白及種子萌發(fā)及原球莖發(fā)育過程的細(xì)胞組織學(xué)觀察

聶寧 朱艷 田梅 華靜雯 王龍 秦民堅(jiān)

[摘要]為探討白及種子發(fā)育成苗的機(jī)制，對(duì)組織培養(yǎng)條件下種子萌發(fā)過程和原球莖發(fā)育過程進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和石蠟切片細(xì)胞組織學(xué)觀察。結(jié)果表明：白及種子吸水膨脹后，出現(xiàn)極性，遠(yuǎn)離胚柄端分化出綠色芽點(diǎn)，芽點(diǎn)發(fā)育成子葉，同時(shí)種胚突破種皮形成原球莖，另一端則出現(xiàn)成群的白色絨毛狀假根。原球莖頂端分生組織的發(fā)育遵循原套原體學(xué)說，內(nèi)部分化出多束維管束后，白及由原球莖過渡到根狀莖階段。其中根原基的發(fā)育始于根狀莖維管束，為內(nèi)起源。當(dāng)根狀莖逐漸膨大，內(nèi)部基本分生組織分化為成熟薄壁組織后，假鱗莖開始形成。白及種子的發(fā)育共經(jīng)過種胚、原球莖、根狀莖和假鱗莖4個(gè)階段。

[關(guān)鍵詞]白及；原球莖；細(xì)胞組織學(xué)

[Abstract]In order to investigate the mechanism of growth for Bletilla striata， which could be applied for rapid propagation， morphological and cytohistological of seed germination and protocorm development in vitro culture were observed using paraffin section techniques In this study， we have found that the development of B striata goes through four stages： embryo， protocorm， rhizome and pseudobulb The end away from embryo suspensor is able to differentiate green buds after the seed of B striata swelling， growing point At the same time， the other end of embryo grows many white villous roots， with the green bud differentiating into cotyledon， the embryo breaking through seed coat and being protocorm The shoot apical meristem of protocorm consists of tunica， corpus and leaf primordium， whose developmental flowing tunicacorpus theory After more vascular bundle appeared from the leaf primordium， B striata grows into the stage of rhizome While in the stage of rhizome， the root primordium of tissue culture seedlings are differentia initially that derived from rhizome vascular bundle， belonging to internal origin Subsequently， the pseudobulb forms by the inner meristem growing into mature parenchymatous tissue and the rhizome enlargement gradually

[Key words]Bletilla striata； protocorm； cytohistological

doi：10.4268/cjcmm20160813

白及Bletilla striata（ Thunb ） Reichb f 為蘭科白及屬藥用植物，以干燥塊莖入藥，具有收斂止血、消腫生肌的功效，主治咯血、吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂[1]等癥，是我國(guó)民間常用中藥[23]。白及不僅具有較高的藥用價(jià)值，同時(shí)在化妝品行業(yè)[45]和園藝業(yè)前景也很廣闊，具有較高的市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。白及自然繁殖系數(shù)低，生態(tài)環(huán)境破壞以及過度采挖和資源不合理利用，造成了白及資源供需之間的緊張狀況。傳統(tǒng)繁殖方法多采用挖掘野生資源進(jìn)行分株繁殖，但這種繁殖方式周期長(zhǎng)，效率低[6]，難以滿足市場(chǎng)需求。植物組織培養(yǎng)作為白及的一種繁殖方式[7]，解決了白及種子無法正常萌發(fā)而導(dǎo)致繁殖周期較長(zhǎng)、繁殖率低的難題。近年來有關(guān)白及組織培養(yǎng)快速繁殖報(bào)道較多[8]，但有關(guān)白及種子及原球莖發(fā)育的解剖學(xué)研究尚未見報(bào)道。本研究以組織培養(yǎng)為基礎(chǔ)，觀察白及種子不同發(fā)育時(shí)期的內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化，以期為白及快速繁殖機(jī)制研究奠定細(xì)胞組織學(xué)基礎(chǔ)。

1材料

白及果實(shí)采于南京中山植物園，經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院秦民堅(jiān)教授鑒定為蘭科植物白及的成熟蒴果。憑證標(biāo)本存放于中國(guó)藥科大學(xué)中藥資源教研室。

2方法

21種子萌發(fā)

取白及成熟未開裂蒴果，自來水下洗去泥沙灰塵，經(jīng)洗衣粉水浸泡20 min，自來水反復(fù)沖洗，RO水潤(rùn)洗干凈后置于超凈臺(tái)。消毒步驟：75%乙醇浸泡1 min，無菌水潤(rùn)洗2次，NaClO溶液（有效氯≥5%）浸泡10 min，無菌水反復(fù)潤(rùn)洗5次，隨后用無菌濾紙拭干表面水分，解剖刀縱向切開，將種子均勻撒播在備好的萌發(fā)培養(yǎng)基上。

