周成+徐磊+肖新+謝越+汪建飛+馬忠友

摘 要：該研究從農(nóng)田土壤中分離得到67株細(xì)菌，并從中選出一株高產(chǎn)纖維素酶菌株。將這些菌株接種到纖維素培養(yǎng)基上，在pH 5.5和28℃的條件下，利用剛果紅染色溶液進(jìn)行染色后，測(cè)其水解透明圈與菌落的比值的大小，進(jìn)行初步篩選。將這些初篩的菌株接種到培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床培養(yǎng)后，制得粗酶液，并分析羧甲基纖維素酶（CMC）活力測(cè)定和濾紙酶（FP）活力及β-葡萄糖苷酶（BG）。在不同溫度的條件下，對(duì)纖維素酶活力測(cè)定，最終篩選出曲霉A25（Aspergillus sp.）這一株菌株，最適酶活溫度為50℃。產(chǎn)纖維素酶酶活力分別為：CMC酶活達(dá)2 340.92 U/mL；FP酶活達(dá)2.66U/mL；BG酶活達(dá)164.72U/mL。

關(guān)鍵詞：羧甲基纖維素酶；濾紙酶；β-葡萄糖苷酶；曲霉A25

中圖分類號(hào) S154 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2016）08-22-04

Abstract：67 strains of soil bacteria were isolated form farmland，from which a high-yielding cellulase strain was screened.These strains were inoculated on the cellulose medium，and a preliminary screening was conducted，in which we measured hydrolysis transparent circle and the ratio of the size of the colony under pH5.5 and 28℃ conditions by using the Congo Red staining.Furthermore，these selected strains were cultured，and a crude enzyme liquid was extracted for analyzing the activities of carboxymethyl cellulose（CMC），filter paper enzyme（FP）and β-glucosidase（BG）.Under different temperature conditions，the activity of cellulase was determined，and ultimately this one strain of Aspergillus A25 was obtained.Its great activity is under the condition of optimum temperature for 50 ℃.Producing cellulose enzyme activity was as following：CMC amounted to 2 340.92 U/mL，F(xiàn)P activity amounted to 2.66 U/mL，and BG activity amounted to 164.72 U/mL.

Key words：Cerboxymethl cellulose；Filter paper enzyme；β- glucosidase；Aspergillus A25

纖維素物質(zhì)是地球上含量最豐富的碳水化合物[1]，而目前人類對(duì)纖維素的開發(fā)與利用還非常有限，因此如何更有效地開發(fā)和利用纖維素資源已成為當(dāng)今世界的熱門課題之一。目前，對(duì)纖維素的降解利用主要是用酸堿處理等化學(xué)手段，以及汽爆及蒸汽加熱等物理手段[2]。生物法由于對(duì)設(shè)備要求低，分解后的產(chǎn)物易回收利用，以及對(duì)環(huán)境污染較小等特點(diǎn)而備受重視。纖維素是一個(gè)復(fù)雜酶系，根據(jù)其功能的不同可分為3類：作用于纖維素非結(jié)晶區(qū)的內(nèi)切葡聚糖酶（CMC）；作用于無(wú)定型區(qū)切割糖苷鍵的外切葡聚糖酶（FP）；以及作用于纖維二糖的β-葡萄糖苷酶（BG）[3-5]。協(xié)同作用才能將結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然纖維降解。纖維素酶在食品、洗滌、紡織、飼料、造紙等方面具有廣泛的應(yīng)用和發(fā)展前景[5]。通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的67株菌株進(jìn)行初篩和復(fù)篩，A25這一株菌株是本次實(shí)驗(yàn)所篩選的，具有較高降解纖維素活力的菌株，本文對(duì)其纖維素酶的生產(chǎn)培養(yǎng)特性進(jìn)行研究，對(duì)于了解其降解機(jī)制以及實(shí)際應(yīng)用都有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 從農(nóng)田土壤中分離得到67株土壤細(xì)菌。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNS法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 稱0.05g經(jīng)105℃烘干至恒重的葡萄糖溶于少量蒸餾水中，用蒸餾水定溶至500mL配制成濃度為50μg/mL的葡萄糖溶液。取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL和1.2mL葡萄糖溶液再加入蒸餾水將體積配制至10mL。再分別從中取2mL，再加蒸餾水1.0mL再加DNS試劑2.0mL搖勻，置于沸水中煮沸5min，取出置與冷水中冷卻到室溫，測(cè)其OD530值。根據(jù)OD值，以葡萄糖濃度為縱坐標(biāo)，吸光值為橫坐標(biāo)，列出直線回歸方程（Y=aX+b）。

1.2.2 產(chǎn)纖維素酶菌株的培養(yǎng) 在無(wú)菌條件下，將67株菌株接種到纖維素培養(yǎng)基中，放在培養(yǎng)箱里溫度為28℃，培養(yǎng)48h。

