艾灸、電針預(yù)處理對急性胃黏膜損傷大鼠TGF-α、PCNA的影響

郭禮娜，劉薇薇，譚成富，潘思安，劉　密*，王　超，常小榮

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，湖南長沙410208）

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艾灸、電針預(yù)處理對急性胃黏膜損傷大鼠TGF-α、PCNA的影響

郭禮娜，劉薇薇，譚成富，潘思安，劉密*，王超，常小榮

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，湖南長沙410208）

〔摘要〕目的對比觀察艾灸預(yù)處理和電針預(yù)處理兩種不同方法對急性胃黏膜損傷大鼠轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-α）和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）表達(dá)的影響差異。方法將40只SPF級的SD大鼠隨機(jī)的分為4組（空白組、模型組、艾灸預(yù)處理組和電針預(yù)處理組），艾灸預(yù)處理組和電針預(yù)處理組選取“足三里穴”、“中脘穴”分別行艾灸和電針預(yù)處理8 d后，除空白組外造模，選用無水乙醇灌胃的方法（0.5 mL/100 g）制成大鼠急性胃黏膜損傷模型。造模1 h后，用20％烏拉坦（0.6 mL/100 g）進(jìn)行腹腔注射麻醉，再取材。在光鏡下觀察大鼠的胃黏膜組織形態(tài)學(xué)的改變，免疫組化法檢測胃黏膜TGF-α、PCNA的表達(dá)。結(jié)果與空白組相比較，模型組胃黏膜中TGF-α、PCNA的表達(dá)明顯升高（P<0.05或P<0.01）；與模型組相比較，艾灸預(yù)處理組和電針預(yù)處理組胃黏膜中TGF-α、PCNA的表達(dá)均有不同程度升高（P<0.05或P<0.01）;與艾灸預(yù)處理組相比較，電針預(yù)處理組胃黏膜中TGF-α的表達(dá)明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），而胃黏膜中PCNA的表達(dá)則無明顯差異（P>0.05）。結(jié)論艾灸預(yù)處理與電針預(yù)處理均可以減輕無水乙醇對胃黏膜造成的損傷，促進(jìn)胃黏膜保護(hù)因子（TGF-α、PCNA）的表達(dá)，但艾灸預(yù)處理稍優(yōu)于電針預(yù)處理。

〔關(guān)鍵詞〕急性胃黏膜損傷；電針；艾灸；預(yù)處理；TGF-α；PCNA

急性胃黏膜損傷（Acute Gastric Mucosal lesions, AGML）是指以胃黏膜產(chǎn)生不同程度的潰瘍、糜爛和出血等為特點(diǎn)的病變，其病因主要包括酒精中毒以及非甾醇類抗炎藥如阿司匹林等。急性胃黏膜損傷的修復(fù)主要是經(jīng)過損傷后早期重建以及細(xì)胞增生。目前實(shí)驗(yàn)研究均已證明，許多生長因子和細(xì)胞因子都參與了胃黏膜上皮損傷的修復(fù)調(diào)節(jié)，如轉(zhuǎn)化生長因子α（trasforming growth factor-α, TGF-α）可以促進(jìn)胃黏膜上皮細(xì)胞遷移和增殖。增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的直接衡量指標(biāo)。大量的實(shí)驗(yàn)研究和臨床實(shí)踐已證明，艾灸和電針均對胃黏膜具有很好的保護(hù)作用，不僅可以改善患者臨床癥狀，還可以促進(jìn)潰瘍組織的愈合[1-3]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討艾灸預(yù)處理和電針預(yù)處理兩種不同干預(yù)方法對胃黏膜預(yù)防保護(hù)作用是否相同，或各有特點(diǎn)。

1材料與方法

1.1動(dòng)物與分組

SPF級SD大鼠40只，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號：SCXK (湘)2011-0003。飼養(yǎng)溫度20～25℃，濕度50％～70％，體質(zhì)量200～220 g，雌雄各半。隨機(jī)分為4組，空白組、模型組、艾灸預(yù)處理組、電針預(yù)處理組。實(shí)驗(yàn)程序經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要試劑與儀器