萌發(fā)培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 05 mg·L-1，培養(yǎng)條件：（26±2） ℃；光照度1 500～2 000 lx；光照時(shí)長(zhǎng)11 h·d-1。自播種之日起每隔2 d取樣1次，光學(xué)顯微鏡下觀察種子萌發(fā)形態(tài)變化，同時(shí)樣品用FAA固定液固定，備用。

22原球莖發(fā)育

待種子萌發(fā)至原球莖階段后，即進(jìn)行繼代培養(yǎng)，將原球莖按3～5個(gè)為1叢，每瓶接種8～10叢，培養(yǎng)約60 d后，轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基培養(yǎng)。

培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基（繼代培養(yǎng)），MS+NAA 02 mg·L-1+6BA 20 mg·L-1+土豆汁75 g·L-1（壯苗培養(yǎng)）。培養(yǎng)條件為（26±2） ℃，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，光照時(shí)長(zhǎng)11 h·d-1。待原球莖培養(yǎng)15，30，60 d，以及長(zhǎng)成帶葉小苗分別取樣，F(xiàn)AA固定液固定，備用。

23種子萌發(fā)和原球莖發(fā)育過程中的形態(tài)解剖學(xué)觀察

觀察不同時(shí)期種子萌發(fā)和原球莖發(fā)育結(jié)構(gòu)變化，并以其為材料進(jìn)行常規(guī)石蠟切片法制片，切片機(jī)（820 Histo STAT Reichert）切片，切片厚度8 μm，海氏蘇木精染色，光學(xué)顯微鏡（Nikon Eclipse E200）下觀察。

3結(jié)果與分析

31形態(tài)學(xué)觀察

311種子萌發(fā)形態(tài)學(xué)觀察白及種子細(xì)小，構(gòu)造簡(jiǎn)單，顯微鏡下觀察種胚呈紡錘形，由1層透明的種皮包裹，播種時(shí)種胚呈棕黃色，一端具殘留的胚柄（圖1，A）。2 d后種子吸水膨脹開始變綠，遠(yuǎn)離胚柄的一端漸漸呈凸起狀（圖1，B），此時(shí)白及種子由異養(yǎng)向自養(yǎng)轉(zhuǎn)換[9]。繼續(xù)培養(yǎng)，6 d后種胚發(fā)育生長(zhǎng)開始撐破一端的種皮，進(jìn)入原球莖階段（圖1，C）。培養(yǎng)基上觀察可發(fā)現(xiàn)，與種胚凸起相對(duì)的一端出現(xiàn)白色絨毛狀“假根”[10]，猜測(cè)為種子吸收營(yíng)養(yǎng)成分的結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)10 d后種子迅速萌發(fā)，完全突破種皮，頂端已經(jīng)有了葉原基的分化（圖1，D），接著4 d后，種子分化出子葉（圖1，E），形成小苗。培養(yǎng)20 d，白及開始長(zhǎng)出幼葉（圖1，F(xiàn)）。該萌發(fā)動(dòng)態(tài)過程與王楷[11]、張燕[12]等研究一致。

312原球莖發(fā)育形態(tài)學(xué)觀察當(dāng)原球莖轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基15 d后，植株基部長(zhǎng)出大量毛狀根，有的已經(jīng)形成明顯的不定根，同一瓶中生長(zhǎng)狀態(tài)并不統(tǒng)一，發(fā)育較快的小苗甚至已分化出第3片小葉。繼續(xù)培養(yǎng)，組培苗不斷生長(zhǎng)，葉片舒展，植株增高，基部由最初的球形原球莖轉(zhuǎn)變?yōu)殚L(zhǎng)條狀的根狀莖結(jié)構(gòu)，此時(shí)根部正在大量吸收養(yǎng)分以滿足植株迅速發(fā)育。待小苗長(zhǎng)至1～15 cm 時(shí)轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基中，小苗莖、葉的長(zhǎng)勢(shì)漸緩，但根狀莖明顯變粗，呈球形，進(jìn)入假鱗莖階段；在激素的作用下，假鱗莖基部分化出不定根，更有利于吸收營(yíng)養(yǎng)。

