長鏈非編碼RNA LINC01133基因表達(dá)與胃癌發(fā)展的相關(guān)性研究

陳圳澤 曾偉超 鄭輝達(dá) 顏長江 許建華

【摘要】 目的：探討LINC01133在胃癌組織中的表達(dá)情況和對體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞表型的影響。方法：采用qPCR檢測各組織細(xì)胞的LINC01133的表達(dá)水平。比較30例胃癌組織及其相應(yīng)癌旁組織LINC01133的表達(dá)。比較正常胃黏膜上皮細(xì)胞（GES-1細(xì)胞）、人胃癌細(xì)胞（MGC-803、BGC-823）中LINC01133的表達(dá)水平。選擇LINC01133低表達(dá)的表達(dá)MGC-803細(xì)胞設(shè)置NC組（MGC-803細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)空質(zhì)粒組）與LINC01133組（MGC-803細(xì)胞轉(zhuǎn)染LINCO1133-pcDNA3.1質(zhì)粒組），比較兩組LINC01133的表達(dá)水平。采用CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測比較兩組細(xì)胞增殖、凋亡、遷移。結(jié)果：胃癌組織中LINC01133的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織（P<0.05）。MGC-803細(xì)胞的LINC01133表達(dá)水平低于GES-1和BGC-823細(xì)胞（P<0.05）。LINC01133組LINC01133表達(dá)水平高于NC組（P<0.05）。LINC01133組細(xì)胞存活與遷移速率均低于NC組，而細(xì)胞凋亡率高于NC組（P<0.05）。結(jié)論：LINC01133在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，LINC01133表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在胃癌發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因的作用，LINC01133低表達(dá)可能是胃癌患者的一個不良因素，有望成為胃癌診斷和治療中新的研究靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】 LINC01133 胃癌 增殖 凋亡

[Abstract] Objective： To investigate the expression of LINC01133 in gastric cancer tissues and its effect on the phenotypic of gastric cancer cells cultured in vitro. Method： The expression level of LINC01133 in each tissue cell was detected by qPCR. The expression of LINC01133 in 30 cases of gastric cancer and its adjacent tissues were compared. MGC-803 cells with low expression of LINC01133 were selected to set up NC group （MGC-803 cells transfected with empty plasmid group） and LINC01133 group （MGC-803 cells transfected with LINCO1133-pcDNA3.1 plasmid group）， and the expression levels of LINC01133 in the two groups were compared. CCK-8， flow cytometry and scratch test were used to compare the proliferation， apoptosis and migration of cells in the two groups. Result： The expression level of LINC01133 in gastric cancer tissues was significantly lower than that in adjacent tissues （P<0.05）. The LINC01133 expression level of MGC-803 cell was lower than those of GES-1 and BGC-823 cells （P<0.05）. The expression level of LINC01133 in LINC01133 group was higher than that in NC group （P<0.05）. The survival and migration rates of LINC01133 cells were lower than those of NC group， while the apoptosis rate was higher than that of NC group （P<0.05）. Conclusion： The expression of LINC01133 is down-regulated in gastric cancer tissues， and the expression of LINC01133 can inhibit the proliferation and migration of gastric cancer cells， promote cell apoptosis， and play a role of tumor suppressor gene in the development of gastric cancer. The low expression of LINC01133 may be an adverse factor in patients with gastric cancer， which is expected to become a new research target in the diagnosis and treatment of gastric cancer.

[Key words] LINC01133 Gastric cancer Growth Apoptosis

First-authors address： The Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University， Quanzhou 362000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.23.004

胃癌已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要原因，尤其在日本、韓國和中國等東亞國家發(fā)病率較高[1-4]。當(dāng)今胃癌患者的生存率已經(jīng)有了很大的提高，但由于胃癌可以向淋巴結(jié)、肝臟、腹腔轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散，其預(yù)后較差，5年生存率低于30%[5]。目前，胃癌的早期治療主要是手術(shù)方式，大多數(shù)胃癌被檢出時已為進(jìn)展期，因此，探索胃癌浸潤、轉(zhuǎn)移機(jī)制具有重要意義。

長鏈非編碼RNA（long non-protein coding RNA，lncRNA）是非蛋白編碼RNA的一種，長度大于200 nt[6]。如今，越來越多的證據(jù)表明lncRNA通過基因水平、轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平來調(diào)節(jié)生物學(xué)過程中多種活動，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[7]。目前已經(jīng)鑒定出許多功能性lncRNA，例如lncRNA MEG3能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖能力，在人宮頸癌組織中MEG3表達(dá)明顯下調(diào)，表明lncRNA MEG3發(fā)揮重要的抑癌基因功能[8]。在肝臟中發(fā)現(xiàn)lncRNA LALR1能夠促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，在肝組織再生過程中發(fā)揮重要作用[9]。lncRNA MVIH在肝腫瘤組織中高表達(dá)，能促進(jìn)血管生成，并帶來更差的預(yù)后[10]。眾多研究發(fā)現(xiàn)lncRNA還可作為潛在的生物標(biāo)志物，有助于腫瘤的輔助診斷和判斷預(yù)后，其在胃癌發(fā)展中的重要作用也被廣泛報道[6]。

