北五味子木脂素對(duì)小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用

王春梅，李 賀，李 生，陳寶芝，吳金瀅，陳建光，高曉旭*

（1.北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.北華大學(xué)林學(xué)院，吉林 吉林 132013）

北五味子木脂素對(duì)小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用

王春梅1，李 賀1，李 生1，陳寶芝1，吳金瀅1，陳建光1，高曉旭2,*

（1.北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.北華大學(xué)林學(xué)院，吉林 吉林 132013）

目的：研究北五味子木脂素（Schisandra chinensis lignans，SCL）對(duì)酒精誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用并初步探討其作用機(jī)制。方法：將50 只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、酒精性肝損傷模型組、SCL低劑量組（25 mg/（kg?d））、SCL高劑量組（50 mg/（kg?d））、陽(yáng)性對(duì)照組（聯(lián)苯雙酯150 mg/（kg?d）），灌胃給藥預(yù)處理15 d。末次給藥1 h，造模組小鼠給予50%乙醇12 mL/kg一次性灌胃，正常對(duì)照組給予同體積蒸餾水。12 h后處死小鼠，檢測(cè)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活性，甘油三酯（triglyceride，TG）水平，肝組織中丙二醛（malondialdehyde，MDA）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量及一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）活性；HE染色觀察肝臟病理學(xué)改變。結(jié)果：SCL可明顯降低酒精致肝損傷小鼠血清ALT和AST活性以及TG水平（P＜0.05），同時(shí)使小鼠肝組織MDA含量和NOS活性顯著下降，GSH含量提高（P＜0.05）；蘇木素-伊紅染色結(jié)果顯示SCL可顯著改善酒精引起的小鼠肝細(xì)胞水腫、壞死，中央靜脈充血等病理?yè)p傷。結(jié)論：SCL對(duì)小鼠酒精性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抗氧化有關(guān)。

北五味子木脂素；肝損傷；酒精；氧化應(yīng)激

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是由于長(zhǎng)期酗酒導(dǎo)致的肝臟疾病，其病程進(jìn)展包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎以及酒精性肝硬化[1]。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人們生活方式的改變，ALD發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì), 成為僅次于病毒肝炎的第二大肝病[2]。雖然對(duì)該病的治療研究和臨床經(jīng)驗(yàn)逐漸增多，但目前除戒酒和支持治療外尚無(wú)理想的防治藥物，因此尋找對(duì)酒精性肝損傷有保護(hù)作用的藥物意義重大。五味子（Schisandra chinensis）系木蘭科植物五味子的成熟果實(shí)，尤其北五味子是著名的長(zhǎng)白山道地藥材，具有益氣生津、補(bǔ)腎養(yǎng)心、收斂固澀等作用[3]。五味子被譽(yù)為“護(hù)肝降酶之王”，作為我國(guó)傳統(tǒng)保肝藥，多與其他中藥配伍用于急、慢性肝損傷的治療，可以促進(jìn)損傷肝細(xì)胞的修復(fù)、降低血清轉(zhuǎn)氨酶活性[4-6]。五味子主要活性成分有木脂素、多糖、萜類等。研究表明五味子木脂素成分對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷有保護(hù)作用[7-9]，藤莖提取物及藤莖總?cè)祁愅ㄟ^(guò)降低血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）水平可有效防治小鼠酒精性肝損傷[10-11]。但對(duì)來(lái)源于北五味子種子的總木脂素成分是否具有保護(hù)酒精性肝損傷的作用，其機(jī)制如何，尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用酒精誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型，從肝臟病理、肝細(xì)胞損傷、肝臟功能及脂質(zhì)過(guò)氧化等方面觀察北五味子木脂素（Schisandra chinensis lignans，SCL）對(duì)肝臟的保護(hù)作用及并探討其作用機(jī)理，以為北五味子開(kāi)發(fā)為防治酒精性肝病的保健食品和藥品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)健康ICR小白鼠，雄性，體質(zhì)量（20±2）g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（吉）：2010-0005。分籠飼養(yǎng)，飼料充足，飲水不限，室溫20～25 ℃，適應(yīng)環(huán)境5 d后使用。

