(211)晶面與(002)晶面峰面積

Table 1 Peak area of (211) and (002)

Sr/[Sr+Ca]原子比S(002)S(211)S(211)/S(002)0.0334295862.870.34248169433.990.53396190085.600.72425210798.691.020133411816.95

2.2共沉淀時間對nano-SrHA晶型的影響

表2為共沉淀時間對nano-Sr0.3HA (211)晶面間距和峰高的影響，由表2可以發(fā)現(xiàn)隨著共沉淀時間的增加，nano-Sr0.3HA (211)晶面間距和峰高逐漸增大。根據(jù)布拉維法則可知，隨著(211)晶面間距d的增大，晶面的結(jié)點密度增大，相鄰晶面間引起減小，晶體成長逐漸變緩，并于3 h后趨于穩(wěn)定。一般認為峰高是由同方向排列的晶面分布數(shù)量決定的，(211)晶面峰高隨共沉淀時間增加而增大，說明其晶面增多，晶體結(jié)晶度提高，且3 h后晶體生長已基本穩(wěn)定。

表2共沉淀時間對nano-Sr0.3HA 晶型的影響

Table 2 Effect of coprecipitation time on the crystal forms of nano-Sr0.3HA

Coprecipitationtime/h2θdHeight0.531.4782.83970.671.031.3812.84822.571.531.3412.85183.632.031.3202.85374.102.531.2992.85564.483.031.2822.85714.843.531.2772.85754.984.031.2792.85745.10

2.3摻鍶對nano-SrHA粒徑的影響

圖2分別為nano-HA(a)、nano-Sr0.3HA(b)和nano-HSr(c)的TEM圖。從圖2可以看出，nano-HA為針條狀，nano-Sr0.3HA為短針狀， nano-HSr為短棒狀，其對應(yīng)尺寸分別約為?25 nm×130 nm、?20 nm×100 nm和?15 nm×70 nm。這可能和nano-HA沿c軸(002)方向有較強的生長趨勢有關(guān)(見表1)，隨著摻鍶比增加，沿c軸(002)方向生長趨勢減弱，導(dǎo)致晶體尺寸變小。

圖2Nano-HA、nano-Sr0.3HA、nano-HSr的TEM圖

Fig 2 Transmission Electron Microscope of nano-HA, nano-Sr0.3HA, nano-HSr

2.4摻鍶比對nano-SrHA吸附MTX性能的影響

圖3為摻鍶比對nano-SrHA吸附性能的影響。

圖3　摻鍶比對nano-SrHA吸附性能的影響

Fig 3 Ratios of Sr on absorption quantity of nano-SrHA

由圖3可以看出，nano-SrHA對MTX吸附性能的大小順序為nano-Sr0.3HA>nano-Sr0.5HA>nano-Sr0.7HA>nano-HA>nano-HSr。nano-SrHA對MTX的吸附能力可能是由兩方面的原因所決定：(1)不同離子對MTX的結(jié)合力不同所致，Ca2+離子的半徑小，其對MTX的結(jié)合力要大于Sr2+對MTX的結(jié)合力，故nano-HA > nano-HSr；(2)晶格應(yīng)力不同導(dǎo)致其對MTX的吸收不同，摻Sr2+后的晶體，其晶格應(yīng)力要大于純的nano-HA和nano-HSr，對MTX的吸附能力增強，故nano-Sr0.3HA> nano-HA。綜合考慮以上兩個因素，最終導(dǎo)致它們對MTX吸附的能力為nano-Sr0.3HA> nano-Sr0.5HA>nano-Sr0.7HA>nano-HA >nano-HSr。

2.5共沉淀時間對nano-SrHA吸附MTX性能的影響

圖4為制備nano-Sr0.3HA共沉淀時間對吸附MTX性能的影響。從圖4可以發(fā)現(xiàn)，nano-Sr0.3HA吸附MTX的量隨其制備時的共沉淀時間的增加而增加，3 h后均基本不變。這可能是因為在共沉淀法制備nano-Sr0.3HA時，率先形成的缺鈣(或鍶)HA，導(dǎo)致其對MTX的吸附位點較減少，隨著共沉淀反應(yīng)的時間增長，正離子的位點逐漸被填補，吸附MTX量也逐漸增加。共沉淀3 h后，nano-CaxSry(PO4)6(OH)2中[x+y]/6基本達到1.67，形成了較完整的nano-Sr0.3HA晶型，故吸附量不再增加，這和圖3的現(xiàn)象是基本一致的。

