α—淀粉酶對(duì)類黃酮抗氧化活性的影響

陳磊　蘇煥斌　韓振亞　羅永潮　邱國(guó)棟

類黃酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其取代基的位置基本決定了它們的抗氧化效果。目前廣泛認(rèn)為，B環(huán)是類黃酮抗氧化能力、清除自由基的重要活性部位，一般情況下，B環(huán)上羥基基團(tuán)越多，其生物活性就越強(qiáng)。而羥基基團(tuán)的糖苷化和2、3位雙鍵氫化都容易引起類黃酮生物活性的降低。

該文通過(guò)采用氧自由基清除能力（oxygen radicalabsorbance capacity，ORAC）評(píng)價(jià)法、DDPH自由基清除法、抗亞油酸氧化法、還原能力法四種不同的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法，旨在測(cè)定類黃酮在加入PPA溶液前后，類黃酮抗氧化能力的變化情況。

材料與儀器

PPA購(gòu)自于Sigma公司；類黃酮（木犀草素、香葉木素、柚皮素、二氫楊梅素、山奈酚、槲皮素）購(gòu)自陜西慧科植物開(kāi)發(fā)有限公司，純度達(dá)98%；熒光素鈉，維生素E水溶性類似物Trolox，2，2-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2，2-Azobis（2-methylp ropionamidine）dihyd rochIo ride，AAPH），1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl，DDPH），亞油酸均購(gòu)自于Sigma公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，所有溶液均用等離子水配制，并用0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffer saline，PBS）以保持pH6.8±0.02的生理?xiàng)l件。

全波長(zhǎng)掃描式多功能酶標(biāo)儀，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)數(shù)顯，恒溫水浴鍋，pH值精度計(jì)，超聲細(xì)胞粉碎器，數(shù)控超聲波清洗器

試驗(yàn)方法

PPA對(duì)類黃酮ORAC體系抗氧化能力的影響。稱取1mg類黃酮（木犀草素、香葉木素、柚皮素、二氫楊梅素、山奈酚、槲皮素）溶于2mL二甲基亞砜，得到0.5mg/mL的類黃酮儲(chǔ)備液。取10μL類黃酮儲(chǔ)備液與9901JLPPA液（溶于pH7.4的PBS緩沖液，0.328U/mL）、990mLpH7.4的PBS緩沖液，混勻于37℃反應(yīng)30min，分別得到1mL兩組樣液并加以標(biāo)記為樣液1和樣液2。同時(shí)，將類黃酮儲(chǔ)備液換成等體積的二甲基亞砜作同樣處理，作為對(duì)照以排除二甲基亞砜對(duì)整個(gè)試驗(yàn)結(jié)果的影響。

在96微孔平板中依次加入20μL上述兩種樣液、對(duì)照液和五種不同濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液，板的邊緣孔均加入等體積的pH7.4的PBS緩沖液；然后每孔加入200pL的已配置好的熒光素鈉鹽溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用），再運(yùn)用Wallace1420Manager軟件設(shè)定測(cè)定程序，自動(dòng)混勻，在37℃條件下預(yù)熱20min；待96孔平板出機(jī)后，迅速加入20μLAAPH（現(xiàn)配現(xiàn)用），自動(dòng)混勻，儀器開(kāi)始自動(dòng)測(cè)定。在激發(fā)波長(zhǎng)485nm，吸收波長(zhǎng)535nm條件下，每隔2min記錄一次熒光強(qiáng)度值，每次紀(jì)錄前自動(dòng)震蕩混勻8s，共測(cè)定60個(gè)循環(huán)，熒光強(qiáng)度分別記錄為f1，f2，f3，……，f60；利用相應(yīng)軟件計(jì)算AUC值，再計(jì)算ORAC值。則PPA對(duì)類黃酮ORAC體系抗氧化能力的抑制率算術(shù)公式如下：

PPA對(duì)類黃酮清除DDPH自由基的影響。準(zhǔn)確稱取20mgDDPH粉末，用無(wú)水乙醇溶解并定容至250mL，得到摩爾濃度為2×10^-4mol兒的DDPH乙醇混合液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

將類黃酮（木犀草素、香葉木素、柚皮素、二氫楊梅素、山奈酚、槲皮素）溶于無(wú)水乙醇，得到20，40，60，80，100μg/mL不同濃度的類黃酮溶液。取50HL上述不同濃度的類黃酮溶液與0.2mLPPA液（溶于pH6.8的PBS緩沖液，0.328U/mL）混合并于37℃水浴30min，再加入3mL的2×10^-4mol/L的DDPH乙醇混合液，混勻后，在黑暗處室溫條件下靜置30min。用無(wú)水乙醇作為參比液，在517nm處測(cè)定樣品的吸光值。對(duì)照組為將PPA液換成等量的PBS緩沖液；空白組為將黃酮液換成等量的無(wú)水乙醇，平行測(cè)定三次。則通過(guò)擬合曲線可得類黃酮加入PPA溶解液前后的半抑制濃度UC50值，以及PPA對(duì)黃酮抗亞油酸氧化的抑制率的算術(shù)公式如下：

