維生素D受體基因FokI酶切位點(diǎn)與胃癌的影響因素研究方法

高潔　王海江

[摘要] 目的 探討維生素 D 受體基因 Fok I 酶切位點(diǎn)多態(tài)性與胃癌的影響因素。 方法 隨機(jī)選取2013年5月—2015年5月該院就診的維吾爾族胃癌患者143例（A組）及維吾爾族健康對照者147例（B組），采用多聚酶鏈反應(yīng)-限制性酶切片段長度多態(tài)性（Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP）方法測定維生素D受體基因Fok I酶切位點(diǎn)多態(tài)性，進(jìn)行兩組間比較。 結(jié)果 單因素Logistic回歸分析顯示：胃癌患者的f等位基因頻率高于對照組（58.0% vs 47.3%，P<0.05）。多因素Logistic回歸分析顯示：帶有f等位基因（Ff + ff）的受試者表現(xiàn)出較高的患胃癌的風(fēng)險（OR值2.87）。 結(jié)論 VDR的FokI酶切位點(diǎn)多態(tài)性是胃癌易感性影響因素。f等位基因可能是胃癌發(fā)生的危險因素之一，而F等位基因可能是胃癌的保護(hù)因素。

[關(guān)鍵詞] 維生素D受體；FokI酶切位點(diǎn)；胃癌；單因素分析；多因素分析

[中圖分類號] R589 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2016）02（b）-0064-04

[Abstract] Objective Discussion of vitamin D receptor gene Fok I restriction site polymorphism influencing factors and gastric cancer. Methods 143 cases of Uygur patients with gastric cancer treated in our hospital from May 2013 to May 2015 were randomly selected as the group A， 147 cases of Uygur healthy people treated in our hospital at the same period were selected as the group B （control group ）， the polymorphism of vitamin D acceptor gene FokI restriction enzyme cutting site was measured by Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism method，PCR-RFLP and compared between the two groups. Results The single factor Logistic regression analysis showed that F allele frequency in the gastric cancer group was higher than that in the control group （58.0% vs 47.3%，P<0.05）， multi-factor Logistic regression analysis showed that the subjects with F allele（Ff + ff）had a higher risk of gastric cancer（OR value was 2.87）. Conclusion VDR FokI restriction site polymorphisms are susceptibility factors in gastric cancer. F allele may be one of the risk factors of occurrence of gastric cancer， however， F allele may the protective factor of gastric cancer.

[Key words] Vitamin D acceptor； FokI restriction enzyme cutting site； Gastric cancer； Single factor analysis； Multi-factor analysis

胃癌是一種很常見的嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，但其致病因素至今仍不清楚。維生素D受體是介導(dǎo)1，25（OH）2D3發(fā)揮生物效應(yīng)的核內(nèi)生物大分子，為類固醇激素/甲狀腺激素受體超家族的成員[1]。有報道認(rèn)為[2]：位于VDR基因2號外顯子翻譯起始密碼子區(qū)域的Fok I酶切位點(diǎn)，其多態(tài)性影響蛋白質(zhì)的正常功能，使轉(zhuǎn)錄效率降低，造成VDR不能有效的與1，25（OH）2D3結(jié)合，影響其生物效應(yīng)的發(fā)揮，增加腫瘤易感性。但Lee等認(rèn)為[3]：Fok I位點(diǎn)的f基因是腫瘤遺傳易感基因，當(dāng)Fok I位點(diǎn)的F基因型蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄活性顯著強(qiáng)于f基因型時可以減少腫瘤發(fā)生幾率。因此Fok I酶切位點(diǎn)多態(tài)性對于腫瘤的作用，目前尚無定論。同時胃癌的發(fā)生發(fā)展是否同樣受到Fok I酶切位點(diǎn)多態(tài)性的影響，仍是爭論的焦點(diǎn)。為此，該研究隨機(jī)選取2013年5月—2015年5月該院就診的胃癌患者143例及參加體檢的健康對照者147例入組，通過對比兩組受試者的Fok I酶切位點(diǎn)多態(tài)性差異，以期明確影響Fok I酶切位點(diǎn)多態(tài)性對胃癌患者的影響現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選取2013年5月—2015年5月該院就診的維吾爾族胃癌患者143例及參加體檢的維吾爾族健康對照者147例入組，所有參與者均無血緣關(guān)系，其中男141例、女149例，年齡39～74歲（61.13±12.06）。經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意，向每一位參與者均簽署知情同意書及倫理同意書并進(jìn)行血液樣本的采集（抽取5 mL肘靜脈血液），同時完成問卷，以獲得人口特征，如：年齡、性別、身高、體重、吸煙和飲酒史。吸煙者定義：每天至少抽1根煙，吸煙時間>1年；飲酒者定義：每周飲用含酒精飲料>50 g，飲酒時間>1年。胃癌患者（A組）男74例，女69例，年齡（60.82±11.83）歲，體重指數(shù)為（24.65±5.19），吸煙人數(shù)為87例，不吸煙者為56例，飲酒人數(shù)為82例，不飲酒者為61例，健康對照者（B組）男67例，女80例，年齡（61.42±12.51）歲，體重指數(shù)為（24.29±5.03），吸煙人數(shù)為81例，否認(rèn)吸煙者為66例，飲酒人數(shù)為76例，否認(rèn)飲酒者為71例，兩組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P >0.05）。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 胃癌病例納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：首次接受治療的胃癌患者；經(jīng)病理學(xué)明確診斷為腺癌的胃癌患者；未行手術(shù)或新輔助放、化療及其它治療的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：已行手術(shù)或新輔助放、化療及其它治療的患者；患有其它疾病的患者。