在既往研究中，存在LINC01133在膽囊癌、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌及骨肉瘤中表達(dá)的探討[11-15]。檢索GEO（gene expression omnibus）數(shù)據(jù)庫GSE54129，GSE69963、GSE15495、GSE22366數(shù)據(jù)集和TCGA（the cancer genome atlas）數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)LINC01133基因與胃癌的預(yù)后相關(guān)，高表達(dá)LINC01133的胃癌患者總生存時間更長。本課題通過組織和細(xì)胞兩個層次開展對胃癌LINC01133的表達(dá)水平和細(xì)胞表型的研究，揭示LINC01133基因在胃癌發(fā)展的作用，以此來促進(jìn)針對該疾病的lncRNA指導(dǎo)的診斷和治療方法的發(fā)展，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本和細(xì)胞株 胃癌組織標(biāo)本收集于2008-2012年，購自上海芯超生物科技有限公司。包括30例胃癌組織和癌旁組織冰凍樣本的RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA。所有標(biāo)本的使用均征得了上海芯超生物科技有限公司倫理委員會同意。正常胃黏膜上皮細(xì)胞（GES-1細(xì)胞）、人胃癌細(xì)胞（MGC-803、BGC-823）來自福建醫(yī)科大學(xué)干細(xì)胞醫(yī)學(xué)研究所冷凍保存。

1.1.2 主要試劑 完全DMEM培養(yǎng)基、CCK8法細(xì)胞增殖檢測試劑（KGA316）購自芯超生物，HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒（CW2569M）、UltraSYBR Mixture（CW0956M）購自CWBIO 康為世紀(jì)，qPCR試劑盒購自Takara，Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit（AP101-100-kit）、Cell Cycle Staining Kit（CCS102）、質(zhì)粒小提試劑盒（DP103-02）、pcDNA3.1（+）vetor，過表達(dá)空質(zhì)粒、LINCO1133-pcDNA3.1質(zhì)粒購自中洪博元生物。

1.2 方法

1.2.1 qPCR檢測 Trizon法提取胃癌、癌旁組織、GES-1、MGC-803、BGC-823細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，熒光PCR儀檢測LINC01133的表達(dá)水平。相應(yīng)引物：LncRNA01133 F：CTCCCCACCAGAAAGTCCT，LncRNA01133 R：TCCCTATGCCCTCAAACC，GAPDH F：GAAGGTCGGAGTCAACGGAT，GAPDH R：CCTGGAAGATGGTGATGGG。PCR數(shù)據(jù)分析方法使用2-△△Ct法。由此選擇LINC01133低表達(dá)的MGC-803細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 NC組（MGC-803細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)空質(zhì)粒組）與LINC01133組（MGC-803細(xì)胞轉(zhuǎn)染LINCO1133-pcDNA3.1質(zhì)粒組）。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 MGC-803細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱。細(xì)胞密度達(dá)60%時，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。DNA轉(zhuǎn)染（MGC-803細(xì)胞）：EP管2個，即NC組與LINC01133組，每管加125 μL Opti-MEM，NC組加入5 μL lipofectamine 3000，LINC01133組加入2.5 μg質(zhì)粒、5μL P3000，混勻滴到6孔板中，4 h后6孔板中加入血清含量20%的完全培養(yǎng)基1 mL，48 h后進(jìn)行相應(yīng)檢測。

1.2.4 CCK8法 生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期的MGC-803細(xì)胞，每孔按4×103個接種至96孔板中，根據(jù)上述分組進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染和加藥物處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，棄含藥培養(yǎng)基，每孔加10 μL的毒性檢測液CCK8，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀測波長為450 nm的OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值作為最終結(jié)果。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù) 取兩組生長狀態(tài)好的對數(shù)生長期細(xì)胞，每孔按4×103個接種至12孔板中，每組設(shè)置3復(fù)孔，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)上述分組進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染和加藥物處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，PBS洗細(xì)胞兩次，加Annexin V/PI檢測試劑盒，流式檢測儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn) 用marker筆在24孔板背后，用直尺比著孔的正中央，均勻地畫橫線，橫穿過孔。分別加入兩組細(xì)胞，約5×105個，掌握為過夜能鋪滿。第二天用槍頭比著直尺，垂至于背后的橫線劃痕。48 h后再次給每孔的劃痕拍照。根據(jù)劃痕情況確定使用48 h劃痕數(shù)據(jù)與0 h劃痕數(shù)據(jù)求出對應(yīng)的劃痕寬度，進(jìn)而計算出細(xì)胞的遷移速率。遷移速率=遷移距離/遷移時間。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析，計量資料用（x±s），比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織與癌旁組織中LINC01133的表達(dá) 胃癌組織中LINC01133的表達(dá)水平（0.002 8±0.000 6）明顯低于癌旁組織（0.023 2±0.005 1），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