20％烏拉坦（上海化學(xué)試劑公司）；4％多聚甲醛溶液（湖南中醫(yī)藥大學(xué)免疫組化實(shí)驗(yàn)室配置）；枸櫞酸鹽緩沖液、蘇木素（Wellbio）。華佗牌1寸毫針（杭州丹頓醫(yī)療器械有限公司）；SDZ-V型華佗牌電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品有限公司）；溫灸純艾條（南陽市臥龍漢醫(yī)艾絨廠,規(guī)格4 mm×120 mm，10支/盒）；簡易艾灸架、隔熱薄膜、電阻溫度測定儀(自制)；TGL-16臺式冷凍離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；THZ-C恒溫振蕩器（太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；OLYMPUS Bx -70顯微鏡成像系統(tǒng)(OLYMPUS公司)；TS-92搖床（其林貝爾儀器制造有限公司）；YD-315切片機(jī)（浙江金華益迪試驗(yàn)器材）；BMJ-A包埋機(jī)（常州中威電子儀器）；BA21OT顯微鏡（Motic）。

1.3造模方法

選用無水乙醇灌胃的方法制備大鼠急性胃黏膜損模型。需造模的各組大鼠于實(shí)驗(yàn)第8天預(yù)處理后禁食不禁水24 h，再每只大鼠采用灌胃針灌服無水乙醇（0.5 mL/100 g），造模時(shí)間為1 h。而空白組大鼠用灌胃針灌服生理鹽水（0.5 mL/100 g），時(shí)間為1 h，再麻醉取材。

1.4穴位定位和處理方法

1.4.1穴位定位參考李忠仁主編《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》常用動(dòng)物穴位定位法及擬人對照法定位，足三里穴（后三里穴）處于實(shí)驗(yàn)大鼠膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm處。中脘穴處于大鼠臍上約20 mm(以胸鎖聯(lián)合和恥骨聯(lián)合連線下1/4與上3/4交點(diǎn)為大鼠肚臍)。

1.4.2處理方法空白組和模型組大鼠每天捆綁固定在鼠板上30 min，連續(xù)捆綁8 d；艾灸預(yù)處理組大鼠每天捆綁固定于鼠板上后，選取大鼠雙側(cè)足三里穴和中脘穴，并將艾條固定在自制的簡便灸架上，同時(shí)對準(zhǔn)各施灸穴位，距離約2 cm處點(diǎn)燃施灸，用電阻溫度測定儀(自制)測量大鼠體表溫度，其體表溫度大約達(dá)到42℃，每天持續(xù)灸30 min，1次/d，連續(xù)8 d。電針預(yù)處理組大鼠行同樣的固定、同時(shí)選取雙側(cè)的足三里穴和中脘穴，將毫針直刺入穴位大約3 mm后，采用提插捻轉(zhuǎn)（平補(bǔ)平瀉）的手法1 min，然后連接SDZ-V型華佗牌電針治療儀，波形選用疏密波（疏波與密波頻率之比為10/50 Hz），其刺激強(qiáng)度為2 mA（以上肢輕微顫抖為度），時(shí)間持續(xù)為30 min，1次/d，連續(xù)治療8 d。

1.5觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1胃黏膜組織形態(tài)學(xué)觀察在胃黏膜損傷最嚴(yán)重處取1小塊(約0.5 cm×1 cm)，用冰生理鹽水沖洗干凈，放入4％多聚甲醛中固定24～48 h,常規(guī)梯度乙醇脫水，石蠟包埋,間斷連續(xù)切片(厚度4 μm)、烤片、常規(guī)脫蠟;光鏡下觀察胃黏膜組織形態(tài)學(xué)改變。

