飼料發(fā)酵對(duì)豬糞厭氧堆肥發(fā)酵過程中酶活的影響

盛清凱 夏冬 孟憲利 韓紅 趙紅波 李祥明

摘 要：為促進(jìn)種養(yǎng)結(jié)合，研究飼料發(fā)酵對(duì)豬糞堆肥厭氧發(fā)酵的影響。試驗(yàn)分為三組，對(duì)照組為飼喂干粉料的母豬糞，試驗(yàn)Ⅰ組為干粉料母豬糞+混合菌（枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌），試驗(yàn)Ⅱ組為飼喂混合菌厭氧發(fā)酵飼料的母豬糞。不同豬糞分別與小麥殼混勻后堆積厭氧發(fā)酵。結(jié)果表明：飼料發(fā)酵使飼料和新鮮豬糞中乳酸菌增加，大腸桿菌減少（P<0.01），纖維素酶活性增加（P<0.05）；堆肥過程中，試驗(yàn)Ⅰ組和Ⅱ組纖維素酶、蛋白酶、脲酶的活性先降低然后逐漸升高，兩組變化趨勢(shì)相似（P<0.05）。飼料發(fā)酵影響堆肥中酶的活性，發(fā)酵飼料豬糞容易腐熟，枯草芽孢桿菌可能在生豬飼料發(fā)酵及堆肥發(fā)酵整個(gè)過程中發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵飼料；豬糞；堆肥；纖維素酶；枯草芽孢桿菌

中圖分類號(hào)：S816.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2016）05-0111-05

Abstract To promote the combination of cropping and livestock farming， the effects of feed fermentation on enzyme activities in pig feces during anaerobic composting fermentation were investigated. The test contained three groups， the control group was feces of sows fed with dry mash， the group Ⅰ was feces added mixed bacteria （Bacillus subtilis and Lactobacillus plantarum）， and the group Ⅱ was feces of sows fed with wet diet anaerobically fermented by mixed bacteria. The feces were respectively anaerobically fermented after mixed with wheat shells. The results showed that feed fermentation increased the lactic acid bacteria contents in feed and fresh feces， while the E. coli contents decreased （P<0.01）， and the cellulase activity increased （P<0.05）. The variation trends of cellulase， protease and urease in group Ⅰ and Ⅱ were similar during the composting process （P<0.05）. The results indicated that feed fermentation affected the enzyme activities in composting， the feces of fermented feed was easy to compost and Bacillus subtilis might play a key role in the whole process of feed fermentation and composting fermentation.

Key words Feed fermentation； Pig feces； Composting； Cellulase； Bacillus subtilis

畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展在提高人們生活水平的同時(shí)所帶來的養(yǎng)殖污染也日益引起人們的重視。畜禽糞便作為動(dòng)物的排泄物，其組分及含量受飼料中蛋白質(zhì)含量及益生菌的影響[1～3]。同時(shí)畜禽糞便含有作物生長(zhǎng)所需的氮磷鉀等多種營(yíng)養(yǎng)元素和有機(jī)質(zhì)，又是重要的有機(jī)肥資源，其變化還影響著糞肥等后續(xù)產(chǎn)品的加工及質(zhì)量[4]。堆肥是常用的一種處理糞便的方法，通過堆肥可實(shí)現(xiàn)畜禽糞便無害化和有機(jī)肥生產(chǎn)的統(tǒng)一，是養(yǎng)殖業(yè)和種植業(yè)的對(duì)接技術(shù)之一。從飼料生產(chǎn)這一源頭開始研究飼料對(duì)糞便堆肥的影響有助于養(yǎng)殖、種植業(yè)的結(jié)合。

飼料中添加外源菌厭氧發(fā)酵后，有益菌擴(kuò)繁，淀粉酶、蛋白酶等酶活升高，豬生產(chǎn)性能提高，豬糞中的菌群發(fā)生變化，糞便中氮磷被降解及減排，臭味降低[5，6]。飼料發(fā)酵對(duì)糞便堆肥的影響尚不清楚。由于飼料發(fā)酵及堆肥發(fā)酵都是在微生物作用下完成的，飼料發(fā)酵中的微生物可能通過微生物自身或微生物分泌的酶制劑等產(chǎn)物影響著體外豬糞的堆積發(fā)酵。酶作為微生物分泌的產(chǎn)物，分解豬糞中的纖維素、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，其活性可作為判定豬糞堆制過程中腐熟程度的定量生化指標(biāo)[7]。本研究就發(fā)酵飼料對(duì)豬糞堆肥發(fā)酵中酶活的影響進(jìn)行探析，以期為養(yǎng)殖污染治理及糞便的資源化利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和材料