1.2.3 剛果紅染色 把培養(yǎng)好的霉菌用剛果紅染色劑覆蓋培養(yǎng)皿一層進(jìn)行染色30min。然后用0.9%生理鹽水沖洗2～3次，觀察其透明圈的大小，并計(jì)算出H/C的比值即酶活，（酶活性=透明圈直徑的值與菌落直徑的比值）。根據(jù)比值的大小進(jìn)行初步篩選。

1.2.4 粗纖維酶液的制備 在無(wú)菌操作下，將初步篩選的7株霉菌分別接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)3～4d，溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為160r。

1.2.5 纖維素酶發(fā)酵液的處理 纖維素酶霉菌搖瓶培養(yǎng)好后，用循環(huán)水式抽濾機(jī)進(jìn)行抽濾。將濾液轉(zhuǎn)入到原三角燒瓶中，放入冰箱備用。

1.2.6 酶活力的測(cè)定 采用DNS法（3，5-二硝基水楊酸比色法）[6-7]。

1.2.7 羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）酶活力測(cè)定 以2.0mL 20%（w/v）羧甲基纖維素鈉溶液為底物，用pH5.0檸檬酸緩沖液配制）。加1mL稀釋酶液于50℃，恒溫水浴反應(yīng)30min，然后加入2mL DNS顯色液，終止反應(yīng)，煮沸5min，再放入冰水中冷卻至室溫。用722S分光光度計(jì)在530nm處測(cè)定光密度OD值，同時(shí)相同條件作空白樣調(diào)零。

1.2.8 濾紙（FP）酶活力測(cè)定 精確吸取4.0mL稀釋酶液和1.0mL pH4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液，置于試管中，加入新華5號(hào)濾紙條（1×3cm）一條，滴入甲苯2～3滴防腐。40℃反應(yīng)24h。吸取上述濾紙酶液2.0mL加入蒸餾水1.0mL，2.0mL DNS顯色液，終止反應(yīng)。沸水煮沸5min，然后再放入冷水中冷卻至室溫。在530nm處測(cè)定光密度OD值，同時(shí)相同條件下作空白調(diào)零。

1.2.9 β-葡萄糖酶（BG）活法測(cè)定 取1.0mL稀釋酶液加2.0mL pH4.6乙酸-乙酸鈉緩沖液配制的1%的水楊酸溶液，50℃酶解30min，加入2.0mL DNS顯色液，終止反應(yīng)，于沸水中水浴5min，用冷水冷卻至室溫，在530nm處測(cè)定其OD值，同時(shí)相同條件下作空白調(diào)零。

1.4 濾紙崩潰實(shí)驗(yàn) 取稀釋酶液4.0mL和1.0mL pH4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液置于試管中。（15×50cm）加入新華5號(hào)濾紙條（1×3cm）一條，滴入甲苯2～3滴（防腐），于恒溫箱內(nèi)40℃保溫24h。觀察濾紙崩潰情況，觀測(cè)標(biāo)準(zhǔn)如下：+++表示濾紙完全沉在底部，搖動(dòng)試管后濾紙呈糊狀；++表示濾紙完全下沉，搖后呈小片狀；+表示濾紙沿底部呈毛狀，搖后部分溶化；-表示濾紙直立完整無(wú)缺，搖后不溶化。

1.5 還原糖含量的測(cè)定 采用DNS法[9]測(cè)還原糖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)纖維素酶菌株的初篩 將67株菌株接種到羧甲基固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)48h，用剛果紅染色靜止30min后測(cè)其H/C的比值，結(jié)果見(jiàn)表2。

從本實(shí)驗(yàn)室保存的67株菌株中，將各菌株分別采用纖維素固體培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)并進(jìn)行篩選，從中篩選出高產(chǎn)纖維素酶菌株。從表2這些菌株的透明圈的直徑與菌落的直徑比值大小可以看出，A25、A5、O7、O8O9、D2、H7、HD的H/C比值較高，這7株產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)，紅色水解透明圈較明顯、較大，具有較高的纖維素酶活力。H/C是透明圈與菌落的比值，比值越大酶活越強(qiáng)。根據(jù)紅色水解透明圈出現(xiàn)的快慢、大小可大致得出該菌株的產(chǎn)纖維素酶情況，這可作為初次判斷的依據(jù)。通過(guò)表2的結(jié)果說(shuō)明A25、A5、O7、O8O9、D2、H7、HD7株菌株具有較高的酶活力。

2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照1.2.1所描述的方法制備出標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線（圖1），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線求出直線回歸方程y=0.003 4x-0.505，R2=0.996 8（y：葡萄糖濃度，x：OD530的值），通過(guò)直線回歸方程可以計(jì)算纖維素酶酶促反應(yīng)中產(chǎn)生葡萄糖的濃度，從而根據(jù)酶活力單位定義算出酶活。

2.3 高產(chǎn)纖維素酶菌株的復(fù)篩 挑選上述試驗(yàn)中濾紙酶活性較高的7個(gè)菌株進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)，將所獲得的菌株A25、A5、O7、0809、D2、H7、HD菌株接到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床發(fā)酵培養(yǎng)后，在獲得發(fā)酵液的基礎(chǔ)上制得粗酶液。測(cè)定其濾紙酶活、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活。各菌株均設(shè)3個(gè)處理，取其平均值，如表3。

