精液中SCF/c-kit值在腎虛男性不育辨證中的價值

張　芳,劉建榮*,馬月宏,丁彩云,尹海珍,高嵩丹

（山西省人民醫(yī)院，山西太原030012）

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精液中SCF/c-kit值在腎虛男性不育辨證中的價值

張芳,劉建榮*,馬月宏,丁彩云,尹海珍,高嵩丹

（山西省人民醫(yī)院，山西太原030012）

〔摘要〕目的評價精液中干細胞因子（stem cell factor, SCF）及其受體（c-kit）在男性不育腎虛證中的臨床診斷價值，為腎藏精主生殖的基本理論提供實驗依據(jù)。方法選取45例腎虛不育型患者與30例正常生育者進行對照研究，用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA法）測定兩組精漿中SCF含量，用實時熒光定量PCR方法對精液離心沉淀物檢測c-kit的ct值，并計算其相對表達量。結果兩組患者SCF濃度比較無差異（P>0.05），與正常生育組比較，腎虛不育患者前向運動精子數(shù)明顯降低（P< 0.01）、精液離心沉淀物c-kit相對表達量升高（P<0.05）。結論男性不育腎虛證與精子活動和精液中c-kit表達量密切相關，兩者可以作為男性不育腎虛證辨證時重要的客觀指標，同時為中醫(yī)腎藏精主生殖理論提供科學依據(jù)。

〔關鍵詞〕男性不育；腎虛證；干細胞因子；原癌基因蛋白質；弱精；精液

男性不育癥指的是夫妻同居一年以上，沒有采取任何避孕措施，因為男方因素引起女方不孕。近年來，男性不育呈明顯增高的趨勢。中醫(yī)診療男性不育積累了豐富的經(jīng)驗，但中醫(yī)診斷男性不育需要辨證分型，臨床的客觀指標很少。中醫(yī)學認為“腎藏精、主生殖”，精液是男性生殖的主要物質。新近認識的干細胞因子（stem cell factor，SCF）及其受體——原癌基因蛋白質（c-kit）具有調節(jié)生殖細胞增殖、分化、減數(shù)分裂和細胞凋亡的作用[1]。因此，研究組擬從精液中研究SCF/c-kit與男性不育腎虛證的關系，從而揭示中醫(yī)基礎理論腎藏精、主生殖的分子基礎。

1資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料采集2013年1月-2014年6月山西省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學門診腎虛不育患者45例、年齡（25～35）歲，平均（29.3±3.8）歲，30例正常生育者作為對照，年齡（25～35）歲，平均（28.9±3.9）歲，兩組年齡比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

1.1.2納入標準研究分為兩組：腎虛不育組、正常生育組。同時符合以下診斷的納入腎虛不育組：（1）男性不育癥診斷標準參照WHO《人類精液及精子宮頸粘液相互作用實驗室檢驗手冊》[2]：夫妻有1年或1年以上正常性生活，在未采取避孕措施的情況下，妻子未懷孕，并且排除女方因素，診斷為男性不育癥。（2）腎虛診斷參照《王琦男科學》標準[3]：①腎精氣不足型，證候表現(xiàn)為頭昏耳鳴，腰膝酸軟，記憶力減退，神疲乏力，舌淡苔白，脈沉細尺弱，精子稀少；②腎陰虛衰型，證候表現(xiàn)為潮熱盜汗，五心煩熱，口干咽燥，頭昏耳鳴，腰膝酸軟，性欲減退或遺精，大便秘結，舌嫩紅，脈細數(shù)而尺弱；③腎陽不足型，證候表現(xiàn)為精神萎鈍，神疲乏力，腰膝酸軟，畏寒肢冷，性欲減退或陽痿早泄，小便清長夜多，大便稀溏。舌淡胖嫩，脈遲而尺弱。

正常生育組同時符合以下①-⑤條件：①正常生育男性，且在一年內有生育；②沒有任何癥狀，中醫(yī)診斷未能確定任何證型；③年齡控制在25～35歲；④男性外生殖器檢查正常，無明顯異常；⑤精液檢查結果未見異常。