1.2.2 健康對照者納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)過體檢及癌篩檢查未患癌及其他疾病的健康人。排除標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)過體檢及癌篩檢查或臨床確診患癌或其它疾病的患者。

1.3 試驗方法

①提取患者的基因組DNA，試劑盒由北京博凌科為生物科技有限公司提供。②PCR反應(yīng)體系（25 μL），包括模板DNA及引物各1 μL，2×Taq Plus PCR Master Mix（北京博凌科為生物科技有限公司）12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，無菌去離子水補(bǔ)足總體積至25 μL。③引物合成 依據(jù)文獻(xiàn)[4]設(shè)計引物，由生工生物工程（北京）股份有限公司合成。FokI上下游引物分別為：5-AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT-3和5-ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC-3。④FokI的擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，33個循環(huán)后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。⑤FokI酶切：產(chǎn)物10 μL中加入FokI限制性內(nèi)切酶（Ta Ka Ra公司）1 μL（10 U），10×M Buffer 2 μL，0.1% BSA 2 μL，dd H2O 5 μL，37 ℃溫水浴 1 h。⑥酶切產(chǎn)物用2%含有溴化乙啶瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析系統(tǒng)（BIO-RAD公司Gel DocTMXR+）分析基因型。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行計算，使用χ2 檢驗計數(shù)資料，以n表示，計算研究對象與Hardy-Weinberg平衡的符合程度。比值比（OR）表示相對危險度；危險因素分析采用Logistic多元回歸。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 單因素分析結(jié)果

全組受試者FokI位點(diǎn)基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗（P>0.05）。兩組受試者進(jìn)行年齡、性別、體重指數(shù)、吸煙和飲酒史對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。Fok I酶切位點(diǎn)的f基因是腫瘤遺傳易感基因。故將帶有f位點(diǎn)的Ff及ff基因共同與FF基因進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。f位點(diǎn)在胃癌患者中的含量較健康受試者升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.2 多因素分析結(jié)果

將單因素分析中有統(tǒng)計學(xué)意義的影響因素帶入Logistic回歸模型中進(jìn)一步行多因素分析，結(jié)果提示：帶有f等位基因的受試者患胃癌的風(fēng)險是沒有f等位基因的受試者的2.87倍，（OR =2.87， P < 0.05），見表2。

3 討論

手術(shù)、化療和放療等常規(guī)治療手段可以減少癌癥的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，但對多數(shù)惡性腫瘤仍無法做到徹底治愈[5]。在腫瘤的治療已進(jìn)入分子生物水平的時代，如何能夠從基因水平解釋癌癥的發(fā)生發(fā)展過程，降低癌癥的發(fā)病率一直是學(xué)者們的研究方向。而基因的多態(tài)性對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要的作用，對于基因多態(tài)性的探索就成為學(xué)者們的爭論熱點(diǎn)。

維生素D受體（Vitamin D Receptor，VDR）作為介導(dǎo)1，25（OH）2D3發(fā)揮生物效應(yīng)的核內(nèi)生物大分子，其編碼基因位于12號染色體長臂1區(qū)3帶上，全長約75 kb，由11個外顯子和11個內(nèi)含子組成[6-7]。5′端非編碼區(qū)包括外顯子1A、1B、1C，另外8個外顯子（外顯子2～9）編碼VDR分子的結(jié)構(gòu)部分。經(jīng)過引物延伸和S1核酸酶圖譜分析，顯示有多個轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，外顯子1B和1C不同的剪接可產(chǎn)生3種不同的mRNA[8]。維生素D受體多態(tài)性影響到多種正常或腫瘤組織細(xì)胞的生長和分化。相關(guān)報道表明[9-13]：維生素D受體多態(tài)性與乳腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌及糖尿病等的發(fā)生發(fā)展均存在關(guān)聯(lián)。胃癌作為最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率位居全球惡性腫瘤排名第四位，死亡率居惡性腫瘤第二位，是中國癌癥患者死亡的第三大原因[14-16]。維生素D受體基因多態(tài)性對胃癌發(fā)生發(fā)展的影響目前尚存爭議。該研究Logistic多元回歸單因素結(jié)果顯示：帶有f位點(diǎn)的Ff+ff基因在胃癌患者中的比例較健康受試者明顯升高（76.2% vs 65.3%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。而帶有F位點(diǎn)的FF基因在胃癌患者中比例下降（23.8% vs 34.7%）。多因素結(jié)果顯示：帶有f等位基因的受試者患胃癌的風(fēng)險是沒有f等位基因的受試者的2.87倍，（OR =2.87， P < 0.05）。提示f位點(diǎn)與胃癌易感性相關(guān)，可能是胃癌發(fā)生的危險因素之一，而F位點(diǎn)可能為胃癌發(fā)生的保護(hù)因素。這與文獻(xiàn)報道相似[17]。

綜上所述，帶有f等位基因的Ff及ff基因在胃癌患者中的比例較健康受試者明顯升高，而帶有F等位基因的FF基因在胃癌患者中比例下降，VDR的FokI酶切位點(diǎn)多態(tài)性與維吾爾族胃癌易感性相關(guān)，f等位基因可能是胃癌發(fā)生的危險因素之一，而F等位基因可能為胃癌發(fā)生的保護(hù)因素。

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