黃瓜NRT2基因的鑒定和特征分析

孫建磊 董玉梅 王崇 肖守 李利斌 焦自高

摘要：本研究利用生物信息學(xué)方法，從黃瓜基因組中鑒定出3個NRT2基因，并對這些基因的基因組分布、結(jié)構(gòu)、遺傳進(jìn)化和順式元件進(jìn)行了系統(tǒng)分析。結(jié)果顯示，黃瓜的NRT2基因分別位于1號、1號和5號染色體，具有2個或3個外顯子，分別與擬南芥的NRT2.4或者NRT2.5直系同源；它們都具有數(shù)個植物激素和逆境應(yīng)答元件，暗示它們不僅在氮素吸收過程中具有一定功能，而且與植物逆境應(yīng)答有關(guān)。該結(jié)果為進(jìn)一步研究黃瓜NRT2的功能提供了線索。

關(guān)鍵詞：黃瓜；硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NRT2； 分子特征；系統(tǒng)進(jìn)化；順式元件

中圖分類號：S642.201文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2016）06-0011-04

氮素是植物必需的大量元素之一，對作物生長起著非常重要的作用，它是植物體蛋白質(zhì)、核酸、葉綠素的組成部分。施用氮肥不僅能提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量，還能提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量[1]。硝態(tài)氮是植物利用土壤中氮素的主要形態(tài)。植物對硝態(tài)氮的吸收主要通過硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行[2，3]。植物硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要分為低親和性和高親和性兩種[4，5]。在模式植物擬南芥中，NO-3的轉(zhuǎn)運(yùn)是通過硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NRT1、NRT2和NRT3調(diào)控的[6～8]。NRT1家族為低親和性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，NRT2為高親和性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，而NRT3不具有轉(zhuǎn)運(yùn)功能，主要是通過調(diào)控NRT2基因來發(fā)揮作用[9]。它們在氮素吸收轉(zhuǎn)運(yùn)、根系發(fā)育、生物和非生物逆境應(yīng)答過程中具有重要功能[10～16]。

黃瓜是我國主要設(shè)施栽培蔬菜之一，在蔬菜生產(chǎn)中具有重要地位。研究黃瓜氮素吸收機(jī)理，有助于合理施肥，提高黃瓜氮肥利用效率，減少環(huán)境污染。目前，有關(guān)黃瓜氮素吸收的研究已有報道，姚娟等報道了亞適溫對4個黃瓜NRT基因和1個AMT基因表達(dá)的影響[17]；趙春波等研究了北方地區(qū)不同黃瓜品種氮素吸收與利用效率的差異[18]；Migocka等研究了黃瓜NRT1家族的組織表達(dá)特異性及與擬南芥、水稻等NRT1基因在結(jié)構(gòu)和數(shù)量上的差異[19]；Nikolic等研究認(rèn)為黃瓜葉片中硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)運(yùn)與細(xì)胞膜上ATPase的活性和數(shù)量有關(guān)[20]；Li等研究了黃瓜硝酸還原酶在缺氮條件下的分子特征[21]；秦智偉等克隆了黃瓜的NRT1.5基因，并對其表達(dá)進(jìn)行了分析[22]。但是有關(guān)黃瓜NRT2的研究較少，本研究利用生物信息學(xué)方法鑒定出3個黃瓜NRT2基因，并對其分子結(jié)構(gòu)特征、遺傳進(jìn)化和順式調(diào)控元件進(jìn)行了系統(tǒng)分析，為將來研究黃瓜NRT2基因的功能提供線索。

1材料與方法

用已鑒定的擬南芥NRT2基因序列搜索黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫（http：//cucumber.genomics.Org.cn/page /cucumber/blast.jsp）和NCBI數(shù)據(jù)庫，尋找黃瓜新的NRT2基因。利用BLASTP在擬南芥數(shù)據(jù)庫TAIR中進(jìn)行序列比對，確定黃瓜NRT2基因與擬南芥NRT2基因的關(guān)系。利用Motif Scan（http：//myhits.isb-sib.ch /cgi-bin/motif_scan） 對黃瓜NRT2基因編碼的蛋白進(jìn)行保守基序和結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，并根據(jù)編碼區(qū)序列信息對其進(jìn)行染色體定位。利用Mega 4.1對黃瓜NRT2基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。通過NRT2編碼區(qū)和基因組序列比對來顯示基因外顯子和內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)組成，得到各個NRT2基因起始密碼子ATG上游1 500 bp的啟動子區(qū)及上游序列。順式元件預(yù)測采用PlantCARE軟件（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcareplantcare/html/）進(jìn)行在線分析。亞細(xì)胞定位預(yù)測在WoLFPSORT （http：//wolfpsort.org/） 中進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2.1黃瓜NRT2的鑒定和分子特征