32細(xì)胞組織學(xué)觀察

321種子萌發(fā)的細(xì)胞組織學(xué)觀察白及種胚表面為1層體積小，排列緊密的細(xì)胞，中間細(xì)胞體積

較大，內(nèi)含物較多（圖2，A），培養(yǎng)2 d后，一端出現(xiàn)極性，開始分化出較多體積小，質(zhì)濃，核大的細(xì)胞，隨著培養(yǎng)時(shí)間變長(zhǎng)，這部分的細(xì)胞不斷增殖分化逐漸凸起，向種皮合點(diǎn)端突破，形成原球莖。原球莖頂端的原分生組織進(jìn)一步分化出葉原基，形成子葉（圖2，B）。原球莖繼續(xù)發(fā)育，頂端分生組織在不斷分化出葉原基的同時(shí)，向內(nèi)逐漸分化出一束維管束，表皮始終為一層細(xì)胞：排列緊密，細(xì)胞體積小，細(xì)胞核大，居于中央。顯微下觀察發(fā)現(xiàn)維管束周圍圍繞著一團(tuán)分生組織細(xì)胞，不斷分化出維管組織細(xì)胞（圖2，C），使得維管束不斷向基部延伸，最終起到連接根和葉的作用。

322原球莖發(fā)育細(xì)胞組織學(xué)觀察原球莖培養(yǎng)30 d的縱切面最大剖面頂端分生組織結(jié)構(gòu)圖（圖2，D），原球莖頂端分生組織的發(fā)育遵循原套原體學(xué)說[1314]。圖2中所示A，B分別為原套和原體，在其以下部位為葉原基。莖頂端的分生區(qū)細(xì)胞向外分化成幼葉的同時(shí)，向內(nèi)形成維管束。當(dāng)維管束由一束分化成多束時(shí)，白及由原球莖階段進(jìn)入根狀莖階段。隨著幼葉的發(fā)育，基部的分生組織分化為居間分生組織，其結(jié)果是使葉片不斷伸長(zhǎng)變寬；維管束周圍包裹著一團(tuán)細(xì)胞核較大、體積較小、排列緊密的分裂細(xì)胞，共同構(gòu)成原形成層。原形成層細(xì)胞代謝活動(dòng)旺盛，分裂能力強(qiáng)，同時(shí)也在不斷分化出維管束細(xì)胞和薄壁細(xì)胞（圖2，E），向與頂端分生組織相對(duì)的基部延伸。根狀莖階段，內(nèi)部組織出現(xiàn)大量核大，液泡小的細(xì)胞，越靠近頂端分生區(qū)的細(xì)胞體積越小，排列越緊密，為基本分生組織細(xì)胞，來源于初生分生組織結(jié)構(gòu)，其分裂衍生的細(xì)胞可促進(jìn)根狀莖擴(kuò)大。繼續(xù)培養(yǎng)，根狀莖基部開始分化出不定根，白及的不定根起源于由頂端延伸至基部的維管束鞘結(jié)構(gòu)，屬于內(nèi)

LP葉原基； EP表皮； SAM 頂端分生組織； VB 維管束； RhVB 根狀莖維管束； RVB 根維管束； Sc 厚壁組織； En內(nèi)皮層； Pe 中柱鞘； PX初生木質(zhì)部； PP 初生韌皮部；A種胚縱剖面顯微圖； B 種子萌發(fā)10 d縱剖面顯微圖； C 種子萌發(fā)16 d縱剖面顯微圖； D 培養(yǎng)30 d 原球莖縱剖面顯微圖； E 具維管束的根狀莖縱剖面顯微圖； F 根維管束開始出現(xiàn)； G 成熟不定根橫切面顯微圖； H 根狀莖縱剖面顯微圖； I 假鱗莖開始形成； J 假鱗莖縱剖面顯微圖。

圖2白及種子萌發(fā)及原球莖發(fā)育顯微解剖

Fig2Microscopic anatomy of seed germination and protocorm development

起源[15]。維管束鞘中的一部分細(xì)胞經(jīng)脫分化，恢復(fù)分裂能力，細(xì)胞質(zhì)變濃、核變大、液泡縮小，形成根原基細(xì)胞。根原基不斷分化、伸長(zhǎng)，從而形成不定根（圖2，F(xiàn)）。在繼代培養(yǎng)基中，白及發(fā)育迅速，根狀莖頂端不斷分化出幼葉，每一片幼葉基部向外分裂增生，使葉片伸長(zhǎng)，向內(nèi)分裂分化成維管組織，最終與基部的不定根連接。隨著不定根的生長(zhǎng)，最早形成的子葉逐漸脫落，與其相連的薄壁組織也漸漸退化（圖2，H）。將小苗轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基后，根狀莖基部漸漸膨大，基本分生組織分化為液泡較大的薄壁組織，開始積累養(yǎng)分，假鱗莖初始形成。在激素的作用下，假鱗莖葉腋處開始分化出多個(gè)芽原基（圖2，I），為不定芽的起點(diǎn)，不定芽不斷發(fā)育生長(zhǎng)，最終形成完整小苗，基部生成不定根，與母體剝離。而此時(shí)母體發(fā)育的速度漸漸放緩，假鱗莖逐漸增粗，內(nèi)部形成大量的薄壁細(xì)胞（圖2，J），根部組織也已發(fā)育成熟（圖2，G）。