1.1.3排除標準（1）逆行射精或不射精患者；睪丸體積小于10 mL患者；（2）精液中有白細胞或細菌培養(yǎng)陽性，或沙眼衣原體、解脲支原體、人型支原體陽性患者；（3）內分泌檢測性腺功能異常及染色體核型異常者；（4）從事放射等特殊職業(yè)者；（5）服抗癲癇、抗腫瘤等有礙生精及精子活力的藥物者；（6）有其他性傳播疾病的患者；（7）合并嚴重心血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等其他疾病，精神病患者。

1.2主要試劑與儀器

Trizol(Invitrogen，美國)，逆轉錄試劑盒(Takara公司)，實時熒光定量PCR試劑盒（Takara公司），人SCF免疫試劑盒(Boster公司)，SynergyH4多功能讀數(shù)儀(美國伯騰)，CFX96實時熒光定量PCR儀(美國伯樂)，-80℃冰箱，37℃水浴恒溫箱，BioSpectrometer紫外/可見光分光光度計（Eppendorf），低速冷凍離心機（Eppendorf 5430R），T100梯度PCR儀（美國伯樂），WLJY9000精子分析儀（北京偉力公司）。

1.3方法

1.3.1標本采集精液采集時，要求患者禁欲3～ 7 d，均以手淫法進行精液采集，收集于無毒、無菌的塑料容器中，取50 μL進行精液分析，剩余精液離心3 000 r/min，分離精漿和精液沉淀物，于-80℃冰箱保存待測。

1.3.2精液分析將采集的精液置于37℃水浴恒溫箱中，測定精液體積，待精液樣本充分液化之后，進行精子活力檢測。

1.3.3精漿SCF濃度檢測標本統(tǒng)一復融，酶聯(lián)免疫吸附實驗測各組精漿SCF濃度，采用SynergyH4多功能讀數(shù)儀測定，操作嚴格按照說明書。

1.3.4實時熒光定量PCR Trizol試劑抽提精漿沉淀總RNA，紫外/可見光分光光度計測定RNA純度和濃度，經(jīng)純度鑒定和濃度測定后，取500 ng總RNA，按逆轉錄試劑盒說明書行逆轉錄，取1.0 μL 的cDNA作為模板，采用熒光定量PCR儀，按熒光定量檢測試劑盒說明書進行熒光定量PCR反應，βactin為內參。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，c-kit上游引物：5'-tcctcgcctccaagaattgt-3'，下游引物：5'-tcacaggtagtcgagcgttt-3'，擴增片段長度為156 bp，β-actin的上游引物：5'-cacccgcgagtacaaccttc-3'，下游引物：5'-cccatacccaccatcacacc-3'，擴增片段長度為207 bp。用20 μL反應體系，反應參數(shù)：95℃變性30 s，之后95℃變性5 s，60℃退火加延伸30 s，共40個循環(huán)。目的基因的相對表達量為2-葒葒ct。

1.3.5統(tǒng)計學方法

2結果

2.1精液分析和SCF結果比較

精液檢查結果顯示，腎虛不育組前向運動精子(A+B）明顯低于正常生育組（P<0.01），兩組在精液量、精子密度、SCF濃度上差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

表1　兩組精液分析和SCF濃度比較（±s）

表1　兩組精液分析和SCF濃度比較（±s）

注：與正常生育組比較**P<0.01。

組別　n　　精液量(mL)　　密度(×106/mL)　　前向運動精子(A+B)(％)　SCF(pg/mL)正常生育組　30　2.72±0.79　44.26±17.32　51.24±10.36　96.33±28.45腎虛不育組　45　2.42±0.85　31.48±21.41　21.83±15.25**　77.54±47.22 t 1.635　5.656　0.982 p 0.055　0.000　0.177