體況相近、產(chǎn)仔數(shù)相近、產(chǎn)3胎的大×長(zhǎng)二元健康、妊娠1天的母豬120頭，由臨邑綠葉種豬場(chǎng)提供?？莶菅挎邨U菌和植物乳桿菌皆由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供，其含量均為1×109 cfu/g，添加劑量為0.05%。小麥殼由市場(chǎng)購(gòu)買。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將母豬隨機(jī)均分為對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組，單欄飼養(yǎng)。對(duì)照組和試驗(yàn)Ⅰ組母豬飼喂母豬干粉狀全價(jià)配合飼料，試驗(yàn)Ⅱ組飼喂以母豬干粉狀全價(jià)配合飼料為基礎(chǔ)的發(fā)酵濕料。發(fā)酵濕料制作方法為將母豬干粉狀全價(jià)配合飼料與枯草芽孢桿菌和乳酸菌混合后塑料袋厭氧發(fā)酵[8]。發(fā)酵成熟后開始飼喂。生豬由專人飼喂，干清糞法分別收集不同組的新鮮糞便，將其各自與小麥殼按1∶1體積比混勻后裝入直徑為1.0 m、高度為1.5 m的避光密封塑料桶中厭氧發(fā)酵。每組3個(gè)桶。試驗(yàn)Ⅰ組小麥殼中添加枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌，添加劑量為0.05%，對(duì)照組和試驗(yàn)Ⅱ組的小麥殼中不添加枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌。

1.3 取樣

生豬飼喂1個(gè)月后在10處代表性位點(diǎn)收集對(duì)照組和試驗(yàn)Ⅱ組飼料樣品（n=10），進(jìn)行細(xì)菌和酶活指標(biāo)檢測(cè)。同期對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組每組隨機(jī)選取10頭早7∶00空腹收集生豬新鮮糞便（n=10），其中對(duì)照組和試驗(yàn)Ⅰ組進(jìn)行菌群、pH及酶活等相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。然后將三組新鮮豬糞分別與小麥殼混勻填入塑料桶進(jìn)行厭氧發(fā)酵，厭氧發(fā)酵時(shí)每桶選取代表性位點(diǎn)4處每隔3天測(cè)定一次表面20 cm深處的發(fā)酵溫度（n=12），每隔6天每桶中選取4處代表性位點(diǎn)取樣對(duì)發(fā)酵豬糞的發(fā)酵溫度、酶活進(jìn)行分析（n=12）。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

飼料和糞便及堆肥中酶活性的測(cè)定：將樣品與水按重量比1∶6比例稀釋，0.45 μm過濾，取濾液按照試劑盒說明進(jìn)行測(cè)定。纖維素酶、中性蛋白酶、脲酶及過氧化氫酶試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。同時(shí)取濾液測(cè)定pH值。

乳酸菌、大腸桿菌采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SAS （ V 9.1） 軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，飼料和豬糞中的數(shù)據(jù)采用t-test進(jìn)行t檢驗(yàn)，厭氧發(fā)酵過程中的數(shù)據(jù)采用ON-WAY ANNOVA進(jìn)行方差分析，用Student-Newmnan-Keuls法進(jìn)行多重比較，P<0.05 為差異顯著，P<0.01 為差異極顯著。不同酶活的相關(guān)性采用CORR程序分析。數(shù)據(jù)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料發(fā)酵對(duì)飼料和新鮮豬糞菌群及酶活的影響