4討論

白及由種子發(fā)育為完整植株大致經(jīng)過4個(gè)階段：種胚、原球莖、根狀莖、假鱗莖。

41種胚原球莖的轉(zhuǎn)化

白及種子不含胚乳，在解剖鏡下分離開種皮后，為1個(gè)橢球形的種胚，縱切面和橫切面觀察發(fā)現(xiàn)無胚根、胚軸和胚芽的分化，僅由1層排列緊密的表皮細(xì)胞包裹著內(nèi)含物較多的薄壁細(xì)胞。白及幼葉起源于種胚具有極性一端的分生組織的外部細(xì)胞，屬于外起源[14]，白及種子萌發(fā)時(shí)不形成胚根，而是先膨脹變綠[12]，待種胚發(fā)育為原球莖后，其基部通過表皮細(xì)胞的凸起產(chǎn)生大量白色絨毛狀“假根”，來吸收培養(yǎng)基上的水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。所謂原球莖是蘭科種子萌發(fā)過程中的一種形態(tài)學(xué)構(gòu)造，種子萌發(fā)初期，經(jīng)吸水膨脹，突破種皮形成的球形或橢球形的結(jié)構(gòu)[16]，白及種子萌發(fā)大約8～10 d即可形成原球莖。原球莖代謝活動(dòng)旺盛，遺傳性狀穩(wěn)定[16]，利用原球莖進(jìn)行繼代培養(yǎng)可迅速獲得增殖小苗，是白及快繁技術(shù)的關(guān)鍵。

42原球莖根狀莖假鱗莖的轉(zhuǎn)化

白及發(fā)育過程大致遵循蘭科基本發(fā)育規(guī)律。原球莖分化出多束維管束，進(jìn)入根狀莖階段。根狀莖維管束為外韌型維管束，無束中形成層，其生長(zhǎng)發(fā)育過程中，維管束數(shù)目不斷增多，為典型的單子葉植物初生構(gòu)造。隨著維管束組織的成熟，根狀莖不再伸長(zhǎng)，而慢慢膨大，基本分生組織分化為成熟的薄壁組織，為貯存養(yǎng)分主要器官[10]。在白及由原球莖發(fā)育為假鱗莖的過程中，養(yǎng)分的積累量也發(fā)生著變化，其中原球莖和假鱗莖由于細(xì)胞不斷分裂分化，薄壁細(xì)胞中貯存了大量的養(yǎng)分，而根狀莖則因?yàn)椴粩嗟陌l(fā)育生長(zhǎng)，薄壁組織不成熟而養(yǎng)分較少[17]。

實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，組織培養(yǎng)條件下不定芽的分化與室外栽培條件下的分化略有不同，白及種子經(jīng)過組織培養(yǎng)，大致4～5個(gè)月即可形成球形假鱗莖，通過外加激素的作用，假鱗莖可分化出多個(gè)不定芽，而此時(shí)母體也在不斷生長(zhǎng)。這些不定芽在發(fā)育成完整小苗時(shí)，基部會(huì)分化出不定根，從而與母體形成徹底的生理隔離。而在室外栽培條件下，成熟白及只有在當(dāng)年地上部分枯萎后，其地下假鱗莖才會(huì)萌發(fā)出不定芽，且此時(shí)假鱗莖具有明顯分叉。

43有關(guān)白及種子發(fā)育途徑的討論

作者在進(jìn)行種胚發(fā)育進(jìn)程實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)種子在不含激素和含激素NAA（05～10 mg·L-1）培養(yǎng)基上，種子萌發(fā)成苗的形態(tài)有較大的不同。當(dāng)僅在1/2MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，小苗（子葉分化完全）基部膨大的球體呈綠色；而當(dāng)培養(yǎng)基中添加NAA（05～10 mg·L-1）時(shí)，膨大小球體為白色透明狀，該小球體在發(fā)育過程中也會(huì)不斷產(chǎn)生白色絨毛狀“假根”。張燕[18]、崔瑞勤[19]等研究認(rèn)為白及萌發(fā)可經(jīng)過原球莖和根狀莖2個(gè)途徑發(fā)育成苗，不同的培養(yǎng)基上發(fā)育途徑可能不一致。細(xì)胞組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，根狀莖的形成建立于內(nèi)部維管束組織的分化[1617]，但胚性細(xì)胞團(tuán)是否可直接分化形成維管束還有待進(jìn)一步的研究。

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[責(zé)任編輯呂冬梅]