圖4　共沉淀時間對吸附MTX性能的影響

Fig 4 Effect of coprecipitation time of on the absorption quantity

2.6MTX濃度對nano-SrHA吸附性能的影響

圖5為溶液pH值=8.8時， MTX濃度對nano-Sr0.3HA吸附性能的影響。

圖5　MTX濃度對nano-Sr0.3HA吸附性能的影響

Fig 5 Effect of MTX concentrations on absorption quantity of nano-Sr0.3HA

由圖5可知，隨著MTX濃度的增加，nano-Sr0.3HA的吸附量隨之增加。當MTX為62.40 μg/mL時吸附量趨于飽和，此時nano-Sr0.3HA最大吸附量為40.27 mg/g。

2.7pH值對nano-SrHA吸附MTX性能的影響

圖6為pH值對nano-Sr0.3HA吸附性能的影響。從圖6可以看出，在pH值=7.8附近的吸附量最大，為43.09 mg/g，過酸或過堿使得吸附量減少。這可能與MTX的pka值及溶液pH值對nano-Sr0.3HA吸附位點的影響有關(guān)。如圖7所示，MTX上α位的羧基pka=4.7，β位的羧基pka=3.4[12]。在較低pH值環(huán)境中，MTX上的H+解離有限，因此較難被nano-Sr0.3HA吸附位點(Ca2+或Sr2+)吸附；隨著溶液pH值的升高，H+解離增加，從而使MTX呈現(xiàn)負電荷形式增多，nano-Sr0.3HA對其吸附增加。然而當堿性過強時，Sr2+、Ca2+所帶來的吸附位點可能會優(yōu)先吸附富余的OH-，使得nano-Sr0.3HA吸附MTX的能力下降。

圖6　pH值對nano-Sr0.3HA吸附性能的影響

Fig 6 Effect of pH on the absorption of nano-Sr0.3HA

圖7　甲氨蝶呤結(jié)構(gòu)式

3結(jié)論

(1)Nano-HA呈短針狀，尺寸約?25 nm×130 nm，鍶的摻入抑制了晶體沿c軸方向的生長趨勢，致使其晶體尺寸變小。

(2)隨著共沉淀時間的增加，nano-SrHA晶型逐漸銳化，對MTX的吸附量隨之增加，3 h后基本不變。

(3)由于Sr的摻入，晶體應(yīng)力發(fā)生改變，nano-SrHA對MTX的吸附不僅與鈣離子相對量有關(guān)，也與應(yīng)力有關(guān)，最終導(dǎo)致nano-Sr0.3HA對MTX的吸附效果最佳。

(4)弱堿環(huán)境有助于提高nano-SrHA吸附MTX性能，當pH值為7.8時，nano-Sr0.3HA對MTX吸附可達到43.09 mg/g。

綜上所述，nano-Sr0.3HA對含羧基抗腫瘤藥物具有良好的吸附性能，有望成為骨腫瘤治療的良好的藥物載體。

參考文獻:

[1]Chai F, Hornez J C, Blanchemain N, et al. Antibacterial activation of hydroxyapatite (HA) with controlled porosity by different antibiotics [J]. Biomolecular Engineering, 2007, 24: 510-514.

[2]Juhong Y, Xiaobing C, Yurong C, et al. Preparation and characterization of antimicrobial nano-hydroxyapatite composites [J]. Materials Science and Engineering C, 2014, 37: 54-59.

[3]Fuyin Z, Shige W, Shihui W, et al. Characterization and antibacterial activity of amoxicillin-loaded electrospun nano-hydroxyapatite/poly (lactic-co-glycolic acid) composite nanofibers [J]. Biomaterials, 2013, 34: 1402-1412.

[4]Yang Hui，Huang Feifei. Preparation of porous spherical hydroxyapatite and study on its properties of drug delivery in vitro[J]． Journal of Functional Materials, 2012, 43(4): 533-536.

楊輝，黃菲菲. 多孔球形羥基磷灰石的制備及其藥物控釋性能的研究[J]．功能材料，2012，43(4): 533-536.