PPA對(duì)類黃酮抗亞油酸氧化的影響。稱取亞油酸0.6g，吐溫-20 0.5g溶于150mL pH 6.8 0.2mol兒的PBS緩沖液中，在超聲細(xì)胞粉碎器下工作20min，得到均一體系的混合液。

將0.2mL0.1mg/mL的黃酮液（溶于二甲基亞砜），不同酶活力的PPA液先混合37℃水浴30min，再加入上述混合液2.5mL，5mL20mMAAPH反應(yīng)液混合均勻于反應(yīng)器中恒溫水浴70min。

取出上述反應(yīng)液0.1mL于具塞試管中，加入4.7mL乙醇（75%），0.1mL硫氰酸銨（30%）和0.1mLFeCl₂（20mM，溶于3.5%HCl中）混勻，在500nm處測(cè)得吸光度值A(chǔ)500（以75%乙醇作參比液）。對(duì)照組為將PPA液換成等量的PBS緩沖液；空白組為將黃酮液換成等量的二甲基亞砜液，平行測(cè)定三次。則PPA對(duì)黃酮抗亞油酸氧化的抑制率的算術(shù)公式如下：

PPA對(duì)類黃酮還原能力的影響。將0.05mg/mL100μL黃酮液（溶于二甲基亞砜）與不同酶活力的PPA液混合于37℃恒溫水浴鍋內(nèi)水浴30min，依次加入2.5mL0.2mol/L的PBS緩沖液和2.5mL已配置好質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的K₃Fe（CN）₆，再置于50℃水浴鍋內(nèi)保溫20min后，快速冷卻，加入2.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸溶液，以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，取離心后的上清液2.5mL，依次加入4mL蒸餾水，1mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%三氯化鐵溶液，充分混勻，靜置10min后，在700nm下測(cè)定其吸光度A700（以蒸餾水為參比液）。對(duì)照組為將PPA液換成等量的PBS緩沖液；空白組為將黃酮液換成等量的二甲基亞砜液，平行測(cè)定三次。則PPA對(duì)黃酮還原力的抑制率I的算術(shù)公式如下：

結(jié)果與分析

PPA對(duì)類黃酮ORAC體系抗氧化能力的影響。ORAC評(píng)價(jià)方法是依據(jù)氧自由基（AAPH）破壞熒光探針，促使熒光強(qiáng)度發(fā)生一定程度的變化，同時(shí)以維生素E水溶性類似物Trolox作為定量標(biāo)準(zhǔn)，采用多功能熒光微孔板掃描分析儀加以檢測(cè)分析。熒光強(qiáng)度的比那話大小反映了自由基破壞的程度。當(dāng)抗氧化劑存在時(shí)，抗氧化劑可以抑制自由基破壞熒光探針，延緩其熒光強(qiáng)度的衰減速度，通過(guò)分析計(jì)算得出的ORAC值反映了抗氧化劑對(duì)自由基的抗氧化能力。

從圖1中可以看出，PPA對(duì)類黃酮ORAC抗氧化體系的抑制作用不太明顯，其中對(duì)木犀草素的抑制作用最大，其抑制率也只有19.88%，對(duì)槲皮素的抑制作用最小，其抑制率僅為3.56%。PPA對(duì)六種類黃酮ORAC抗氧化體系的抑制作用大小順序?yàn)槟鞠菟?香葉木素>柚皮素>二氫楊梅素>山奈酚>槲皮素。這種結(jié)果可能表明PPA與類黃酮相互作用的結(jié)合位點(diǎn)不在類黃酮清除自由基能力的活性部位（酚羥基），也間接說(shuō)明了氫鍵對(duì)PPA和類黃酮發(fā)生相互結(jié)合作用的貢獻(xiàn)不大，但與兩者間的結(jié)合強(qiáng)度存在一定的聯(lián)系。

PPA對(duì)類黃酮清除DDPH自由基的影響。DDPH自由基溶于乙醇溶液后，在可見(jiàn)光范圍內(nèi)517nm處有強(qiáng)吸收，呈深紫色，當(dāng)加入自由基清除劑（抗氧化劑）后，其與DDPH自由基中的單電子配對(duì)從而使DDPH自由基在517nm處的強(qiáng)吸收逐漸消失，吸光值與DDPH自由基接受的電子數(shù)量呈一定的定量關(guān)系。