1.2 材料與試劑

北五味子木脂素由北華大學(xué)林學(xué)院食品科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)室優(yōu)選新品種，采用超臨界CO2流體萃取，模仿口服藥物在胃腸道的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，選用特定pH值依次連續(xù)提?。ò敕律ㄌ崛。?；經(jīng)分子蒸餾，其蒸餾溫度110 ℃、進(jìn)料速率65 L/h、真空度0.7 Pa；再通過(guò)AB-8大孔樹(shù)脂處理，總木脂素流量1.52 mg/mL、洗脫速率1 mL/min乙醇體積分?jǐn)?shù)95%、洗脫率78.9%）；采用硅膠柱層析法，200～300 目硅膠，以石油醚-乙酸乙酯（60∶1，V/V）洗脫，得木脂素組分，采用紫外分光光度法，在570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)總木脂素，其純度為93.5%。

聯(lián)苯雙酯滴丸 浙江萬(wàn)邦藥業(yè)有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、甘油三酯（triglyceride，TG）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）及一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）測(cè)定試劑盒，均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器與設(shè)備

Infinite M200TECAN酶標(biāo)儀 瑞士Tecan集團(tuán)公司；JY92-IID超聲波細(xì)胞粉碎儀/粉碎機(jī) 寧波新生生物科技股份有限公司；S10手提式高速分散器 寧波新生生物科技股份有限公司；ESJ110-4B電子分析天平 沈陽(yáng)龍騰電子有限公司。

1.4 動(dòng)物分組與處理

ICR小鼠50 只，雄性，18～22 g，隨機(jī)分為5 組，分別為正常對(duì)照組、酒精性肝損傷模型組、SCL低劑量組、SCL高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照藥（聯(lián)苯雙酯）組。常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。SCL治療組以體質(zhì)量為基礎(chǔ)分別給予SCL 25 mg/（kg?d）和50 mg/（kg?d）灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組給予聯(lián)苯雙酯滴丸150 mg/（kg?d）灌胃，正常對(duì)照組和模型組給予同體積蒸餾水灌胃，每日一次，連續(xù)15 d。末次給藥1 h后，模型組及給藥組小鼠給予50%乙醇12 mL/kg灌胃，正常對(duì)照組小鼠給予同體積蒸餾水灌胃，禁食，不禁水。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

上述小鼠造模12 h后摘眼球取血，每只小鼠約取血0.8～1.0 mL，分離血清，分裝入Eppendorf 管，－70 ℃凍存。斷髓處死小鼠，迅速剖腹取出肝臟，于冷的生理鹽水中洗凈血液，濾紙吸干，剪下肝左葉置于10%中性福爾馬林中固定，待做病理。取肝組織100 mg，加入9 倍量的生理鹽水于冰水浴中制成10%組織勻漿，離心后取上清液置4 ℃保存。按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行ALT、AST、TG、MDA、GSH及NOS的檢測(cè)。

1.6 肝臟病理檢測(cè)

將標(biāo)本置入10%甲醛溶液固定后，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）浸泡過(guò)夜，常規(guī)梯度酒精脫水，石蠟包埋，制成4 m石蠟切片。經(jīng)二甲苯脫蠟及梯度乙醇復(fù)水后，進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，再進(jìn)行梯度乙醇脫水，脫水后將組織切片中的乙醇用二甲苯置換出來(lái)。最后滴加中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察、拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 SCL對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

表1 SCL對(duì)各組小鼠體質(zhì)量的影響（x±s，n=10）Table 1 Effect of SCL on bodyweight in mice (x ± s, n=10)

由表1可知，與正常對(duì)照組相比，各組小鼠體質(zhì)量未見(jiàn)明顯差異。

2.2 SCL對(duì)小鼠血清ALT、AST活性和TG水平的影響

表2 SCL對(duì)各組小鼠血清ALT、AST活力和TG含量的影響(x±s，n=10）Table 2 Effect of SCL on serum ALT and AST activities and TG content in micee (x ±s, n=10)

