微膠囊技術(shù)對(duì)乳酸菌冷凍保存的研究

何智強(qiáng)

本實(shí)驗(yàn)通過向微膠囊制備過程中添加保護(hù)劑脫脂乳粉和海藻糖，以乳酸菌的存活率為考察指標(biāo)，研究保護(hù)劑對(duì)乳酸菌微膠囊冷凍干燥情況下的影響情況。首先考察了不同濃度的單一保護(hù)劑對(duì)微膠囊冷凍干燥后乳酸菌存活率的影響，然后通過正交試驗(yàn)找出了最佳的保護(hù)劑配比，以及能提高乳酸菌在冷凍干燥下的存活率。

實(shí)驗(yàn)方法

乳酸菌的活化。將實(shí)驗(yàn)室保藏的乳酸菌凍干粉接人到11%脫脂乳中的水溶液中，經(jīng)37℃厭氧恒溫培養(yǎng)24h，脫脂乳凝固。用無(wú)菌水稀釋0.1mL凝乳，制得含乳酸菌菌懸液。對(duì)菌懸液進(jìn)行平板劃線分離，37℃厭氧培養(yǎng)24h，這樣連續(xù)傳代2-3次，使其充分活化。

復(fù)凝聚法制備乳酸菌微膠囊方法。（1）原膠液的制備：取明膠，用蒸餾水適量浸泡溶脹后，加熱溶解；取阿拉伯膠水中加熱至80℃左右，輕輕攪拌使溶解；兩溶液均40℃保溫備用。（2）微囊的制備：在40℃水浴條件下，明膠溶液、乳酸菌菌懸液和適量的乳化劑（吐溫-80）混合，輕輕攪拌均勻。5min后向混合液加入阿拉伯膠溶液，繼續(xù)攪拌使明膠和阿拉伯膠溶液充分混合均勻，此時(shí)溶液形成穩(wěn)定的水包油乳液。不斷攪拌下，滴加1%醋酸溶液于混合液中，調(diào)節(jié)pH至3.8～4.0。（3）微囊的固化：在不斷攪拌下，溶液自然冷卻至30℃左右時(shí)，將其置于冰浴中，繼續(xù)攪拌至溫度為10℃以下，加入固化劑，繼續(xù)攪拌15min，再用10%NaOH溶液調(diào)其pH8～9，繼續(xù)攪拌20min，觀察至析出為止，靜置待微囊沉降。（4）微膠囊的收集：將固化后的微膠囊用蒸餾水進(jìn)行洗滌，過篩（320目），收集。

復(fù)凝聚法制備乳酸菌微膠囊的最佳工藝條件。菌膠比例1：6，復(fù)合膠體濃度15%，凝聚pH值3.8，攪拌速度600rpm，反應(yīng)時(shí)間15min，反應(yīng)溫度30℃。在此工藝條件下所制備微膠囊對(duì)乳酸菌的包埋率為92.5%以上，且制備得到微膠囊呈球形好，粘連性低，粒徑分布均勻。

乳酸菌菌落總數(shù)的測(cè)定。（1）以無(wú)菌操作將經(jīng)過充分搖勻的菌液25mL放入含有225mL滅菌生理鹽水的滅菌廣口瓶?jī)?nèi)作成1：10的均勻稀釋液。（2）用1mL滅菌吸管吸取1：10稀釋液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內(nèi)（注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液）。（3）另取1mL滅菌吸管，按上述操作順序，作10倍遞增稀釋液，如此每遞增一次，即換用1支1mL滅菌吸管。（4）選擇2～3個(gè)以上適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時(shí)，即以吸取該稀釋度的吸管移1mL稀釋液于事先滅菌裝有MRS固體培養(yǎng)基的平皿內(nèi)。（5）同時(shí)將1mL滅菌生理鹽水于事先滅菌裝有MRS固體培養(yǎng)基的平皿內(nèi)作空白對(duì)照，以上整個(gè)操作自培養(yǎng)物加入培養(yǎng)皿開始至接種結(jié)束須在20min內(nèi)完成。（6）翻轉(zhuǎn)平板，置37±1℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48±3h取出，選取菌落數(shù)在30～300之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)該皿內(nèi)的乳酸菌數(shù)，然后乘其稀釋倍數(shù)即得每毫升樣品中乳酸菌數(shù)。涂布均勻，每個(gè)稀釋度作三個(gè)平皿。

乳酸菌的存活率。存活率=凍干后微膠囊里活菌數(shù)/凍干前微膠囊里的總活菌數(shù)×100%。凍干前后微膠囊里活菌數(shù)測(cè)定：精確稱取凍干前后的微囊各50mg，置于100mL滅過菌的PBS緩沖液中破碎，于37℃恒溫振蕩24小時(shí)后，冷卻至室溫，過濾，取清液進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)

結(jié)果與分析

保護(hù)劑對(duì)乳酸菌微膠囊冷凍干燥的影響研究。

實(shí)驗(yàn)分兩部分：?jiǎn)我蛩貙?shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)。