如表1所示，PPA對(duì)六種類黃酮清除DDPH自由基的能力均具有一定程度的抑制作用，但抑制作用程度不大。其中PPA對(duì)木犀草素清除DDPH自由基能力的抑制作用最大，也僅為18.91%。同時(shí)，測(cè)定類黃酮與PPA反應(yīng)前后清除DDPH自由基活性的半數(shù)抑制濃度（IC50），結(jié)果顯示類黃酮與PPA反應(yīng)后的IC50值明顯增加。PPA對(duì)類黃酮清除DDPH自由基活力的抑制作用強(qiáng)弱順序?yàn)椋耗鞠菟?香葉木素>柚皮素>二氫楊梅素>山奈酚>槲皮素。此外，通過(guò)測(cè)定類黃酮清除DDPH自由基在加入PPA前后的半抑制濃度IC50值，其結(jié)果反映了這六種類黃酮清除DDPH自由基的能力強(qiáng)弱，同時(shí)也表現(xiàn)了PPA較小程度地削弱了類黃酮清除DDPH自由基的能力。

PPA對(duì)類黃酮抗亞油酸氧化的影響。圖2所示PPA對(duì)類黃酮抗亞油酸氧化能力的影響，隨著PPA濃度的增大，其對(duì)類黃酮抗亞油酸氧化的抑制作用就隨之增強(qiáng)。PPA（0.082U）對(duì)木犀草素抗亞油酸氧化的抑制作用最強(qiáng)，達(dá)到44.21%；PPA對(duì)槲皮素抗亞油酸氧化活性的抑制作用最弱，僅為17.56%。PPA對(duì)六種類黃酮抗亞油酸氧化的抑制作用強(qiáng)度大小順序?yàn)槟鞠菟?香葉木素>柚皮素>二氫楊梅素>山奈酚>槲皮素。這種結(jié)果表明，PPA與類黃酮發(fā)生相互結(jié)合作用后，在亞油酸乳化體系中，PPA的長(zhǎng)分子鏈可能更緊密地包裹和纏繞類黃酮的活性基團(tuán)，促使PPA與類黃酮的結(jié)合位點(diǎn)及強(qiáng)度發(fā)生變化，從而導(dǎo)致PPA對(duì)類黃酮抗亞油酸氧化的抑制作用增強(qiáng)，具體作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。這也說(shuō)明PPA與類黃酮相互作用的強(qiáng)弱程度，不僅與兩者的化學(xué)構(gòu)造有關(guān)，亦與兩者混合后所形成的復(fù)合物所處的微環(huán)境息息相關(guān)。

PPA對(duì)類黃酮還原能力的影響?？寡趸瘎慄S酮）給出自身電子而具有還原作用，還原能力越強(qiáng)，抗氧化活性越強(qiáng)。試驗(yàn)中的抗氧化劑可使鐵氰化鉀中的三價(jià)鐵還原成二價(jià)鐵，而還原生成的二價(jià)鐵（亞鐵氰化鉀）通過(guò)與三氯化鐵發(fā)生進(jìn)一步反應(yīng)生成普魯士藍(lán)，其在700nm處有一強(qiáng)吸收，其吸光值越大，還原能力就越強(qiáng)。

由圖3可知，隨著PPA濃度的增加，其對(duì)類黃酮還原能力的抑制作用也隨之增強(qiáng)，但增加幅度不大。PPA（0.082U）對(duì)木犀草素還原能力的抑制作用最大，為17.04%；PPA對(duì)槲皮素還原能力的抑制作用最小，僅為6.75%。PPA對(duì)六種類黃酮還原能力的抑制作用強(qiáng)度大小順序?yàn)槟鞠菟?香葉木素>柚皮素>二氫楊梅素>山奈酚>槲皮素。

結(jié)論

采用ORAC抗氧化體系評(píng)價(jià)法、DDPH自由基清除法、抗亞油酸氧化法、還原能力法這四種不同的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法，評(píng)價(jià)了六種類黃酮在與PPA反應(yīng)前后其抗氧化活性的變化情況。PPA對(duì)類黃酮ORAC抗氧化體系、清除DDPH自由基以及還原能力的抑制作用均不明顯，最大抑制率分別為19.88%、18.91%、17.04%但在脂質(zhì)體系內(nèi)，PPA對(duì)類黃酮抗亞油酸氧化的抑制作用程度較大，最大抑制率為44.21%。對(duì)于上述四種抗氧化活性評(píng)價(jià)方法，PPA對(duì)這六種類黃酮抗氧化活性的抑制作用強(qiáng)弱順序均為：木犀草素>香葉木素>柚皮素>二氫楊梅素>山奈酚>槲皮素。