2.2精液沉淀物c-kit結果比較

腎虛不育組c-kit表達高于正常生育組（P< 0.05)，結果見表2。

表2　兩組精液沉淀物c-kit表達　（±s）

表2　兩組精液沉淀物c-kit表達　（±s）

注：與正常生育組比較*P<0.05。

組別　n　c-kit正常生育組　30　1.07±0.93腎虛不育組　45　2.39±1.37* t 2.389 p 0.011

3討論

SCF/c-kit在男性生殖中起著重要作用。精子的發(fā)生在性腺軸的控制之下，F(xiàn)SH作用于支持細胞，支持細胞分泌SCF，SCF與生精細胞上的受體c-kit結合，調節(jié)生精細胞的自我更新和增殖，從而導致精子發(fā)生[4-5]。SCF由支持細胞分泌，隨著生育能力的逐漸旺盛，睪丸組織中的SCF表達也在逐漸增多，表明生精功能的增強與SCF表達增多有密切關系，SCF受體即c-kit蛋白是由原癌基因c-kit表達的蛋白質，在各級生精細胞，睪丸中c-kit mRNA至少有兩種形式[6]，c-kit在生精細胞的表達與精子發(fā)生密切相關[7]。SCF與其受體c-kit相互作用調節(jié)生精細胞增殖、分化、減數(shù)分裂和細胞凋亡，SCF/c-kit系統(tǒng)可通過不同途徑調節(jié)生精細胞的自我更新和增殖，通過磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）通路使c-kit陽性精原細胞從G1期向S期過渡，還通過激活分裂激活蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase, MAPK）通路控制生精過程的進程[8]。SCF/c-kit在抗細胞凋亡方面也發(fā)揮重要作用，SCF通過激活c-kit受體以維持細胞增殖和凋亡的平衡，從而調節(jié)著生精細胞的生存與凋亡[9]。

男性不育癥病變關鍵在腎，益腎補精是治療本病的重要原則[10]，因此我們擬從精液SCF/c-kit研究其在腎虛辨證中的變化情況。該研究中通過病史詢問和精液檢查，首先按照男性不育癥的標準，確定了診斷，對于診斷為不育的患者再按照腎虛的標準確定腎虛不育患者，這些患者部分表現(xiàn)為弱精癥，部分表現(xiàn)為少精癥，部分兩者皆有。研究結果表明兩組患者比較精子密度沒有差異（P>0.05），精漿SCF表達兩組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）、前向運動精子腎虛不育組明顯低于正常生育組（P<0.01）、精液沉淀物中c-kit表達腎虛不育組高于正常生育組（P< 0.05）。從該結果可以看出，精子密度和SCF兩組比較沒有差異，說明此兩指標與腎虛辨證無關，SCF是由支持細胞分泌，腎虛時可能支持細胞沒有受損，因此SCF表達沒有變化。腎虛者前向運動精子降低、精液沉淀物中c-kit表達升高，c-kit主要表達于原始的生精細胞，腎虛者睪丸受損，生精細胞脫落較多從而導致精液沉淀物中c-kit升高。中醫(yī)學認為腎藏精、主生殖，腎虛與不育密切相關。腎藏之精包括先天之精和后天之精，內寓元陰元陽。腎氣以腎精為物質基礎，腎氣充足才能有子。正如《素問·上古天真論》所說：“丈夫八歲，腎氣實……二八腎氣盛，天癸至，精氣溢瀉，陰陽和，故能有子……七八，……天癸竭，精少，腎臟衰，形體皆極”?？梢姡I氣充足才有子，腎氣衰敗則無子。精液是男性生殖的最終產(chǎn)物，因此可以通過精液了解腎氣的盛衰。該研究通過精液檢查，同時在精液中檢測了生精過程中的重要物質SCF/c-kit，結果表明，弱精和c-kit升高與腎虛不育密切相關，在臨床辨證時除了癥狀外，還可以參考精液中精子活動、c-kit這兩個重要指標，從而為提高中醫(yī)辨證的準確性提供客觀指標，為中醫(yī)腎藏精主生殖的基本理論提供科學依據(jù)。

參考文獻：

[1] Unni SK, Modi DN, Pathak SG, et al. Stage-specificlocalization and expression of c-kit in the adult human testis [J]. Histochem Cytochem, 2009, 57(9): 861-869.