由表2可知，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清ALT、AST和TG水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），表明小鼠急性肝損傷模型制備成功。與模型組比較，SCL高劑量組及陽(yáng)性藥物聯(lián)苯雙酯組小鼠血清ALT和AST水平均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），SCL高劑量組血清TG水平降低（P＜0.05），提示SCL對(duì)酒精誘導(dǎo)的小鼠肝損傷有保護(hù)作用。聯(lián)苯雙酯降低ALT效果優(yōu)于SCL，但對(duì)升高的TG沒(méi)有影響。

2.3 SCL對(duì)小鼠肝組織MDA、GSH含量及NOS活性的影響

表3 SCL對(duì)各組小鼠肝組織MDA、GSH含量及NOS活力的影響（x±s，n=10）Table 3 Effect of SCL on the levels of MDA and GSH and NOS activity in liver tissues in mice (x ±s,n=10)

MDA、GSH及NOS是反應(yīng)肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化的指標(biāo)。由表3可知，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠肝組織MDA和NOS水平顯著升高，而GSH水平明顯降低（P＜0.01），表明酒精致肝損傷小鼠肝臟抗氧化能力降低，氧化應(yīng)激增加。與模型組比較，SCL低劑量、高劑量和聯(lián)苯雙酯均可顯著降低肝組織MDA含量（P＜0.05或P＜0.01），升高GSH水平（P＜0.05或P＜0.01），SCL高劑量可降低NOS活性（P＜0.01），提示小鼠肝臟的氧化應(yīng)激狀況得以改善。

2.4 SCL對(duì)小鼠肝臟病理形態(tài)的影響

圖1 SCL對(duì)小鼠肝臟病理形態(tài)的影響（HE染色，×100）Fig.1 Effect of SCL on liver pathomorphology in mice (HE staining, × 100)

由圖1可知，正常對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞條索排列規(guī)則，肝中央V及匯管區(qū)結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，肝細(xì)胞形態(tài)圓形，核位于中央，胞漿分染，形態(tài)正常（圖1A）。模型組肝細(xì)胞水腫，可見(jiàn)肝細(xì)胞局部壞死，表現(xiàn)為胞漿染色變混，中央V擴(kuò)張充血，病變以中央V周圍為主，小葉結(jié)構(gòu)完整（圖1B）。SCL低劑量組和高劑量組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞形態(tài)基本正常（圖1C、1D）。陽(yáng)性對(duì)照組肝細(xì)胞形態(tài)基本恢復(fù)正常（圖1E）。

3 討 論

采用酒精灌胃法建立小鼠急性肝損傷模型，周期短、易復(fù)制、死亡率低、穩(wěn)定性好，且符合人類飲酒所致肝損傷的特點(diǎn)[12]。因此本研究采用50%乙醇12 mL/kg一次性灌胃建立小鼠急性肝損傷模型，結(jié)果顯示模型組小鼠血清ALT和AST水平均顯著升高，病理結(jié)果也顯示肝細(xì)胞水腫、小葉中央靜脈充血等改變，提示造模成功。而給予北五味子木脂素治療后，小鼠血清ALT和AST出現(xiàn)了不同程度的降低，肝細(xì)胞水腫及中央靜脈充血減輕，說(shuō)明北五味子木脂素對(duì)酒精所致的小鼠急性肝損傷具有一定的保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激一直被認(rèn)為是酒精性肝病的重要致病因素[13-14]。乙醇進(jìn)入機(jī)體后首先經(jīng)肝細(xì)胞中的乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）代謝為乙醛，再經(jīng)乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）代謝為乙酸。乙醇在代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的還原型輔酶I（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH），引起NADH/NAD+比例升高、增加了呼吸鏈中傳遞的電子流，導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species，ROS）過(guò)度產(chǎn)生。此外，酒精還對(duì)多種抗氧化物酶和非抗氧化物造成損傷，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，促進(jìn)酒精性肝病的發(fā)生、發(fā)展。同時(shí)酒精也可激活細(xì)胞色素P450，使反應(yīng)性氧中間產(chǎn)物和脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物形成增多，從而介導(dǎo)自由基脂質(zhì)過(guò)氧化引起肝臟損傷，并使體內(nèi)還原型GSH耗竭[15-18]。MDA是反映組織損傷時(shí)出現(xiàn)的過(guò)強(qiáng)氧化作用的指標(biāo)之一，組織中含量越高，氧化活性越強(qiáng)，組織受損程度越大[19]。NOS是機(jī)體合成一氧化氮（nitric oxide，NO）的關(guān)鍵酶，當(dāng)NO及活性氧水平均較高時(shí)，二者可發(fā)生氧化反應(yīng)，生成細(xì)胞毒性很強(qiáng)的過(guò)氧亞硝基陰離子，發(fā)揮自由基對(duì)肝細(xì)胞的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的毒性，引起嚴(yán)重的肝損傷[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組小鼠肝組織MDA和NOS明顯升高，而GSH水平下降，表明在灌酒后小鼠氧化應(yīng)激因子迅速發(fā)生了改變，引起了肝細(xì)胞損傷。北五味子木脂素治療顯著降低了肝組織MDA和NOS水平，并升高GSH水平，對(duì)抗自由基脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，阻止肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化，維持細(xì)胞質(zhì)膜的正常結(jié)構(gòu)，保護(hù)肝細(xì)胞免受損傷。