1.5.2胃黏膜PCNA、TGF-α檢測（免疫組化法）在胃黏膜損傷明顯處選取1.0 cm×0.5 cm組織塊，用冷生理鹽水清洗，濾紙吸干，將其裝入0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(含4％多聚甲酸、0.05％戊二酸和15％飽和苦味酸、pH 7.4)中室溫下固定待檢。石錯(cuò)包埋后連續(xù)切片，60℃烤片30～60 min；切片脫蠟至水；將切片浸入到0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）當(dāng)中，用微波爐或電爐加熱到沸騰后再斷電，大約間隔5～10 min后，重復(fù)1～2次。冷卻后0.01M PBS（pH 7.2～7.6）清洗3 min，重復(fù)清洗3次；加入3％H2O2，室溫放置10 min以便滅活內(nèi)源性酶。PBS清洗3 min，重復(fù)清洗3次；再滴加適當(dāng)稀釋過的一抗，37℃放置1～2 h或4℃過夜。用PBS清洗5 min，重復(fù)清洗3次；滴加50～100 μL抗兔/鼠IgG抗體-HRP多聚體，37℃下孵育30 min，再用PBS清洗5 min，重復(fù)清洗3次；配置DAB溶液顯色，蒸餾水洗滌；蘇木素復(fù)染，各級酒精60％～100％脫水，取出后置于二甲苯10 min，2次，中性樹膠封片、顯微鏡觀察。數(shù)據(jù)分析采像為普通電腦采像；圖像分析軟件是IPP（Image-Pro-Plus）進(jìn)行平均光密度的分析。結(jié)果判斷：陽性染色為黃色或棕黃色染色。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1各組胃黏膜光鏡下觀察

光鏡下,空白組(圖1-A)可見胃黏膜上皮結(jié)構(gòu)連續(xù)完整，細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)輪廓清晰可見，未見明顯胃黏膜損害;與空白組比較,模型組(圖1-B)大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)明顯破壞，胃腺細(xì)胞大量壞死,雜亂無序，細(xì)胞內(nèi)充血并水腫，可見明顯胃黏膜損傷;與模型組相比較,艾灸預(yù)處理組(圖1-C)和電針預(yù)處理組(圖1-D)大鼠胃黏膜表面細(xì)胞相對而言比較完整，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)均比較清晰，胃黏膜的表面有少許脫落,胃黏膜破損情況較模型組明顯改善,說明艾灸和電針預(yù)處理可以有效預(yù)防無水乙醇對正常大鼠導(dǎo)致的胃黏膜損傷。

圖1　各組胃黏膜光鏡下觀察圖（×100）

2.2艾灸預(yù)處理和電針預(yù)處理對AJML大鼠胃黏膜中TGF-α、PCNA的影響

與空白組相比較，模型組胃黏膜TGF-α、PCNA的表達(dá)顯著升高（P<0.05或P<0.01），說明無水乙醇造模后可以使胃黏膜出現(xiàn)增殖修復(fù)反應(yīng)；與模型組相比較，艾灸預(yù)處理組和電針預(yù)處理組胃黏膜TGF-α、PCNA的表達(dá)顯著升高（P<0.05或P<0.01），說明艾灸預(yù)處理和電針預(yù)處理能夠提高胃黏膜增殖修復(fù)能力。與艾灸預(yù)處理組相比較，電針預(yù)處理組胃黏膜TGF-α的表達(dá)顯著降低（P<0.01），而胃黏膜中PCNA的表達(dá)未見明顯差異（P>0.05），說明艾灸預(yù)處理對胃黏膜的增殖修復(fù)能力優(yōu)于電針預(yù)處理組。見表1。

表1　各組胃黏膜TGF-α、PCNA表達(dá)的比較?。╪=10,±s）

表1　各組胃黏膜TGF-α、PCNA表達(dá)的比較?。╪=10,±s）

注：與空白組相比較*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比較△P＜0.05，△△P＜0.01；與艾灸預(yù)處理組相比較▲▲P＜0.01。

組別空白組模型組艾灸預(yù)處理組電針預(yù)處理組F值P值TGF-α 0.006±0.02 0.011±0.002* 0.025±0.003**△△0.014±0.003**△△▲▲PCNA 0.021±0.010 0.036±0.014* 0.054±0.010**△0.0527±0.012**△106.70 0.00 17.41 0.00