由表1可見，和對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅱ組飼料中的乳酸桿菌含量、纖維素酶酶活極顯著升高（P<0.01），中性蛋白酶和脲酶的活性顯著升高（P<0.05），大腸桿菌含量極顯著降低（P<0.01）。試驗(yàn)Ⅱ組豬糞中的乳酸桿菌含量極顯著增加（P<0.01），纖維素酶活性顯著增加（P<0.05），大腸桿菌含量極顯著降低（P<0.01），中性蛋白酶及脲酶無顯著變化（P>0.05）。結(jié)果表明，飼料發(fā)酵改變了飼料中的微生物菌群及酶活性，并且影響豬糞中的菌群及酶活。

2.2 飼料發(fā)酵對(duì)飼料和豬糞以及厭氧發(fā)酵豬糞pH值的影響

由表2可見，和對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅱ組飼料pH值顯著降低，新鮮豬糞pH值顯著升高（P<0.05）。在豬糞厭氧發(fā)酵的第6、18、30天試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組pH值顯著高于對(duì)照組（P<0.05），兩試驗(yàn)組之間無顯著差異（P>0.05）。結(jié)果表明，飼料發(fā)酵影響飼料和新鮮豬糞以及厭氧發(fā)酵豬糞的pH值。

2.3 飼料發(fā)酵對(duì)厭氧發(fā)酵豬糞發(fā)酵溫度的影響

由圖1可見，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，三組豬糞的發(fā)酵溫度逐漸升高，維持一段時(shí)間高峰，后逐漸降低。高峰期及試驗(yàn)結(jié)束時(shí)試驗(yàn)Ⅱ組的發(fā)酵溫度顯著高于試驗(yàn)Ⅰ組，試驗(yàn)Ⅰ組顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。結(jié)果表明，飼料發(fā)酵的豬糞和添加外源菌的豬糞易于發(fā)酵。

2.4 飼料發(fā)酵對(duì)厭氧發(fā)酵豬糞酶活的影響

隨著發(fā)酵的進(jìn)行，試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅰ組豬糞中纖維素酶酶活變化趨勢(shì)相似，皆是6天后逐漸降低，然后略微升高再降低；而對(duì)照組則是先升高，維持一定高峰期，然后降低（圖2）。中性蛋白酶酶活的變化（圖3）與纖維素酶相似。試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅰ組豬糞中脲酶皆是逐漸降低，發(fā)酵24天后略有升高。對(duì)照組則是先升高再降低再升高再降低（圖4）。對(duì)照組過氧化氫酶酶活逐漸降低，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組過氧化氫酶酶活第18天前逐漸降低，而后逐漸升高。第6天試驗(yàn)Ⅰ組酶活極顯著高于試驗(yàn)Ⅱ組（P<0.01），顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。第24、30天試驗(yàn)Ⅰ組與試驗(yàn)Ⅱ組無顯著差異（圖5）。結(jié)果表明，飼料發(fā)酵和豬糞中添加外源菌影響厭氧發(fā)酵豬糞中纖維素酶、蛋白酶、脲酶和過氧化氫酶的活性。

2.5 不同處理豬糞中酶的相關(guān)性

試驗(yàn)Ⅰ組和Ⅱ組兩組中纖維素酶、中性蛋白酶、脲酶及過氧化氫酶達(dá)到顯著或極顯著相關(guān)。表明，發(fā)酵飼料豬糞和添加外源菌豬糞在堆肥發(fā)酵過程中兩組酶的變化趨勢(shì)相似。

3 結(jié)論與討論

為了提高豬糞堆肥發(fā)酵的效果，堆肥發(fā)酵前常常添加外源菌。本試驗(yàn)中發(fā)酵飼料的豬糞與添加外源菌的豬糞發(fā)酵過程中酶活變化類似，表明發(fā)酵飼料的豬糞容易堆肥發(fā)酵，發(fā)酵飼料的豬糞在堆積厭氧發(fā)酵時(shí)可以不必再添加外源菌，有機(jī)肥的生產(chǎn)受飼料發(fā)酵影響。

