蘿卜隱性核雄性不育系136A的選育及其育性研究

白靜 段乃彬 謝坤 王俊峰 王效睦

摘要：本研究從自然群體中發(fā)現(xiàn)蘿卜核雄性不育材料136A，通過創(chuàng)制178個(gè)雜交組合，經(jīng)多代雜交，選育出具有50%保持能力的保持系136B。田間遺傳試驗(yàn)結(jié)果表明，136A不育性狀表現(xiàn)穩(wěn)定，呈現(xiàn)出由隱性單基因控制的核不育遺傳特點(diǎn)。細(xì)胞學(xué)觀察顯示該材料花粉敗育徹底，花粉發(fā)育在四分體后開始發(fā)生異常，花粉敗育主要由花粉壁破裂造成。PCR結(jié)果顯示，該材料中不含有Ogura 雄性不育類型的主效基因orf138；線粒體和葉綠體測序結(jié)果也顯示該材料具有正常的可育細(xì)胞質(zhì)。

關(guān)鍵詞：蘿卜；核雄性不育；136A；保持系

中圖分類號(hào)：S631.101文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2016）07-0026-06

蘿卜是典型的異花授粉作物，雜種優(yōu)勢非常明顯，利用雄性不育系進(jìn)行雜交育種可以得到純度高、性狀好的雜交種，且制種過程簡單，成本低[1]。雄性不育根據(jù)不育基因的遺傳方式和在細(xì)胞中的定位分為細(xì)胞核雄性不育和細(xì)胞質(zhì)雄性不育。目前生產(chǎn)上利用最多的蘿卜不育系為Ogura類型的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，它不僅在蘿卜上使用，還被轉(zhuǎn)育到大白菜、小白菜、甘藍(lán)、油菜、菜花等其他十字花科作物中。單一化的雄性不育種質(zhì)導(dǎo)致雜交種綜合性狀難以得到突破性的提高，對(duì)外界有害生物與環(huán)境的抵抗力非常低，存在潛在的生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，如1970年美國大面積種植T型細(xì)胞質(zhì)的玉米雜交種，因玉米小斑病T小種的爆發(fā)流行，導(dǎo)致玉米產(chǎn)業(yè)遭受嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

細(xì)胞核雄性不育 （GMS）由細(xì)胞核不育基因控制，不受細(xì)胞質(zhì)影響，沒有正、反交遺傳效應(yīng)[2，3]。相對(duì)于細(xì)胞質(zhì)雄性不育，核不育系具有育性穩(wěn)定、恢復(fù)源廣的優(yōu)點(diǎn)。核不育現(xiàn)象十分普遍，已在294 種植物和21個(gè)種屬間雜交組合中發(fā)現(xiàn)由細(xì)胞核基因控制的雄性不育類型[2，4，5]。目前，在十字花科植物中，細(xì)胞核雄性不育已經(jīng)被應(yīng)用在油菜、白菜、甘藍(lán)等作物中。

相對(duì)于細(xì)胞質(zhì)雄性不育，核雄性不育的保持系只有50%的保持率，在生產(chǎn)上很難直接利用，但通過不斷發(fā)現(xiàn)新的核不育基因同樣得到了保持率100%的保持系。陳鳳祥等在甘藍(lán)型油菜中發(fā)現(xiàn)一類新的細(xì)胞核雄性不育材料9012A受三對(duì)核基因控制，分別為兩對(duì)隱性重疊不育基因和一對(duì)隱性上位可育基因[6]，并選育出具有100%保持能力的保持系。張書芳等在大白菜中利用核隱性基因和顯性上位基因育出了能夠100%保持的核雄性不育保持系[7]。通過類似的方法，科研工作者先后育成一些品種應(yīng)用于生產(chǎn)[8～12]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，核雄性不育材料具有更廣闊的應(yīng)用前景。美國杜邦先鋒公司發(fā)明了一項(xiàng)雜交種子生產(chǎn)技術(shù)（Seed production technology，SPT），這種新的基因工程手段能夠充分利用隱性核不育突變材料，將花粉育性恢復(fù)基因、花粉致死基因和標(biāo)記篩選基因緊密連鎖并導(dǎo)入核雄性不育突變體中，從而獲得相應(yīng)的保持系，有效解決了隱性核雄性不育系的繁殖難題，同時(shí)該方法還解決了產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因問題，為隱性核不育材料的利用提供了新的模式[13]。