3討論

TGF-α是EGF家族中參與胃黏膜損傷之后修復(fù)的主要調(diào)節(jié)肽之一。在胃腸道當(dāng)中，TGF-α尤以胃竇黏膜中表達(dá)量為最高，是胃體黏膜的3倍，它不僅參與了黏膜上皮的更新，還介入了黏膜損傷后的修復(fù)，并且它是保持黏膜完整性的重要物質(zhì)，且對多種細(xì)胞有促進(jìn)有絲分裂功用，如上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、纖維細(xì)胞以及黏膜組織等[4]。研究表明TGF-α可能作為黏膜保護(hù)因子，在胃黏膜損傷相關(guān)疾病中發(fā)揮黏膜修復(fù)及保護(hù)作用，它可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制胃酸分泌、降低潰瘍指數(shù)、加速潰瘍的愈合[5]。PCNA是由Miyahci等在1978年從系統(tǒng)性紅斑狼瘡病患的血清當(dāng)中發(fā)現(xiàn)的，因它存在于增殖性細(xì)胞中而得名。實(shí)驗(yàn)研究表明，PCNA與細(xì)胞的DNA合成有密切的關(guān)系，在啟動(dòng)細(xì)胞增殖上具有重要作用。PCNA是一種細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，它反映了細(xì)胞增殖率及DNA合成率，近年來被普遍的應(yīng)用于胃黏膜增殖活性的研究當(dāng)中[6-7]。

電針療法是指將毫針刺入人體腧穴后，將電針機(jī)連接到毫針上，在通以微量低頻脈沖電流的一種治療方法，有止痛、鎮(zhèn)靜、促進(jìn)氣血循環(huán)等功效。而艾灸療法是用艾葉為主要灸料，借灸火的熱力功用，經(jīng)過經(jīng)絡(luò)腧穴的作用，起到防治疾病的一種治法，具有溫經(jīng)散寒、行氣通絡(luò)等作用?！搬樉念A(yù)處理”是指預(yù)先用針灸的手段在機(jī)體的穴位上進(jìn)行刺激，以增強(qiáng)機(jī)體的抗病與應(yīng)變能力，并起到抑制或減弱隨后疾病對機(jī)體組織器官損傷的功用，是“治未病”現(xiàn)代運(yùn)用的方式之一。針灸“治未病”實(shí)踐的積累和機(jī)制的研究使其獲得了較高的社會(huì)認(rèn)可程度，且其適應(yīng)面廣、簡便安全、較為經(jīng)濟(jì)。因此運(yùn)用針灸防治胃黏膜損傷相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展具有一定的臨床價(jià)值。電針和灸法的治療作用具有相似性，但又有差別。古有“灸治百病”之說，艾灸在“治未病”和防治胃黏膜損傷相關(guān)疾病獨(dú)具優(yōu)勢。艾灸相對電針而言，操作更方便，適用性更廣。對于暈針、懼針人來講，艾灸的選擇性更好，更易被人接受。目前關(guān)于艾灸預(yù)處理對急性胃黏膜損傷的預(yù)保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究較多，然而關(guān)于電針預(yù)處理對急性胃黏膜損傷的預(yù)保護(hù)作用的研究較少，而關(guān)于艾灸預(yù)處理和電針預(yù)處理之間對于急性胃黏膜損傷的保護(hù)作用機(jī)制的差異性研究亦鮮有報(bào)道。本課題組前期研究大多是關(guān)于艾灸預(yù)處理對胃黏膜損傷的預(yù)保護(hù)，它可以通過調(diào)整細(xì)胞的多種因子、清除氧自由基、抑制炎性細(xì)胞因子等，來減輕胃黏膜損傷的程度而達(dá)到保護(hù)胃黏膜的作用[8-12]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，對比了艾灸預(yù)處理與電針預(yù)處理對大鼠急性胃黏膜損傷胃組織形態(tài)學(xué)和胃黏膜保護(hù)因子（TGF-α、PCNA）的差異，探討電針預(yù)處理對急性胃粘膜損傷的預(yù)保護(hù)作用，及艾灸預(yù)處理與電針預(yù)處理對胃黏膜保護(hù)功用是否有差別。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：艾灸預(yù)處理與電針預(yù)處理可有效的減輕無水乙醇對大鼠胃黏膜組織的損傷，并且可以促進(jìn)胃黏膜中TGF-α、PCNA表達(dá)的升高，且艾灸預(yù)處理對胃黏膜中TGF-α表達(dá)的升高高于電針預(yù)處理。表明艾灸預(yù)處理和電針預(yù)處理可以促進(jìn)胃黏膜增殖修復(fù)因子（TGF-α、PCNA）的合成和分泌，啟動(dòng)胃黏膜修復(fù)機(jī)制，從而加強(qiáng)胃黏膜細(xì)胞增殖作用。但艾灸預(yù)處理的修復(fù)作用可能優(yōu)于電針預(yù)處理。其具體差異可能與其刺激方式不同有關(guān)，有待更進(jìn)一步研究。