機(jī)體攝入大量乙醇后，會(huì)使三羧循環(huán)障礙和脂肪酸氧化減弱而影響脂肪代謝，乙醇可致α-磷酸甘油增多而促進(jìn)甘油三酯合成，致使脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)沉積。肝臟中蓄積的大量TG以極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）的形式運(yùn)出肝臟，進(jìn)入血液，使血中TG含量也相應(yīng)增加[1]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明模型組小鼠血清TG水平明顯升高，北五味子木脂素治療可降低血中TG水平，改善肝臟的脂肪代謝。

綜上所述，北五味子木脂素對(duì)酒精誘導(dǎo)的急性肝損傷具有顯著的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抗自由基脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)有關(guān)。這些結(jié)果為將北五味子開(kāi)發(fā)為對(duì)肝損傷有保護(hù)作用的保健食品和藥品提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] ORMAN E S, ODENA G, BATALLER R. Alcoholic liver disease: pathogenesis, management, and novel targets for therapy[J]. Journal Gastroenterology and Hepatology 2013, 28(1): 77-84.

[2] TILG H, DAY C P. Management strategies in alcoholic liver disease[J]. Nature Clinical Practice Gastroenterology & Hepatology, 2007, 4(1): 24-34.

[3] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典[M]. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2010: 61-62.

[4] 王駱冰, 閆秀川, 曾貞, 等. 扶正化瘀片與黃芪湯合用對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝硬化大鼠的治療作用[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2010, 35(13): 1740-1744.

[5] 趙輝平, 李峰, 王勝春, 等. 柴胡、丹參和五味子配伍對(duì)CCl4所致肝硬化大鼠的作用及其機(jī)制[J]. 胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志, 2005, 14(6): 610-614.

[6] 陳瑋瑩, 溫博貴, 鄭瑞明, 等. 五味子對(duì)CCl4中毒大鼠肝細(xì)胞核基質(zhì)蛋白和結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用[J]. 免疫學(xué)雜志, 2006, 22(4): 455-459.

[7] XIE Y, HAO H, KANG A, et al. Integral pharmacokinetics of multiple lignan components in normal, CCl4-induced hepatic injury and hepatoprotective agents pretreated rats and correlations with hepatic injury biomarkers[J]. Journal Ethnopharmacology, 2010, 131(2): 290-299.

[8] KO K M, IP S P, POON M K, et al. Effect of a lignan-enriched fructus schisandrae extract on hepatic glutathione status in rats: protection against carbon tetrachloride toxicity[J]. Planta Medica, 1995, 61(2): 134-137.

[9] HWANG I S, KIM J E, LEE Y J, et al. Protective effects of gomisin A isolated from Schisandra chinensis against CCl4-induced hepatic and renal injury[J]. International Journal of Molecular Medicine, 2013, 31(4): 8884-898.

[10] 胡彥武. 五味子藤莖對(duì)小鼠酒精性肝損傷血清轉(zhuǎn)氨酶的影響[J].食品與藥品, 2008, 10(11): 53-54.

[11] 孟先軍, 鄧靜, 朱力杰, 等. 北五味子藤莖總?cè)茖?duì)小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(15): 228-231.