然而，在蘿卜雄性不育系培育中，國內(nèi)尚未有細(xì)胞核雄性不育材料的報(bào)道。本研究利用從自然群體中發(fā)現(xiàn)的蘿卜雄性不育株為供試材料，通過田間育性遺傳統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)證明新發(fā)現(xiàn)的雄性不育材料為由一對(duì)隱性基因控制的核不育材料，填補(bǔ)了蘿卜雄性不育資源中缺乏核不育材料的空白，為蘿卜雄性不育系的培育與研究提供了重要的不育源。通過細(xì)胞學(xué)觀察初步確定花粉敗育時(shí)期及不同類型不育系花粉敗育的差異。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

蘿卜Ogura雄性不育系RS43，蘿卜Ogura雄性不育保持系RS45及50余份國內(nèi)外蘿卜種質(zhì)材料。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1蘿卜核不育系的選育與遺傳學(xué)驗(yàn)證2012年春于自然群體中發(fā)現(xiàn)1株不育株，命名為136A，以同一自然群體中的可育株作父本進(jìn)行雜交，雜交組合31個(gè)；同時(shí)與5個(gè)不同品種的可育株進(jìn)行雜交，雜交組合147個(gè)。每個(gè)組合后代F1及父本自交種子于當(dāng)年秋季種于田間，調(diào)查育性。從中選出可以對(duì)不育材料136A保持的可育株為保持系136B。雄性不育株的標(biāo)準(zhǔn)為，雌蕊發(fā)育正常，雄蕊完全退化或不能形成有效花粉。

將不育材料與保持系的后代多代連續(xù)姐妹交，統(tǒng)計(jì)育性分離情況；將可育株自交，統(tǒng)計(jì)后代育性分離情況。

1.2.2花藥發(fā)育細(xì)胞學(xué)觀察以136A、RS43、136B的50個(gè)花蕾為試驗(yàn)材料。從現(xiàn)蕾期開始選取同一花序上不同發(fā)育時(shí)期的花蕾（從1 mm大小開始，直至開放前的花蕾），每個(gè)花蕾取一枚花藥放于載玻片上，用鑷子將花藥研碎，用濃度為1%的醋酸洋紅染液浸泡花藥進(jìn)行染色，蓋上蓋玻片，于顯微鏡（Leica DM5000 B）下分別觀察3個(gè)材料不同時(shí)期的花藥發(fā)育情況，并拍照。

1.2.3PCR驗(yàn)證利用CTAB法[14]分別提取RS44（即136A）、RS43（具有Ogura細(xì)胞質(zhì)，陽性對(duì)照）、RS45（具有正?？捎?xì)胞質(zhì)，陰性對(duì)照）的全基因組DNA，以O(shè)gura類型主效不育基因orf138的特異引物（ORF-F：5′-TTCAAATCCTGTCCCCGCACC-3′和ORF-R：5′-GCCTTACACCATTGGGATACTTC-3′）對(duì)3個(gè)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳檢測136A中是否含有orf138基因。

1.2.4葉綠體和線粒體測序分別以RS43和RS45為陽性和陰性對(duì)照，對(duì)RS43、RS45和136A 3個(gè)材料進(jìn)行線粒體和葉綠體基因組DNA測序、組裝。

為保證樣品純度，防止出現(xiàn)混雜現(xiàn)象，在提取線粒體和葉綠體DNA過程中，分別從某一單株提取樣品。根據(jù)線粒體和葉綠體DNA的提取方法[15]，提取含有線粒體和葉綠體的混合DNA樣品，進(jìn)行高通量測序。葉綠體測序深度在600倍以上，線粒體測序深度在100倍以上。根據(jù)測序深度的不同，經(jīng)過De novo程序組裝及PCR查補(bǔ)間隙，先組裝葉綠體。De novo組裝的線粒體Contigs先與葉綠體DNA序列進(jìn)行比對(duì)，剔除相同部分，再進(jìn)行線粒體組裝，組裝拼接方法與葉綠體相同，最后再用PCR的方法，將葉綠體與線粒體相同的DNA序列進(jìn)行甄別。