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（本文編輯匡靜之）

·臨床研究·

Effects of the Moxibustion and Acupuncture Preconditioning on TGF-α and PCNA of Rats with Acute Gastric Mucosal Lesions

GUO Lina, LIU Weiwei, TAN Chengfu, PAN Sian, LIU Mi*, WANG Chao, CHANG Xiaorong
(Acupuncture and Massage College of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410208, China)

Abstract〔〕Objective To observe the effects of the moxibustion preconditioning and acupuncture preconditioning on TGF-α and PCNA in rabbits with acute gastric mucosal lesions. Methods 40 SPF-class SD rats were randomly divided into four groups: blank group, model group, moxibustion preconditioning group and electroacupuncture preconditioning (EA) group. The moxibustion preconditioning group and EA group were pretreatmented at "Zusanli point" and "Zhongwan point" for 8 days. The model of rats with acute gastric mucosal lesions was established by absolute ethanol irrigation (0.5 mL/loog). After 1 hour of modeling, the rats were anesthetized by 20％ urethane (0.6 mL/100 g), and then fetch gastric tissue. Histomorphology changes of gastric mucosa in rats were observed by light microscopy. The expression of PCNA and TGF-α was detected by immunohistochemistry method. Results Compared with blank group, the expression of TGF-α and PCNA were increased (P <0.05 or P <0.01). Compared with model group, the expression of TGF -α and PCNA in moxibustion preconditioning and EA groups was increased (P<0.05 or P<0.01). Compared with moxibustion preconditioning group, the expression of TGF -α in EA group was decreased obviously (P <0.05 or P <0.01)，but the expression of PCNA has nobook=46,ebook=49significant difference (P>0.05). Conclusion Moxibustion and EA pretreatment can reduce the damage caused by ethanol on gastric mucosa, and promote the expression of gastric mucosal protective factor (TGF-α, PCNA), but moxibustion is better than that of EA pretreatment .

Keywords〔〕acute gastric mucosal lesions; electroacupuncture; moxibustion; preconditioning; TGF-α; PCNA

〔通訊作者〕*劉密，男，副教授，E-mail:newmean9722@qq.com。

〔作者簡介〕郭禮娜，女，在讀碩士研究生，研究方向：針灸治病機(jī)制的研究。

〔基金項(xiàng)目〕國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）項(xiàng)目（2015CB554502）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81202770, 81574082）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金新教師類課題（20124323120002）；湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（13JJ6060）；湖南省優(yōu)秀博士學(xué)位論文獲獎(jiǎng)作者科研項(xiàng)目（YB2013B037）；湖南省教育廳資助科研項(xiàng)目（14B129）；2013年湖湘青年科技創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)平臺項(xiàng)目；2013年湖南省高層次衛(wèi)生人才“225”工程培養(yǎng)項(xiàng)目資助。

〔收稿日期〕2015-12-15

〔中圖分類號〕R245；R256.3

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2016.04.012