地西他濱對惡性黑色素瘤細(xì)胞A375增殖、凋亡及侵襲的影響

霍文亮　弓軍勝　李晉?！⊥貔i　張寶林

[摘要]目的：研究甲基化抑制劑地西他濱對人惡性黑色素瘤細(xì)胞A375增殖、凋亡及侵襲的影響。方法：采用不同濃度的地西他濱對A375細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，用MTT實(shí)驗(yàn)檢測地西他濱對細(xì)胞增殖的影響，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的變化，劃痕愈合實(shí)驗(yàn)及Transwell小室實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞體外遷徙侵襲能力的改變。結(jié)果：與對照組相比，地西他濱組A375細(xì)胞的增殖活性受到明顯抑制，凋亡比例顯著增加，體外遷移和侵襲能力減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），地西他濱對A375細(xì)胞周期的影響則無顯著差異（P>0.05）。結(jié)論：地西他濱能抑制惡性黑色素瘤A375細(xì)胞的增殖，其抗腫瘤效應(yīng)有可能成為惡性黑色素瘤治療的新途徑。

[關(guān)鍵詞]黑色素瘤；地西他濱；增殖；凋亡；侵襲

[中圖分類號]R739.5 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號]1008-6455（2016）03-0039-05

皮膚惡性黑色素瘤起源于黑色素細(xì)胞，惡性程度高，易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。早期惡性黑色素瘤以外科治療為主，但有1/3的患者就診時已出現(xiàn)局部轉(zhuǎn)移，并且1/5的早期手術(shù)患者可發(fā)生局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。常規(guī)化療及放射性治療的臨床獲益率也不高。DNA的甲基化是最常見的表觀遺傳現(xiàn)象，當(dāng)基因啟動子區(qū)的CpG島發(fā)生甲基化時，常導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄沉寂，使重要基因如抑癌基因、修復(fù)基因等喪失功能，導(dǎo)致正常細(xì)胞的生長分化調(diào)控失常，以及DNA損傷不能被及時修復(fù)，DNA的異常甲基化與多種腫瘤形成密切相關(guān)。在惡性黑色素瘤中，DNA的異常甲基化與其發(fā)生及進(jìn)展存在密切關(guān)系。值得注意的是，DNA的異常甲基化具有可逆性，異常甲基化引起的基因沉默現(xiàn)象可被甲基化抑制劑逆轉(zhuǎn)，本研究以人皮膚惡性黑色素瘤細(xì)胞A375為研究對象，觀察甲基化抑制劑地西他濱對其增殖、凋亡、侵襲等生物學(xué)行為的影響，為惡性黑色素瘤的治療提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 研究方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑

人皮膚惡性黑色素瘤A375細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫；地西他濱購自Sigema公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、無支原體胎牛血清、胰酶、噻唑藍(lán)（MTT）及碘化丙啶（PI）夠自于Thermo fisher公司；凋亡檢測試劑盒夠自于Beckman公司；去鈣鎂離子Hanks平衡鹽溶液、PBS磷酸鹽平衡液、雙抗溶液（青、鏈霉素）夠自于博士德公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

A375細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清和1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)箱條件：37℃，5%CO₂，飽和濕度，培養(yǎng)箱底層放置硫酸銅溶液。傳代時采用Hanks平衡鹽溶液漂洗3次，0.25%胰酶消化。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn)

懸浮指數(shù)增長期的A375細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×10⁴個/ml，均勻接種到96孔板。細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)基，加入待測藥物。分別加入0μmol/l（對照組）、1μmol/l、5μmol/l、25μmol/l、125μmol/l的地西他濱。各濃度設(shè)5個重復(fù)孔。分別于加藥后24h、48h、72h進(jìn)行MTT檢測，酶標(biāo)儀測定波長490nm下的吸光值（A）。計(jì)算細(xì)胞生長抑制率，抑制率IR=（1-實(shí)驗(yàn)組A/對照組A）×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡及周期檢測

藥物干預(yù)24h后，AnnexinV-FITC/PI法檢測A375凋亡比例：收集各組的細(xì)胞，用冰PBS洗滌2次，1×bindingbuffer調(diào)整細(xì)胞濃度為10⁴/ml，加入5μl AnnexinV稀釋液混勻，再加入2.5μlPI混勻。避光、冰上孵育10min，加入400μl1× bindingbuffer，30min內(nèi)置于流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測。細(xì)胞周期檢測：用冰PBS液洗滌2次，加入預(yù)冷的70%乙醇，于4℃冰箱過夜。離心收集細(xì)胞，冰PBS液洗滌2次，用1ml PBS懸浮細(xì)胞，分別加入10μl PI（50mg/m1）及10g/1的RNaseA 5μl。室溫避光30min后上流式細(xì)胞儀檢測。應(yīng)用CELLquest系統(tǒng)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

調(diào)整細(xì)胞濃度為10⁴/ml接種于Transwell孔板上室，上室培養(yǎng)基含不同濃度的藥物，胎牛血清濃度為10%。下室僅加入培養(yǎng)基，胎牛血清濃度20%。置37℃、5%CO₂、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24h后取出上室，去除上室的細(xì)胞，甲醛固定，蘇木精染色，置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞通過情況，隨機(jī)計(jì)數(shù)十個視野（200×）取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，取平均值。

1.6 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)

