火龍果多糖提取純化及單糖組成檢測

秦復(fù)霞

摘 要 目的：使用HPLC方法分析火龍果多糖的單糖組成。方法：采用水提、Sevag脫蛋白及柱色譜層析等方法提取、純化火龍果多糖，之后優(yōu)化多糖TFA酸水解條件。使用高效液相色譜PMP衍生化法測定火龍果多糖單糖組成。結(jié)果：提取到火龍果多糖具有多糖類物質(zhì)紫外-可見光特征吸收。火龍果多糖最佳TFA酸水解條件為TFA濃度2 mol/L、水解溫度120 ℃、水解時(shí)間6 h?；瘕埞嗵侵饕善咸烟?、果糖和阿拉伯糖組成。

關(guān)鍵詞 火龍果；PMP衍生化；單糖組成；液相色譜

中圖分類號：S668.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-890X（2016）15--03

火龍果是仙人掌科（Cactaceae）三角柱屬（Hylocereusundatus Britton et Rose）和蛇鞭柱屬（SeleniereusMeja-lantous Britton et Rose）的果用栽培品種，其外觀猶如鱗片狀因而得名火龍果，又稱青龍果、紅龍果、仙人掌果等，是一種具有很高觀賞性和營養(yǎng)價(jià)值的品種[1-2]?；瘕埞a(chǎn)于中美洲熱帶地區(qū)，后經(jīng)移植至東南亞等國后傳入我國廣東、廣西、臺灣等地區(qū)。因其富含植物性多糖、礦物元素、甾醇及維生素等營養(yǎng)物質(zhì)[3]，具有增強(qiáng)人體機(jī)能、提高免疫力及美容養(yǎng)顏等功效，因此具有廣闊的開發(fā)前景和利用價(jià)值，近年來得到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[4，5]。本文對火龍果中富含的活性物質(zhì)植物多糖進(jìn)行提取、純化，并采用高效液相色譜法鑒定了其單糖組成，為進(jìn)一步加工利用火龍果資源提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

火龍果：購于農(nóng)貿(mào)市場，產(chǎn)地海南。纖維素酶、Sephadex LH-20、單糖對照品（葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖）：上海源葉生物科技有限公司。三氟乙酸、重蒸酚、PMP：北京索萊寶科技有限公司。乙腈為色譜純。甲醇、乙醇、氯仿、正丁醇、濃硫酸、濃鹽酸等為分析純。

DS-I型高速組織搗碎機(jī)；真空冷凍干燥機(jī)；BS-100A自動部分收集器；KQ5200DE型數(shù)控超聲波自動清洗器；759MC紫外可見分光光度計(jì)；DZF-6050型真空干燥箱；SHB-B95循環(huán)水式真空泵；DT5-4B型低速臺式離心機(jī)；0.45μm水相過濾膜；Zorbax SB C18；安捷倫高效液相色譜儀Agilent 1100。

1.2 火龍果多糖的提取、純化及鑒定

本實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助的方法提取火龍果多糖，提取參數(shù)參考熊建文等人的方法[6]并加以改進(jìn)。取新鮮火龍果去皮去籽后于組織斬碎器中充分?jǐn)厮?，之后取適量火龍果果肉漿進(jìn)行熱水回流提取。提取完成后抽濾，將得到的濾液放入真空冷凍干燥機(jī)中干燥，得到火龍果組織粗提物。取粗提物10 g溶于200 mL蒸餾水中并加入0.600 g纖維素酶，在最佳條件下水解1 h滅酶冷卻，之后于65 ℃下超聲提取50 min。結(jié)束后4 500 r/min離心15 min，收集上清液。將上清液按液料比1∶4加入氯仿-正丁醇混合液（4∶1）并充分振搖30 min，充分靜置溶液分層后棄去沉淀，如此反復(fù)3次以除去蛋白質(zhì)。將溶液冷凍干燥得到火龍果粗多糖。

使用凝膠色譜層析純化得到的火龍果粗多糖，填料選用Sephadex LH-20。操作步驟：取100 mg火龍果粗糖充分溶解于10 mL超純水中，使用0.45 μm水相膜過濾后上樣。洗脫液為超純水，流速12 mL/h，每管收集40 min，收集50管。使用苯酚-硫酸法逐管測定490 nm下吸光度，收集洗脫峰并凍干[7]。使用紫外-可見光全光譜掃描法（200～800 nm）鑒定火龍果多糖提取物的性質(zhì)。