[5]Sanjaya K S, Debasish S. Study of BSA protein adsorption/release on hydroxyapatite nanoparticles[J]. Applied Surface Science, 2013, 286: 99-103.

[6]Jia Zhibin， Zhi Wei， Li Jinyu， et al. Preparation and characterization of porous hudroxyapatite scaffolds lined with composite coatings[J]. Journal of Functional Materials, 2014, 45(18): 18129-18134.

賈治彬，智偉，李金雨,等.羥基磷灰石基多孔復(fù)合支架的制備及其表征[J]．功能材料，2014，45(18): 18129-18134.

[7]Zhang Yi，Li Jidong，Zuo Yi，et al. Preparation and characterization of the magnetic hydroxyapatite composite[J]. Journal of Functional Materials, 2012, 43(10): 1273-1276.

張熠，李吉東，左奕,等.磁性羥基磷灰石復(fù)合物的制備與表征[J]．功能材料，2012，43(10): 1273-1276.

[8]Chen Qingyu，Zhu Rongrong，Zhang Rui，et al. Preparation and characterization of nano-hydroxyapatite as carrier of two drugs[J]. Journal of Fudan University(Natural Science), 2009, 48(3): 386-390.

陳慶榆，朱融融，張蕤,等.納米羥基磷灰石對兩種藥物的載藥性能研究[J]．復(fù)旦學(xué)報(自然科學(xué)版)，2009，48(3): 386-390.

[9]Kaili L, Peiyi L, Wei L, et al. Strontium substituted hydroxyapatite porous microspheres: surfactant-free hydrothermal synthesis, enhanced biological response and sustained drug release [J]. Chemical Engineering Journal, 2013, 222: 49-59.

[10]Ji Jingou，Ran Junguo，Gou Li，et al. Synthesis of HA/β-TCP biphasic bioceramic powders by a modified co-precipitation method[J]. Journal of Functional Materials, 2003, 34(5): 597-599.

季金茍，冉國軍，茍立,等.共沉淀法制備HA/β-TCP雙相生物陶瓷粉末新工藝研究[J]．功能材料，2003，34(5): 597-599.

[11]Shaoning W, Xiaoyun W, Hui X, et al. Towards sustained delivery of small molecular drugs using hydroxyapatite microspheres as the vehicle [J]. Advanced Powder Technology, 2010, 21: 268-27.

[12]William R C, Barbara J G, Stephen J B. Consideration of the pH-dependent inhibition of dihydrofolate reductase by methotrexate [J]. Journal of Molecular Biology, 1997, 271: 656-668.

Preparation and absorption capability study of strontium substituted nano-hydroxyapatite for methotreaxate

XIE Yuanfei，JI Jingou，XIANG Cuncheng，XU Yi

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Chongqing University, Chongqing 400030, China)

Abstract:Strontium substituted nano-hydroxyapatite (nano-SrHA) was synthesized by co-precipitation method and applied to treat bone tumors.. The morphology of nano-SrHA was determined by transmission electron microscope (TEM) while its phase composition was characterized with X-ray diffraction (XRD). The absorption capability of nano-SrHA effected by coprecipitation time, feeding ratios of Sr, methotreaxate (MTX) concentrations and pH were also investigated. The results showed that the diffraction angles of nano-SrHA shifted to small value with the increase of feeding ratios of Sr, crystal forms and absorption capability increased with the coprecipitation time, and the nano-Sr(0.3)HA with the acicular structure had the best absorption capability of 43.09 mg/g when the pH was about 7.8. It indicated that nano-Sr(0.3)HA might be a potential candidate as MTX-delivery carrier.

Key words:nano-SrHA;absorption capability;methotreaxate

DOI:10.3969/j.issn.1001-9731.2016.02.007

文獻標識碼：A

中圖分類號：O614.23+2; R318.08

作者簡介：謝袁菲(1989-)，女，重慶人，在讀碩士，師承季金茍教授，從事納米材料研究。

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(21375156)

文章編號：1001-9731(2016)02-02031-05

收到初稿日期：2015-03-10 收到修改稿日期：2015-10-21 通訊作者：季金茍，E-mail: 725_tiger@sina.com