2.4 溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響 溫度對(duì)酶促反影響的原因主要有以下2個(gè)方面，一是溫度對(duì)酶蛋白穩(wěn)定性的影響，即對(duì)酶熱變性失活作用，二是溫度對(duì)酶促反應(yīng)本身的影響，其中可能包括影響酶和底物的結(jié)合，影響Vmax，影響酶和底物分子解離基團(tuán)的pK，影響酶與抑制劑、激活劑或輔酶的結(jié)合等[8]。吸粗酶液2mL和2mL DNS和1mL蒸餾水加入試管分別于40℃、50℃、60℃、70℃和80℃不同水浴鍋中處理30min后，對(duì)菌體的酶活進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，反應(yīng)溫度對(duì)菌株A25的酶活有顯著影響，其最適酶活溫度為50℃，當(dāng)水浴處理溫度高于50℃或低于50℃時(shí)，該菌株A25酶活減弱，但是培養(yǎng)液仍具有較高的纖維素酶活力；同時(shí)也表明該菌株所產(chǎn)的纖維素酶具有較高熱穩(wěn)定性?？梢?jiàn)，50℃所測(cè)得的酶活力最高，即此酶的最適酶活溫度為50℃。

3 討論

3.1 高產(chǎn)纖維素酶菌株的初篩 纖維素在纖維素酶的作用下水解成纖維二糖和葡萄糖，水解后的糖類與剛果紅染料形成紅色沉淀，使產(chǎn)酶菌株的菌落周圍出現(xiàn)清晰的紅色水解圈，根據(jù)水解圈的大小可粗略的估計(jì)菌株產(chǎn)酶的情況，然后選取透明圈較大的菌株進(jìn)行接種。剛果紅是對(duì)纖維素酶進(jìn)行初步篩選的試驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)方法比較簡(jiǎn)單。通過(guò)它可以使纖維素固體培養(yǎng)基上的菌種的代謝產(chǎn)物形成淺紅色水解透明圈。用剛果紅染液覆蓋培養(yǎng)皿一層靜止染色30min，纖維素酶菌株產(chǎn)纖維素酶越多，產(chǎn)生的紅色水解透明圈越大，產(chǎn)纖維素酶速度越快，淺紅色水解透明圈出現(xiàn)的越早。雖然水解透明圈H/C的比值大小直接反映了酶活水平的高低，但不能完全代表菌株產(chǎn)酶能力，不能定量說(shuō)明該菌株產(chǎn)纖維素酶的能力。也有研究表明液體樣品的酶濃度與透明圈的直徑（下轉(zhuǎn)127頁(yè)）（上接24頁(yè)）成線性關(guān)系，可以對(duì)酶活進(jìn)行初步定量[10]。

3.2 高產(chǎn)纖維素酶菌株的復(fù)篩 已知纖維素酶的作用方式：CO酶是使天然纖維素晶體分鏈，起一個(gè)分離和水合作用，從而使天然纖維素裂解成為直鏈纖維素；而C0酶雖不能水解天然纖維素，但能水解直鏈纖維素的β-l，4-葡萄糖苷鍵生成纖維二糖，纖維二糖再經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解成為葡萄糖。前人研究認(rèn)為，纖維素的降解關(guān)鍵是濾紙酶活的高低，再結(jié)合β-葡萄糖苷酶活，而CMC酶活只作參考。通過(guò)對(duì)7個(gè)菌株發(fā)酵液的濾紙酶活、CMC酶活、β-葡萄糖苷酶活進(jìn)行測(cè)定，初步篩選出產(chǎn)纖維素酶活力較高的A25菌株。初步試驗(yàn)表明，在50℃反應(yīng)時(shí)間30min，pH5.5時(shí)A25菌株產(chǎn)生的纖維素酶的活性有較大提高。建議對(duì)A25進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化試驗(yàn)，以探明其最適的產(chǎn)酶條件，或?qū)ζ溥M(jìn)行進(jìn)一步的誘變，以提高其酶活性應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。

3.3 溫度對(duì)纖維素酶活性的影響 從粗酶液中吸粗酶液2mL和2mL DNS和1mL蒸餾水加入試管中，在不同的水浴溫度下水浴處理30min后，對(duì)菌體的產(chǎn)酶量進(jìn)行檢測(cè)。為了確定酶活的最適溫度，通過(guò)測(cè)40～80℃不同溫度下的實(shí)驗(yàn)確定酶活，不同培養(yǎng)溫度對(duì)纖維素酶有不同的影響，結(jié)果表明，曲霉A25水浴處理在40℃時(shí)酶活力表現(xiàn)較低，50℃時(shí)酶活力達(dá)到最大值，水浴處理溫度超出50℃時(shí)酶活力逐漸變小。對(duì)于纖維素酶活的最適溫度為50℃，即纖維素酶產(chǎn)量的最適溫度在50℃。

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（責(zé)編：張宏民）