將A375細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞生長至指數(shù)增長期時，用移液器槍尖進(jìn)行劃痕處理，PBS液洗去脫落的細(xì)胞，拍照后繼續(xù)入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24h時對各組細(xì)胞再次拍照，圖片采用Image Pro Plus軟件進(jìn)行分析。按照如下公式計(jì)算劃痕愈合率，劃痕愈合率（%）=（1各時間點(diǎn)劃痕面積/開始的劃痕面積）×100%，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS16.0軟件分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 地西他濱對A375細(xì)胞增殖的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對照組細(xì)胞相比，地西他濱對A375細(xì)胞的增殖活性受到抑制（P<0.05），從MTT結(jié)果繪制的生長曲線可以看出：隨著藥物濃度的增加以及作用時間的延長，抑制率逐漸增高，即濃度和時間依賴性（見圖1）。

2.2 地西他濱對A375細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響

24h時，自5μmol/l濃度開始，A375細(xì)胞的凋亡比例顯著增高，與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明地西他濱可有效誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡（見表2，圖2）；24h時，25μmol/l及125μmol/l濃度組A375細(xì)胞G₀/G₁期比例顯著增高，與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（見表2，圖3）。

2.3 地西他濱對A375細(xì)胞侵襲能力的影響

對照組A375細(xì)胞通過微孔的數(shù)量為34.7±6.5，不同濃度地西他濱干預(yù)后A375細(xì)胞通過微孔的數(shù)量依次為32.0±8.2、28.8±7.2、20.3±6.1、15.5±3.4。其中：地西他濱25μmol/l及125μmol/l組與對照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（見圖4）。

2.4 地西他濱對A375細(xì)胞遷徙能力的影響

對照組及各濃度地西他濱組24h劃痕愈合面積依次為（70.7±7.1）%、（66.3±4.8）%、（60.2±8.5）%、（34.1±7.8）%、（12.5±4.8）%。其中：5μmol/l、25μmol/l及125μmol/l組與對照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（見圖5）。

3 討論

表觀遺傳學(xué)是指基于非核苷酸序列改變所致基因表達(dá)水平變化，DNA甲基化是最常見的表觀遺傳現(xiàn)象，腫瘤抑制基因啟動子區(qū)的異常甲基化是腫瘤發(fā)生過程中的顯著特征，在分子水平比較腫瘤組織和其對應(yīng)的正常組織，DNA甲基化狀態(tài)的變化可能普遍存在，幾乎所有的腫瘤中都能找到異常的DNA甲基化。DNA甲基化可以使癌細(xì)胞在腫瘤發(fā)生早期，更傾向于通過一些改變了的信號傳導(dǎo)途徑擴(kuò)增并獲得遺傳突變，從而具有選擇性，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。在惡性黑色素瘤中亦存在DNA的異常甲基化：抑癌基因P16異常甲基化引起的細(xì)胞周期依賴性激酶抑制基因CDKN2A編碼失活可能與其發(fā)生密切相關(guān)。此外，與細(xì)胞凋亡，增殖調(diào)節(jié)相關(guān)的基因如：RASSFIA，RUNX3，SOCS1等異常甲基化現(xiàn)象在惡性黑色素瘤中也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)?？傊珼NA異常甲基化引起的抑癌基因或調(diào)節(jié)基因失活被認(rèn)為與惡性黑色素瘤的發(fā)病密切相關(guān)。

地西他濱是一種特異性的甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑，其與甲基轉(zhuǎn)移酶共價(jià)結(jié)合形成復(fù)合物，不可逆地抑制該酶的甲基轉(zhuǎn)移活性而發(fā)揮去甲基化作用。目前，地西他濱已應(yīng)用于臨床，主要治療骨髓增生異常綜合征、慢性粒細(xì)胞白血病等血液系統(tǒng)疾病，雖然地西他濱尚未應(yīng)用于實(shí)體瘤的治療，但體外研究及動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其對實(shí)體瘤也具有一定的抗腫瘤效應(yīng)。本研究觀察了地西他濱對惡性黑色素瘤A375細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期、侵襲等生物學(xué)行為的影響。從MTT結(jié)果繪制的生長曲線可以看出，A375細(xì)胞的抑制率隨著藥物濃度的增加及作用時間的延長逐漸增高，說明地西他濱對A375細(xì)胞的增殖抑制作用具有一定的濃度和時間依賴性。通過流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)：經(jīng)地西他濱處理的A375細(xì)胞凋亡比例顯著增加，同時處于G₀/G₁期的細(xì)胞比例增加，S期比例減少，細(xì)胞周期受到阻滯。腫瘤細(xì)胞侵襲能力反映其惡性程度，本研究采用transwell小室實(shí)驗(yàn)?zāi)M細(xì)胞侵襲過程，與對照組細(xì)胞相比，經(jīng)地西他濱處理的A375細(xì)胞穿膜數(shù)量顯著降低，提示地西他濱在一定程度上降低了A375細(xì)胞的侵襲能力。同時，同一時間點(diǎn)地西他濱組A375細(xì)胞的劃痕愈合率明顯小于對照組，說明地西他濱減弱了腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動遷徙能力。

綜上研究結(jié)果表明：地西他濱在體外可有效抑制惡性黑色素瘤A375細(xì)胞生長、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期，同時削弱A375細(xì)胞侵襲、遷徙能力，有望為惡性黑色素瘤的治療提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，而其作用的分子機(jī)制及體內(nèi)應(yīng)用的安全性等尚待進(jìn)一步研究。

編輯/張惠娟