[2]世界衛(wèi)生組織.人類精液及精子宮頸粘液相互作用實驗室檢驗手冊［S］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：12.

[3]王琦.王琦男科學[M].鄭州：河南科技出版社，1997：333-395.

[4] Shupe J, Cheng J, Puri P, et al. Regulation of sertoli-germcell adhesion and sperm release by FSH and nonclassical testosterone signaling[J]. Mol Endocrinol, 2011,25(2):238-52.

[5] Bhattacharya I, Pradhan BS, Sarda K, et al. A switch in Sertoli cell responsiveness to FSH may be responsible for robust onset of germ cell differentiation during prepubartal testicular maturation in rats [J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2012, 303(7):E886-898.

[6] Yincent S, Segretain D, Nishikawa S, et al. Stage-specific expression of the kit receptor and its ligand (KL) during male gametog enesis in the mouse:a kit-KL interaction critical for meiosis [J]. Development, 1998, 125(22):4 585-4 593.

[7] Tanigaki R, Sueoka K, Tajima H, et al. C-kit expression in spermatogonia damaged by doxorubicin exposure in mice [J]. J Obstet Gynaecol Res, 2013,39(3):692-700.

[8] Zhang M, Ma Q, Hu H, et al. Stem cell factor/c-kitsignaling enhances invasion of pancreatic cancer cells via HIF -1αunder normoxic condition[J]. Cancer Lett, 2011, 303(2): 108-117.

[9] Sikarwar AP, Rambabu MK, Reddy KV. Differential regulation of gene expression in mouse spermatogonial cells after blocking c-kit-SCF interaction with RNAi [J]. J RNAi Gene Silencing, 2008, 4(1): 302-311.

[10]周青，何清湖，周興,等.譚新華工作室無子(男性不育癥)中醫(yī)診療方案[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2015,35（3）：41-43.

（本文編輯賀慧娥）

·中藥分析·

The Value of SCF/c-kit in Semen of Infertile Male with Nephrasthenia Syndrome

ZHANG Fang, LIU Jianrong*, MA Yuehong, DING Caiyun, YIN Haizhen, GAO Songdan
（The People's Hospital of Shanxi, Taiyuan, Shanxi 030012，China）

Abstract〔〕Objective To evaluate the value of SCF/c-kit in the diagnosis for male infertility with kidney deficiency, and to provide experimental references of the theory to the kidney stores the essence and controls reproductivity. Methods 45 infertile males with kidney deficiency were selected and 30 fertile men were used as control. SCF in seminal plasma was determined by ELISA. The relative expression of c-Kit was detected by real-time PCR, and the relative expression quantity was caculated. Results There is no difference of SCF concentration between the two groups (P>0.05). Compared with fertile men, the forward movement of sperm in infertile men with kidney deficiency was decreased obviously (P<0.01), and relative expression of c -kit was significantly increased (P <0.05). Conclusion Kidney deficiency is closely related to sperm motility and the relative expression quantity of c-Kit in sperm., which can be as indicators for infertile male with kidney deficiency. This study provides scientific basis for the theory of kidney storing the essence and controlling reproductivity.

Keywords〔〕male infertility; nephrasthenia syndrome; stem cell factor; c-kit; asthenospermia; semen

〔通訊作者〕*劉建榮，男，主任醫(yī)師，碩士研究生導師，E-mail：liujianrong3@sina.com。

〔作者簡介〕張芳，女，醫(yī)學學士，主要從事生殖疾病的研究。

〔基金項目〕山西省衛(wèi)生廳科研課題(201201061)。

〔收稿日期〕2015-12-01

〔中圖分類號〕R256.56

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2016.04.006