1.3 火龍果多糖TFA酸水解條件優(yōu)化

火龍果多糖水解條件正交實(shí)驗(yàn)因素和水平見表1，采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。精確稱取火龍果多糖10.0 mg于具塞試管中，加入2 mL不同濃度的三氟乙酸，氮?dú)庵脫Q后封管于烘箱中恒定溫度下水解一定時(shí)間。結(jié)束后加入4 mL甲醇溶液充分振搖后放入真空烘干箱中烘干，反復(fù)3次以除去三氟乙酸。

表1 火龍果多糖TFA酸水解正交實(shí)驗(yàn)因素與水平表

重復(fù) 酸濃度/（mol/L） 水解溫度/℃ 水解時(shí)間/h

1 1 80 3

2 2 100 6

3 4 120 9

1.4 HPLC-DAD法測定單糖組成

1.4.1 單糖對照品和火龍果多糖水解物衍生化

分別取葡萄糖、果糖對照品各3mg于同一試管中，加入0.3 mol/L NaOH溶液5 mL充分振蕩。取100 μL溶液加入0.5 mol/L PMP甲醇溶液50 μL，放入70 ℃恒溫水浴鍋中加熱30 min后冷卻至室溫，之后添加0.3 mol/L鹽酸100 μL中和。將衍生化后的糖液按1∶1的料液比與水-氯仿（1∶1）混合液混合并充分振蕩離心。棄去氯仿層后再次加入適量氯仿萃取，重復(fù)3次以完全除去PMP，然后使用0.45μm水相濾膜過濾后冷藏備用[8，9]。取火龍果多糖水解殘?jiān)?mg，處理步驟與對照品單糖相同。

1.4.2 色譜條件

色譜柱采用Zorbax SB C18，流動相為乙腈∶水=25∶75，流速1 mL/min，柱溫25 ℃，檢測器波長245 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.4.3 系統(tǒng)適用性參數(shù)

使用衍生化后的單糖對照品進(jìn)行系統(tǒng)精密度測定，進(jìn)樣5次，進(jìn)樣量10μL。結(jié)果顯示，單糖對照品衍生化物峰的保留時(shí)間RSD值均小于0.22%，峰面積的RSD值均小于0.51%，理論塔板數(shù)不低于3 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 火龍果多糖提取、純化及鑒定

火龍果粗多糖柱層析吸光度圖譜見圖1。火龍果粗多糖經(jīng)過Sephadex LH-20葡聚糖凝膠純化后得到一個(gè)吸收峰，收集吸收峰對應(yīng)的試管溶液并進(jìn)行全光譜掃描，掃描結(jié)果見圖2。掃描結(jié)果顯示，吸收圖譜是多糖類物質(zhì)典型的雙曲線型，在250 nm和280 nm處無明顯吸收，說明幾乎不含核酸和蛋白類雜質(zhì)[10]。

2.2 多糖單糖組成測定

分別取衍生化后的混合單糖對照品和火龍果多糖水解液按照1.4.2中色譜條件進(jìn)樣，六種混合單糖對照品PMP衍生化物HPLC圖譜見圖3，火龍果多糖水解液衍生化HPLC色譜圖見圖4。可以看出火龍果多糖由組成葡萄糖、果糖、阿拉伯糖組成。

2.3 火龍果多糖TFA最佳水解條件

以火龍果多糖水解產(chǎn)物洗脫峰面積為指標(biāo)，使用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件中正交設(shè)計(jì)分析工具分析測定指標(biāo)，優(yōu)化火龍果多糖TFA水解條件。優(yōu)化結(jié)果表明，酸濃度、水解時(shí)間、水解溫度3個(gè)因素間具有顯著性差異（P<0.05）。Post Hoc Tests析因分析（α=0.05）表明TFA最佳水解條件為：酸濃度2 mol/L、水解溫度120 ℃、水解時(shí)間6 h。

3 結(jié)論

采用熱水回流提取的方法優(yōu)化了火龍果粗多糖的提取步驟，并通過Sevag法及Sephadex LH-20柱層析純化提取得到的火龍果粗多糖。經(jīng)過紫外-可見光全光譜掃描驗(yàn)證得到的火龍果多糖具有一般多糖的特征吸收曲線。優(yōu)化了TFA法水解火龍果多糖的條件，結(jié)果顯示，10 mg火龍果多糖中加入2 mL濃度為2 mol/L的TFA，在120 ℃下水解6h得到的單糖產(chǎn)率最高。該方法通過反復(fù)加入甲醇以除去TFA，相比其他水解方法提高了后續(xù)步驟中液相分析的分辨率并降低了單糖損失。根據(jù)單糖類物質(zhì)經(jīng)過PMP衍生化后在特定波長處有紫外吸收的特性，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了PMP衍生化法測定火龍果單糖組成的方法，結(jié)果表明火龍果多糖主要由葡萄糖、果糖和阿拉伯糖組成。

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（責(zé)任編輯：劉昀）