2.2 GES-1、MGC-803、BGC-823細(xì)胞中LINC01133表達(dá)比較 MGC-803細(xì)胞的LINC01133表達(dá)水平（0.000 7±0.000 1）低于GES-1細(xì)胞（1.000 0±0.000 0）和BGC-823細(xì)胞（0.967 6±0.121 9），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖2。

2.3 NC組與LINC01133組中的LINC01133表達(dá)情況比較 LINC01133組LINC01133表達(dá)水平（81 007.072 1±7 801.458 5）高于NC組（1.000 0±0.000 0），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖3。

2.4 NC組與LINC01133組細(xì)胞增殖、凋亡、遷移情況比較 LINC01133組細(xì)胞存活率（81.11±0.82）%低于NC組（95.68±0.92）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖4。NC組凋亡率（24.25±3.69）%低于LINC01133組（90.06±5.16）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖5。LINC01133組遷移速率（1.61±0.16）μm/h低于NC組（2.51±0.11）μm/h，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖6。

3 討論

lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200個核苷酸不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子。lncRNA的作用模式包括（1）與編碼基因上游的啟動子區(qū)結(jié)合;（2）與基因競爭結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子;（3）腳手架結(jié)構(gòu)作用;（4）與蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈;（5）結(jié)合到特定蛋白上，改變該蛋白的活性;（6）作為miRNA的靶分子，或者前體分子[8]。成千上萬的lncRNA包含在癌癥基因組中，表明它們可能是癌癥生物學(xué)的潛在驅(qū)動因素并且可用作臨床生物標(biāo)志物[16]。

許多文獻(xiàn)已經(jīng)報道lncRNA在胃癌組織與非腫瘤組織中表達(dá)差異，下調(diào)和上調(diào)lncRNA基因表達(dá)均影響著疾病過程。Sun等[17]發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼HOXA11-AS在胃癌中特異性上調(diào)，并通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)證明了HOXA11-AS促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，遷移和侵襲并抑制細(xì)胞凋亡。并發(fā)現(xiàn)GAS5在患者胃癌組織中表達(dá)下降，抑制其表達(dá)則能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長[18]。同年發(fā)現(xiàn)MEG3在胃癌和癌旁檢測后，特異性低表達(dá)，敲減MEG3后促進(jìn)細(xì)胞增殖，過表達(dá)后細(xì)胞增殖抑制[19]。

lncRNA作為醫(yī)學(xué)科研領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，本研究結(jié)合當(dāng)今熱點(diǎn)lncRNA和臨床胃癌疾病進(jìn)行分析。在30例胃癌組織及其配對癌旁組織進(jìn)行了差異表達(dá)檢測，發(fā)現(xiàn)較癌旁組織，LINC01133在胃癌組織中呈低表達(dá)，表明胃癌組織中LINC01133表達(dá)缺失，但是相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究表明在膽囊癌和非小細(xì)胞肺癌，癌組織中LINC01133表達(dá)相對癌旁組織上調(diào)，表明了LINC01133的表達(dá)具有組織和器官的特異性，在不同器官腫瘤中特異性表達(dá)[13，20]。結(jié)合數(shù)據(jù)庫的生存分析，高表達(dá)LINC01133的胃癌患者有更高生存率，說明LINC01133與胃癌預(yù)后相關(guān)。LINC01133表達(dá)具有抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和促進(jìn)其凋亡的能力，在明確其表型及臨床樣本的表達(dá)意義后，就需要對其機(jī)制調(diào)控研究進(jìn)行深入挖掘，以明確其作用機(jī)制。

首先，LINC01133具有抑制胃癌細(xì)胞增殖的能力，Wu等[11]研究發(fā)現(xiàn)LINC01133在膽囊癌組織轉(zhuǎn)錄水平顯著高于相應(yīng)的非腫瘤組織，促進(jìn)腫瘤增殖，并激活A(yù)KT-mTOR，mTOR是PI3K-AKT下游的一種重要的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，通過激活核糖體激酶來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和存活，mTOR信號通路可影響基因轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)合成，在細(xì)胞增殖中起重要作用。其次，LINC01133表達(dá)具有抑制胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的能力，Kong等[12]發(fā)現(xiàn)LINC01133在結(jié)直腸癌細(xì)胞中相對癌旁組織低表達(dá)，作為抑癌基因，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，表達(dá)受到TGF-β信號通路抑制。TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控機(jī)制多種多樣，TGF-β信號通路激活具有促癌作用，大多發(fā)生在癌癥晚期，可通過促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移及細(xì)胞免疫逃逸，以及促進(jìn)血管的產(chǎn)生發(fā)揮它的促癌作用，也可通過激活經(jīng)典Smad通路和非經(jīng)典Smad通路，來促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，使得癌細(xì)胞向其他組織擴(kuò)散。LINC01133抑制胃癌細(xì)胞遷移和侵襲作用可能與TGF-β信號通路的激活有關(guān)。

綜上所述，LINC01133在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，LINC01133表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在胃癌發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因的作用，LINC01133低表達(dá)可能是胃癌患者的一個不良因素，有望成為胃癌診斷和治療中新的研究靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2020-01-18） （本文編輯：田婧）