2結(jié)果與分析

2.1蘿卜核不育系與保持系的選育

與136A進(jìn)行雜交的178個(gè)組合中，2012年秋調(diào)查發(fā)現(xiàn)有一個(gè)組合的雜種F1出現(xiàn)1∶1的育性分離，即對(duì)136A不育系具有50%的保持能力，將其命名為136B。136B與136A來自同一自然群體，其他所有組合的雜種一代均表現(xiàn)為可育。將136B自交獲得的50粒種子種于田間觀察育性，結(jié)果為自交后代中有37株可育株，13株不育株，分離比例約為3∶1。將136A與136B雜交一代中的可育株與不育株雜交，收獲種子FA2于來年種植觀察育性分離情況。2013年春 136A與136B雜交后代中的不育株與可育株雜交后代FA2的育性分離比約為1∶1。

將136A與136B的雜交后代連續(xù)6代姐妹交，最終基本形成了純合、穩(wěn)定的蘿卜核不育AB系，選育過程如圖1。

2.2136A基因型的遺傳學(xué)驗(yàn)證

以具有正常細(xì)胞質(zhì)的可育株RS45為母本，以雜交后代中的可育株（FB1）為父本進(jìn)行雜交，其后代BF1全部可育。取20粒BF1種子種植并自交得到BF2，對(duì)20份BF2每份取50粒種子進(jìn)行春化處理后種于溫室中，調(diào)查育性分離情況。其中，11份BF2代種子表現(xiàn)為全部可育，9份BF2代種子出現(xiàn)育性分離，兩者比例約為1∶1。9份出現(xiàn)育性分離的BF2分離情況如表1，合計(jì)可育株330株，不育株108株，分離比例符合3∶1比率，即符合隱性單基因的遺傳規(guī)律。與136B自交試驗(yàn)相比，該試驗(yàn)中BF2的細(xì)胞質(zhì)由136B的細(xì)胞質(zhì)更換為RS45的細(xì)胞質(zhì)，但育性分離結(jié)果一致，表明該材料育性分離情況不受細(xì)胞質(zhì)的影響，同時(shí)驗(yàn)證了該雄性不育為核基因控制的隱性單基因性狀。

2.3136A花粉敗育的生物學(xué)觀察

2.3.1花器官發(fā)育觀察通過觀察開花期不育系136A和保持系136B的50個(gè)花序，選取兩者的典型花序進(jìn)行對(duì)比，如圖2所示。不育系136A與保持系136B的盛花期基本同步，在花器官的大小上，前者比后者明顯要小。

對(duì)136A核不育系的花藥與保持系136B進(jìn)行比較（圖3）發(fā)現(xiàn)，剛開放的花花藥就已萎縮的很小，且花藥干癟，摘取花藥擠壓，無花粉，表明該不育系的花藥退化較為徹底。

2.3.2花粉粒敗育觀察對(duì)136A、136B和RS43的花粉粒發(fā)育情況進(jìn)行觀察（圖4）發(fā)現(xiàn)，花粉敗育的轉(zhuǎn)折點(diǎn)是四分體時(shí)期。在四分體以前，無論是核不育、細(xì)胞質(zhì)不育和正?？捎牧?，花粉發(fā)育都是正常的，三者之間沒有明顯的區(qū)別。在四分體之后，花粉粒的前體游離成單個(gè)個(gè)體，正常植株的花粉開始出現(xiàn)花粉壁不均勻增厚，并逐漸增大，最后形成球狀，且外壁有突起；細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的花粉粒前體在四分體后，很快就停止發(fā)育，并逐漸萎縮，最后形成干癟的花粉粒；核雄性不育系在四分體后，游離出的花粉粒前體也有一個(gè)短暫的花粉壁增長過程，但隨著花粉的發(fā)育，花粉壁表面越來越粗糙，局部會(huì)逐漸變薄，最后破裂，在花蕾開放前，會(huì)剩很少一部分花粉粒，花粉壁粗糙，花粉干癟不飽滿。