通過對黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫和NCBI數(shù)據(jù)庫黃瓜基因的挖掘和分析，筆者鑒定出3個黃瓜NRT2基因Csa017175、Csa017221和 Csa000871（表1）。這3個基因分別位于黃瓜的1號、1號和5號染色體上?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明，它們含有2個或者3個外顯子，亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示它們均定位于細(xì)胞膜上（圖1）。

2.2黃瓜NRT2基因的遺傳進(jìn)化和編碼蛋白的基序分析

通過對黃瓜NRT2基因遺傳進(jìn)化分析和不同物種間同源序列比對顯示，Csa000871與擬南芥的NRT2.5直系同源，Csa017221和Csa017175與擬南芥的NRT2.4直系同源（圖2）。而且，Csa017221和Csa017175緊密連鎖，編碼區(qū)大小和結(jié)構(gòu)一致，二者序列一致性極高，達(dá)99.62%，編碼蛋白的序列一致性高達(dá)99.25%。它們的蛋白基序除了一個酰胺化位點(diǎn)的差異外，其余基序的類型和數(shù)目相同（表2）。Csa000871編碼的蛋白與上述兩個蛋白在基序類型上相似，但在基序數(shù)量上有所不同，根據(jù)結(jié)構(gòu)決定功能的生物學(xué)特性，推測黃瓜的3個NRT2基因在功能上存在一定差異。

2.3黃瓜NRT2的順式元件及功能預(yù)測

通過對順式調(diào)控元件的分析得出，黃瓜NRT2基因的上游序列中存在多個逆境和激素應(yīng)答順式調(diào)控元件，且各不相同（表3）。在Csa017175上游序列中分別存在1個ABA 應(yīng)答元件ABRE、乙烯應(yīng)答元件ERE、赤霉素應(yīng)答元件TATC-box、水楊酸應(yīng)答元件TCA-element；Csa017221分別存在1個病原物應(yīng)答元件Box-W1、茉莉酸甲酯應(yīng)答元件CGTCA-motif、赤霉素應(yīng)答元件GARE-motif、防衛(wèi)應(yīng)答元件W-box，還分別有2個熱脅迫應(yīng)答元件HSE、2個水楊酸應(yīng)答元件TCA-element以及3個逆境和防衛(wèi)響應(yīng)元件TC-rich repeats；Csa000871分別有1個赤霉素應(yīng)答元件TATC-box、1個逆境和防衛(wèi)響應(yīng)元件TC-rich repeats、2個病原物應(yīng)答元件Box-W1、2個防衛(wèi)應(yīng)答元件W-box、4個水楊酸應(yīng)答元件TCA-element。雖然，Csa017175和 Csa017221在核酸和編碼蛋白的序列一致性上高達(dá)99%，但它們的順式調(diào)控元件差異較大，暗示它們在功能上存在分化。根據(jù)順式調(diào)控元件分析和進(jìn)化分析的結(jié)果，推測Csa000871在氮素吸收以及再分配及生物逆境脅迫應(yīng)答中具有一定功能，而Csa017175和Csa017221對缺氮條件下植物根和地上部氮素的吸收具有雙重功能。此外，Csa017175還參與ABA、乙烯和水楊酸及赤霉素信號應(yīng)答，而Csa017221在病原物脅迫和防衛(wèi)應(yīng)答、熱脅迫、赤霉素、水楊酸及茉莉酸甲酯信號應(yīng)答中具有一定功能。其實(shí)際功能需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

3結(jié)論

本研究通過對鑒定出的3個黃瓜NRT2基因的系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)它們分別位于1號、1號和5號染色體上，具有2個或者3個外顯子，分別與擬南芥的NRT2.4或者NRT2.5直系同源。黃瓜3個NRT2編碼的蛋白除了Csa017221含有一個酰胺化位點(diǎn)外，其它基序類型都相同，但在數(shù)目上有差異。Csa017221 和Csa017175在結(jié)構(gòu)上相似，序列上幾乎一致，但它們上游順式調(diào)控元件差異較大，說明它們的表達(dá)調(diào)控有所不同。黃瓜的NRT2基因都具有數(shù)個植物激素和逆境應(yīng)答元件，暗示它們不僅在氮素吸收過程中具有一定功能，而且與植物逆境應(yīng)答有關(guān)。本研究為進(jìn)一步探明黃瓜NRT2的功能提供了線索。

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