脫脂乳粉濃度對(duì)微膠囊冷凍干燥的影響。將脫脂乳粉（0g/L，20g/L，40g/L，60g/L，80g/L）分別加入混合乳液中，制備乳酸菌微膠囊凍干品，以冷凍干燥后的乳酸菌的存活率作為考察指標(biāo)，研究不同濃度的脫脂乳粉對(duì)微膠囊乳酸菌存活率的影響。

對(duì)脫脂乳粉的實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析可知，乳酸菌微膠囊在冷凍干燥后的活菌數(shù)遠(yuǎn)高于對(duì)照組（加入脫脂乳粉為0的實(shí)驗(yàn)組）（P<0.05），這說明，加入脫脂乳粉對(duì)乳酸菌微膠囊凍干保護(hù)效果明顯。當(dāng)脫脂乳粉濃度≤80g/L時(shí)，隨著脫脂乳粉濃度的不斷增加，冷凍干燥后的乳酸菌的存活率也隨之增加。其原因可能是：隨著脫脂乳粉濃度的增加，脫脂乳粉對(duì)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性也斷增加，從而減少了冷凍干燥對(duì)乳酸菌的損傷；脫脂乳份濃度增加使得冷凍干燥過程中的多孔結(jié)構(gòu)增加，使脫水更快；其提供的蛋白質(zhì)和乳糖成分不斷增加，也提高了乳酸菌的存活率。當(dāng)脫脂乳粉的濃度≥80g/L時(shí)，乳酸菌微膠囊在冷凍干燥后的活菌存活率卻略微下降。其可能原因是：當(dāng)脫脂乳粉的濃度增加時(shí)，其粘性也相對(duì)的增加，從而影響了乳酸菌的計(jì)數(shù)。

海藻糖濃度對(duì)微膠囊冷凍干燥的影響。將海藻糖（0g/L，10g/L，20g/L，30g/L，40g/L，50g/L）分別加入混合乳液中，制備乳酸菌微膠囊凍干品，以冷凍干燥后的乳酸菌的存活率作為考察指標(biāo)，研究不同濃度的海藻糖對(duì)微膠囊乳酸菌存活率的影響。

正交試驗(yàn)。在以上單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇各個(gè)因素的合適水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，以冷凍干燥后微膠囊中乳酸菌的存活率為考察指標(biāo)，篩選出保護(hù)劑對(duì)乳酸菌微膠囊冷凍干燥影響的最佳濃度配比。

數(shù)據(jù)通過SPSS12.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVE），并通過LSD法檢驗(yàn)做兩兩比較。以P<0.05為顯著差異。正交實(shí)驗(yàn)通過正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ3.1進(jìn)行設(shè)計(jì)。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)平行對(duì)照。

由上表分析可知：影響乳酸菌微膠囊冷凍干燥菌存活的因素的主次順序是海藻糖含量B>脫脂乳粉含量。單因素方差分析顯示，與對(duì)照組相比，所有添加保護(hù)劑的試驗(yàn)中的存活率都提高顯著（P<0.05）。由表可以看出，保護(hù)劑最佳含量配比為A₂B₂即脫脂乳粉60g/L，海藻糖20g/L，其A2B，所測(cè)得的乳酸菌微膠囊冷凍干燥后的活菌數(shù)為9.93×10¹⁰cfu/g，菌存活率為96.7%，比未添加保護(hù)劑的對(duì)照組提高了近3個(gè)數(shù)量級(jí)，因此通過正交試驗(yàn)優(yōu)化出的冷凍干燥保護(hù)劑組合能顯著提高凍干膠囊的活菌數(shù)。

乳酸菌微膠囊儲(chǔ)存穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。將未微膠囊化乳酸菌（A）、未添加保護(hù)劑乳酸菌微膠囊（B）、添加保護(hù)劑乳酸菌微膠囊（C）、未添加保護(hù)劑凍干乳酸菌微膠囊（D）以及添加保護(hù)劑凍干乳酸菌微膠囊（E）一起置于冰箱中4℃冷藏條件下，測(cè)定微膠囊的存儲(chǔ)穩(wěn)定性。

隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸菌的存活率均成不斷下降趨勢(shì)。單因素方差分析顯示：所有微囊化乳酸菌實(shí)驗(yàn)組在低溫4℃下存儲(chǔ)60天后存活率與未微膠囊化的乳酸菌相比有顯著差異（P<0.05）。未微囊化的乳酸菌隨著儲(chǔ)存天數(shù)的增加，其活菌數(shù)急劇下降，60天后其存活率只有9.7%左右；而其他四組微囊化的乳酸菌的活菌數(shù)卻下降緩慢，60天后其存活率都保持在80%以上，活菌數(shù)仍然維持在10¹⁰cfu/g。微膠囊化能使乳酸菌隔絕外部的氧環(huán)境，使其更好的存活，從而顯著提高了乳酸菌在低溫4℃下儲(chǔ)存活性將微膠囊化的四組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比并單因素方差分析可以看出，添加保護(hù)劑凍干微膠囊和添加保護(hù)劑微膠囊在低溫4℃條件下存儲(chǔ)60天后的活菌數(shù)與未添加保護(hù)劑凍干微囊和未添加保護(hù)劑的微囊存儲(chǔ)60天后的活菌數(shù)比較有顯著差異（P<0.05）。添加保護(hù)劑凍干微膠囊在在低溫4℃條件下存儲(chǔ)60天后的活菌數(shù)下降最慢，其存活率高達(dá)96.1%，活菌數(shù)為9.58×10¹⁰cfu/g。添加保護(hù)劑微膠囊次之，其乳酸菌的存活率仍然高達(dá)93.5%，要比未添加保護(hù)劑凍干微囊和未添加保護(hù)劑的微囊存儲(chǔ)60天后的菌存活率高出10%左右。因此，添加冷凍干燥保護(hù)劑不僅提高了微膠囊冷凍干燥過程中乳酸菌的存活率，而且顯著提高了微膠囊在低溫4℃條件下的存儲(chǔ)穩(wěn)定性。主要原因可能是：乳酸菌在低溫下處于休眠狀態(tài)，其代謝是相對(duì)靜止的：保護(hù)劑的添加有助于提高乳酸菌微囊惡劣環(huán)境的抵抗能力

結(jié)論

以微膠囊冷凍干燥后乳酸菌的存活率為考察指標(biāo)，研究了脫脂乳粉濃度、海藻糖濃度等因素對(duì)微膠囊冷凍干燥的影響，并對(duì)其影響機(jī)理進(jìn)行了分析。然后，在單因素的基礎(chǔ)上，選取兩因素的合適水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，篩選出冷凍干燥后提高乳酸菌存活率的保護(hù)劑最佳濃度配比。

確定了最佳的冷凍干燥保護(hù)劑含量配比：脫脂乳粉60g/L，海藻糖20g/L。在此最佳保護(hù)劑含量配比下，所制備的微膠囊冷凍干燥后乳酸菌存活率為96.7%，活菌數(shù)為9.93×10¹⁰cfu/g，比未添加保護(hù)劑的對(duì)照組提高了近3個(gè)數(shù)量級(jí)。

無(wú)論是單一的保護(hù)劑還是復(fù)合保護(hù)劑都能夠顯著提高乳酸菌微膠囊冷凍干燥后的活菌數(shù)，與未添加保護(hù)劑的對(duì)照組有顯著差異（P<0.05）。

復(fù)合保護(hù)劑與單一保護(hù)劑相比，能提高乳酸菌微膠囊冷凍干燥后的活菌數(shù)。在最佳保護(hù)劑含量配比下，所制備的微膠囊冷凍干燥后活菌數(shù)9.93×10¹⁰cfu/g比添加單一保護(hù)劑海藻糖的微膠囊冷凍干燥后最高乳酸菌活菌數(shù)7.81×10¹⁰cfu/g還要高出1倍多。

不同的保護(hù)劑各有優(yōu)缺點(diǎn)，單一保護(hù)劑不能滿足菌體抵抗外界惡劣的條件。冷凍干燥過程中添加海藻糖和脫脂乳粉兩種不同的保護(hù)劑相互補(bǔ)充，脫脂乳粉可以在細(xì)胞的表面形成一個(gè)穩(wěn)定的保護(hù)層；而海藻糖形成玻璃態(tài)，具有高黏度、較小的自由體積、受限制的分子流動(dòng)性和在貯存中抵抗相分離和結(jié)晶的能力等優(yōu)點(diǎn)，可以使細(xì)胞比通透性降低，從而起到保護(hù)作用。

微膠囊在4℃存儲(chǔ)實(shí)驗(yàn)顯示，所有實(shí)驗(yàn)組隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸菌的存活率均成不斷下降趨勢(shì)。而微膠囊化乳酸菌與原菌液相比能顯著提高乳酸菌的存活率（P<0.05）。隨著存儲(chǔ)時(shí)間的延長(zhǎng)，原菌液細(xì)胞存活率急劇下降，60天后只有9.3%，而微膠囊化實(shí)驗(yàn)組存儲(chǔ)60天后存活率均在80%以上?？梢娢⒛z囊化能顯著提高乳酸菌在4℃下的存儲(chǔ)活性。

在4 oc存儲(chǔ)下，添加保護(hù)劑冷凍干燥后的微膠囊細(xì)胞存活率下降最慢，60天后仍然高達(dá)96.1%，活菌數(shù)為9.58×10¹⁰cfu/g。而未添加保護(hù)劑的微囊細(xì)胞存活率下降最快，只有82.6%?？梢姡砑颖Ｗo(hù)劑能顯著提高微膠囊化乳酸菌在4℃存儲(chǔ)活性。