[12] 齊慧慧, 宋佳, 陳岳祥. 小鼠急性酒精性肝損傷模型的建立[J]. 世界華人消化雜志, 2012, 20(9): 759-763.

[13] SID B, VERRAX J, CALDEROL P B. Role of oxidative stress in the pathogenesis of alcohol-induced liver disease[J]. Free Radical Research, 2013, 47(11): 894-904.

[14] MIRANDA-MENDEZ A, LUQO-BARUQUI A, ARMENDARIZBORUNDA J. Molecular basis and current treatment for alcoholic liver disease[J]. International Journal of Environmental Research and Public Health, 2010, 7(5): 1872-1888.

[15] DAY C P. Treatment of alcoholic liver disease[J]. Liver Transplant, 2007, 13(11): 69-75.

[16] WU D, CEDERBAUM A I. Alcohol, oxidative stress, and free radical damage[J]. Alcohol Research & Health, 2003, 27(4): 277-284.

[17] DEY A, CEDERBAUM A I. Alcohol and oxidative liver injury[J]. Hepatology, 2006, 43(2): 63-74.

[18] CEDERBAUM A I, LU Y, WU D. Role of oxidative stress in alcoholinduced liver injury[J]. Archives Toxicology, 2009, 83(6): 519-548.

[19] NAIK S R. Antioxidants and their role in biological functions: an overview[J]. Indian Drugs, 2003, 40: 501-516.

[20] MININ E A, BUCHWALOW I B, WELLNER M, et al. L-Arginine-NO-cGMP signaling following acute liver injury in the rat[J]. Experimental and Toxicologic Pathology, 2005, 57(2): 161-171.

Protective Effect of Lignans from the Fruits of Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. on Ethanol-Induced Acute Liver Injury in Mice

WANG Chun-mei1, LI He1, LI Sheng1, CHEN Bao-zhi1, WU Jin-ying1, CHEN Jian-guang1, GAO Xiao-xu2,*
(1. School of Pharmacy, Beihua University, Jilin 132013, China; 2. School of Forestry, Beihua University, Jilin 132013, China)

Objective: This study aimed to explore the protective effect of lignans from the fruits of Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. (SCL) on acute liver injury induced by ethanol in mice and to reveal the underlying mechanism. Methods: A total of 50 mice were randomly divided into normal control, model, low-dose SCL (25 mg/(kg·d)), high-dose SCL (50 mg/(kg·d)) and positive control (bifendate, 150 mg/(kg·d)) groups. The mice were intragastrically administered with corresponding drugs, respectively, for 15 days. Then 50% ethanol (12.0 mL/kg) was given to the mice in model groups 1 hour after the last administration. The mice in the normal control group were administered with an equal volume of distilled water. All the mice were sacrificed 12 hours later, and their blood samples were collected. The activities of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) and triglyceride (TG) level in serum as well as the contents of malondialdehyde (MDA) and reduced glutathione (GSH) and nitric oxide synthase (NOS) activity in liver tissues were measured. Hematoxylin and Eosin (HE) staining was performed for observing pathological changes of the liver tissues. Results: SCL significantly decreased the activities of ALT and AST and TG levels in serum (P ＜ 0.05). Meanwhile, the MDA content and NOS activity in liver tissues were reduced significantly whereas the GSH content was significantly increased by SCL (P ＜ 0.05). Moreover, HE staining showed that SCL significantly improved the liver cell edema, necrosis, and central venous congestion. Conclusions: SCL confer a significant protective effect on alcohol-induced acute liver injury in mice, which might be attributed to their anti-oxidant capacity.

Schisandra chinensis lignans; liver injury; alcohol; oxidative stress

R285.5

A

1002-6630（2014）13-0262-04

10.7506/spkx1002-6630-201413052

2013-09-22

吉林省科技廳重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（吉科合字 [2012]0904號(hào)）；吉林省衛(wèi)生廳科研課題（201262502）

王春梅（1974—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)閮?nèi)分泌藥理學(xué)。E-mail：wangcm74@126.com

*通信作者：高曉旭（1967—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)橹参锘钚猿煞?。E-mail：gaoziyang4685@163.com