花粉發(fā)育的細(xì)胞學(xué)觀察

2.4PCR驗(yàn)證結(jié)果

orf138基因特異引物的目標(biāo)帶型大小為400～500 bp之間，凝膠電泳檢測結(jié)果為僅陽性對(duì)照RS43中擴(kuò)增到orf138基因特異條帶；核不育系136A與陰性對(duì)照RS45中均未出現(xiàn)特異條帶（圖5）。該結(jié)果初步確定核不育材料136A中不含有orf138基因。

1、2、3、4號(hào)樣品為136A；5號(hào)樣品為RS43；

6號(hào)樣品為RS45；M為DL2000。

2.5葉綠體和線粒體測序

以NCBI 公布的蘿卜基因組組裝序列（GCA_000715565.1）及蘿卜的葉綠體、線粒體基因組（KJ716483、AB694744.1）為參考基因組，完成線粒體和葉綠體的測序組裝工作。通過本地Blast，136A（RS44）與RS43及RS45的線粒體基因結(jié)構(gòu)對(duì)比如圖6所示，從上至下順序?yàn)镽S44（即136A）、RS43、RS45。RS44與RS45的線粒體基因組序列完全一致，具有Ogura細(xì)胞質(zhì)的RS43與前兩者差別較大，存在很大的結(jié)構(gòu)變異，出現(xiàn)大量的基因組重排現(xiàn)象。

通過本地Blast，136A（RS44）與RS43及RS45的葉綠體基因結(jié)構(gòu)對(duì)比結(jié)果如圖7所示，從上至下順序?yàn)镽S44（即136A）、RS43、RS45。三個(gè)材料的葉綠體基因組序列基本一致，其中RS44比RS45僅在其鏡像重復(fù)區(qū)內(nèi)多出30個(gè)堿基的重復(fù)，其它完全一致。對(duì)RS44發(fā)生變異的區(qū)域進(jìn)行基因序列和開放閱讀框（ORF）比對(duì)、尋找，結(jié)果顯示，此30個(gè)堿基不在已明確的葉綠體基因或ORF內(nèi)，表明該區(qū)域不存在有功能的基因序列。由此推斷，136A不育材料的不育基因不在細(xì)胞質(zhì)中。

3討論與結(jié)論

本研究通過連續(xù)6代雜交選育與育性調(diào)查、細(xì)胞學(xué)觀察等，明確了136A核雄性不育系的特點(diǎn)。

136A雄性不育材料為核基因控制的隱性單基因雄性不育材料，保持系136B具有50%的保持能力。136A不育系的花器官略小于可育株，雄性育性退化徹底，經(jīng)過多代觀察，其育性不受環(huán)境等因素的影響，表現(xiàn)為雌蕊發(fā)育正常，花藥退化徹底，不能形成具有功能的花粉。

蘿卜核雄性不育與細(xì)胞質(zhì)雄性不育花粉發(fā)育有著明顯的差異。在四分體之后，花粉粒的前體游離成單個(gè)個(gè)體，細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的花粉粒很快就停止發(fā)育，并逐漸萎縮，最后形成干癟的花粉粒；核雄性不育系在四分體后，游離出的花粉粒前體有一個(gè)短暫的花粉壁增長過程，但隨著花粉的發(fā)育，花粉壁表面越來越粗糙，局部會(huì)逐漸變薄，最后破裂，在花蕾開放前，只有很少一部分花粉粒，但花粉壁粗糙，花粉干癟不飽滿。

通過對(duì)136A（RS44）、Ogura不育材料（RS43）、正?？捎牧希≧S45）進(jìn)行線粒體和葉綠體DNA的測序、組裝，結(jié)果表明136A與RS45的線粒體DNA完全一致，具有正常的可育細(xì)胞質(zhì)，不同于Ogura類型的不育細(xì)胞質(zhì)。