飼料發(fā)酵后，發(fā)酵飼料和發(fā)酵飼料豬糞中的菌群發(fā)生改變，影響后續(xù)的堆肥發(fā)酵。飼料厭氧發(fā)酵后，乳酸菌增加，大腸桿菌降低，飼料中的菌群發(fā)生變化，這與楊學(xué)海等[9]結(jié)果相似?？莶菅挎邨U菌分泌纖維素酶[10]、蛋白酶、淀粉酶[11]等，導(dǎo)致發(fā)酵飼料中纖維素酶、蛋白酶活性升高。植物乳桿菌作為一種乳酸菌，分泌乳酸、降低飼料pH值。枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌共同影響飼料中的菌群。發(fā)酵飼料豬糞中菌群改變的原因可能基于以下幾個(gè)方面，其一，發(fā)酵飼料中枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌的影響。由于枯草芽孢桿菌為兼性厭氧菌，植物乳桿菌為厭氧菌，在腸道厭氧環(huán)境中可以發(fā)揮益生菌的功能，導(dǎo)致腸道菌群改變[12]。其二，發(fā)酵飼料中有機(jī)酸的影響。植物乳桿菌分泌的乳酸以及飼料碳水化合物降解產(chǎn)生的乳酸等酸化劑，可以增加腸道中乳酸菌的數(shù)量，降低大腸桿菌的含量[13]。其三，發(fā)酵飼料中的纖維素酶、蛋白酶等酶制劑的影響。飼料中添加纖維素酶等復(fù)合酶制劑，可以減少糞氮的含量，促進(jìn)豬的消化，可能間接影響腸道或糞便中的菌群[14]。糞便中菌群的變化，導(dǎo)致發(fā)酵飼料的豬糞易于發(fā)酵，這與牛糞、豬糞因糞便菌群不同導(dǎo)致厭氧發(fā)酵效果差異的報(bào)道類似[15]。

本試驗(yàn)堆肥過程中隨溫度的變化，不同種類的酶活發(fā)生了不同變化，這與古潔[16]的報(bào)道相似。酶活變化的原因可能主要與外源枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌有關(guān)。枯草芽孢桿菌能形成芽孢，抗逆性強(qiáng)，耐高溫及酸堿，在飼料發(fā)酵過程中分泌纖維素酶、蛋白酶等酶制劑，經(jīng)過動(dòng)物胃腸道的厭氧環(huán)境，仍然可以在堆肥過程中發(fā)揮作用[17]。盛清凱等[18]在飼料中添加枯草芽孢桿菌后不但降低了豬糞中大腸桿菌的含量，而且降低豬糞體外發(fā)酵液中臭氣的濃度。植物乳桿菌作為一種乳酸菌，最適生長(zhǎng)溫度為30～35℃，不耐高溫，分泌谷胱甘肽過氧化物酶、總超氧化物歧化酶等，具有清除自由基的功能[19]?？莶菅挎邨U菌和植物乳桿菌的擴(kuò)繁，可能導(dǎo)致發(fā)酵初期纖維素酶、蛋白酶、過氧化氫酶等酶活性增加。由于枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌的耐熱性能差異，植物乳桿菌可能在堆肥發(fā)酵初期發(fā)揮作用，枯草芽孢桿菌可能在整個(gè)堆肥發(fā)酵過程中發(fā)揮作用，這與接種菌劑不同、堆肥發(fā)酵效果不同的研究結(jié)果類似[17]。

堆肥過程酶活變化的原因也可能與糞肥腐熟過程中的高溫有關(guān)。酶作為一種蛋白質(zhì)，其活性受環(huán)境溫度影響。不同的酶制劑各有其不同的溫度范圍。纖維素酶作用的適宜溫度一般為26～31℃。發(fā)酵初期糞肥發(fā)酵溫度低，中期發(fā)酵溫度高，后期發(fā)酵溫度降低。試驗(yàn)中期發(fā)酵飼料豬糞發(fā)酵溫度高于對(duì)照組，高溫可能降低了酶活性。徐智等[20]報(bào)道，堆肥過程中纖維素酶、蛋白酶等酶的活性受堆肥溫度顯著影響。酶活性也受環(huán)境pH值影響，不同堆肥發(fā)酵溫度下不同pH值對(duì)酶活的影響有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)為室外堆肥發(fā)酵，發(fā)酵過程中突遇降溫天氣，這可能降低了發(fā)酵第18天時(shí)的堆肥溫度及影響了堆肥腐熟過程中酶的活性。飼料中枯草芽孢桿菌分泌的不同酶制劑分解蛋白質(zhì)、纖維素等產(chǎn)物對(duì)豬糞中鏈球菌、氮磷及pH值等的影響也有待深入研究。

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