新發(fā)現(xiàn)的136A雄性不育材料填補(bǔ)了蘿卜雄性不育資源中缺乏核不育材料的空白，為蘿卜雄性不育系的培育與研究提供了重要的不育源。為加速136A雄性不育系的利用，在下一步工作中我們將利用136AB系多代選育過程中建立的近等基因系，采用圖位克隆與測序相結(jié)合的方法定位和克隆出核雄性不育基因與恢復(fù)基因。針對(duì)核雄性不育系不能獲得100%不育株的問題，我們將利用標(biāo)記基因或?qū)δ撤N藥物敏感基因（如熒光蛋白、水稻苯達(dá)松敏感基因[16]等）與恢復(fù)基因建立連鎖，將連鎖基因轉(zhuǎn)化到136A雄性不育系中建立新的保持系，該保持系雖然也只有50%的保持能力，但在不育系與保持系的混合群體中，可通過標(biāo)記基因或藥物敏感基因表達(dá)，在苗期將具有指示性狀的單株拔除或通過噴撒藥物殺死可育株獲得100%的不育株，使得136A隱性核雄性不育系真正應(yīng)用于生產(chǎn)中。

參考文獻(xiàn)：

[1]馬二磊.蘿卜雄性不育胞質(zhì)類型鑒定與分析[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[2]Kaul M L H. Male sterility in higher plants. Monographs on theoretical and applied genetics 10[M]. New York：Springer-Verlag，1988.

[3]Li Z F， Xia J F， Tang G Y. Types and genetic mechanisms of plant male sterility[J].Journal of Anhui Agricultural Sciences，2008，28（6）：742-746.

[4]Johns C W， Delannay X， Palmer R G， et al. Structural sterility controlled by nuclear mutations in angiosperms[J].The Nucleus，1981，24：97-105.

[5]Okamuro J K， Denb G W， Jofuku K D， et al. Regulation of Arabidopsis flower development[J]. Plant Cell，1993，5：1183-1193.

[6]陳鳳祥，胡寶成，李強(qiáng)生，等. 甘藍(lán)型油菜細(xì)胞核雄性不育材料9012A的發(fā)現(xiàn)與初步研究[J].北京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1993，19（增刊）：57-61.

[7]張書芳，宋兆華，趙雪云.大白菜細(xì)胞核基因互作雄性不育系選育及應(yīng)用模式[J].園藝學(xué)報(bào)， 1990， 17（2）：117-125.

[8]陳鳳祥，胡寶成，李強(qiáng)生，等.甘藍(lán)型油菜隱性上位互作核不育雙低雜交種皖油14的選育[J].中國油料作物學(xué)報(bào)，2003，25（1）：63-65.

[9]陳鳳祥，胡寶成，李強(qiáng)生，等.甘藍(lán)型油菜隱性上位互作核不育雙低雜交種“皖油18”的選育[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，30（4）：535-537.

[10]孫超才，趙華，王偉榮，等.甘藍(lán)型雙低隱性核不育雜交種滬油雜1號(hào)的選育[J].中國油料作物學(xué)報(bào)，2004，26（1）：63-65.

[11]陳大倫，張瑞茂.甘藍(lán)型油菜隱性細(xì)胞核雄性不育系118A的發(fā)現(xiàn)與選育[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（6）：5-7.

[12]李慧，胡勝武，李瑋，等.甘藍(lán)型油菜隱性上位互作核不育系的選育及其細(xì)胞學(xué)研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，38（1）：111-124.

[13]Hondred D， Young J K， Brink K， et al. Plant genomic DNA flanking SPT event and methods for identifying SPT event：US20090210970A1[P]. 2009.

[14]Paterson A H， Brubaker C， Wendel J F， et al. A rapid method for extraction of cotton （Gossypium spp.） genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis[J]. Plant Mol. Biol. Rep.， 1993，11：122-127.

[15]段乃彬，王俊峰，白靜，等.蘿卜葉綠體及線粒體基因組測序與組裝[J].分子植物育種， 2015，13（11）：2429-2436.

[16]Wang S M， Zhu Q S， Wang W L， et al. The application of bentazon susceptible gene on seed production of hybrid rice[J]. Agricultural Science & Technology， 2008，9（1）：99-103，145.